細(xì)菌染色技術(shù)1課件

1、細(xì)菌染色技術(shù)基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（三）目的要求學(xué)習(xí)微生物涂片，染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的染色法。初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征。鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術(shù)。微生物染色的染料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的有機(jī)化合物。染料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類。在微生物染色中，堿性染料較常用，如常用的美藍(lán)（即亞甲藍(lán)）、結(jié)晶紫、堿性紫復(fù)紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于堿性染料。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷；而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷；帶正電荷的堿性染料染色部分很容易與帶負(fù)電荷細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合使細(xì)菌染色。微生物染色原理材 料菌種 染色劑儀器或其他用具：顯微鏡

2、酒精燈載玻片接種環(huán)香柏油酒精+乙醚擦鏡紙生理鹽水等。革蘭氏染色菌種:參考菌：G+：Staphylococcus aureus, G-: Escherichia coli 儀器 顯微鏡；材料 載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。染料 草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番紅染色液；革藍(lán)氏陽性和陰性菌細(xì)胞壁成分比較成分 占細(xì)胞壁干重的% 革藍(lán)氏陽性菌 革藍(lán)氏陰性菌肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（10）磷壁酸 含量較高（50） 無類脂質(zhì) 一般無（ 2） 含量較高（20）蛋白質(zhì) 無 含量較高微生物分類鑒定的特征形態(tài)學(xué)和生理生化特征血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和噬菌體

3、分型氨基酸序列和蛋白質(zhì)分析核酸堿基組成和序列分析形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)特征、菌落的形狀、大小、顏色、表面特征、光澤等細(xì)胞形態(tài)：形狀、大小、排列方式特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛、芽孢、孢子、莢膜等細(xì)胞內(nèi)涵物染色反應(yīng)：革藍(lán)氏染色、抗酸性染色運(yùn)動(dòng)性方法涂片初染媒染脫色復(fù)染鏡檢初染 將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結(jié)晶紫染色液(加量以蓋滿菌膜為度)，染色1-2min。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。脫色 滴加95%乙醇，脫色20-25s立即水洗，以終止脫色。復(fù)染 滴加蕃紅，染色2-3min，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌(G)；

4、被染成紅色者是革蘭氏陰性菌(G-)。 革蘭氏陽性菌作業(yè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、涂片取一塊干凈的載玻片平放在載玻片架上，在載玻片中央滴一滴生理鹽水（或蒸餾水）；無菌操作從試管中生長有瓊脂斜面上挑取少許菌苔；將挑取的菌苔沾入載玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。2、干燥將涂好菌膜的載玻片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥。3、固定手持已經(jīng)自然干燥的涂好菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過23次，熱固定細(xì)菌細(xì)胞。原理：加熱使細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固、使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)凝固，從而固定細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。注意：熱固定溫度不宜過高，否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。4、染色將熱固定的細(xì)菌涂片平放于在載玻片架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。染色時(shí)間：呂氏堿性美藍(lán)染色12min；石炭酸復(fù)紅染色約1min草酸銨結(jié)晶紫染色約1min。6、干燥自然干燥：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥；吹干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在載玻片架上，用電吹風(fēng)冷風(fēng)或低溫?zé)犸L(fēng)吹干；吸干：將染好色的細(xì)菌涂片平放在一張吸水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細(xì)菌涂片兩面水分吸干。7、鏡檢涂片干后鏡檢。注意：涂片必須完全干燥后