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1、PBMC分別培養(yǎng)和辦理步驟PBMC分別培養(yǎng)和辦理步驟3/3PBMC分別培養(yǎng)和辦理步驟劉鳳君實驗步驟1.采血：抽取初治(初始抗病毒治療）從前CHB、CHC患者外周靜脈血6ml，注入肝素抗凝管中，輕輕搖勻。2.稀釋：室溫下加入等體積的PBS，輕輕吹打混勻。3.加樣：取50ml離心管，吸取6mlFicoll（淋巴細(xì)胞分別液）于離心管中，（Ficoll與稀釋前血液的體積比為1:1），管傾斜45，將稀釋后的血液在Ficoll液面上方約1cm處沿管壁緩慢加至Ficoll上面。4.離心：18-20,2000rpm，30min，離心后從管底至液面分四層，依次為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層、分層液層、單個核細(xì)胞層、血漿層。

2、5.回收：將移液管直接插入云霧層（也許先吸去上層的血漿），輕輕吸出云霧層，放入新的離心管中。6.沖洗：加入最少于18-20,2000rpmPBMC，10min（外周血單個核細(xì)胞），兩次。體積3倍的PBS，7.細(xì)胞計數(shù)：棄上清，加1mlRPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清），吹打混勻，制備成PBMC細(xì)胞懸液。專用儀器測定：吸取必然量的PBMC細(xì)胞懸液于EP管中，取等量2%臺盼藍(lán)，吹打混勻后吸取1滴進行細(xì)胞濃度測定。血細(xì)胞計數(shù)板：取一滴PBMC懸液與一滴2%臺盼藍(lán)染液混勻后加于血細(xì)胞計數(shù)板中，在顯微鏡下計數(shù)4大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml=4個大方格細(xì)胞總數(shù)/41042（稀釋倍數(shù)）8.細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2105/ml培養(yǎng)基，加于6孔板或24孔板中進行培養(yǎng)。（我們平時是培養(yǎng)過夜后再進行下一步辦理）。9.攪亂素辦理：加入500IU/ml（培養(yǎng)基的終濃度）的-IFN（攪亂素），同時設(shè)比較組，時間為8小時。（家族性乙肝、丙肝患者中嚴(yán)禁備抗病毒治療者省去攪亂素辦理的步驟。10.細(xì)胞收集：將6孔板或24孔板中的培養(yǎng)基吸出棄掉，每孔加200ulTrizol，用移液槍將孔壁吹打數(shù)次

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