液相色譜實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

1、液相色譜基礎(chǔ)本章內(nèi)容：液相色譜發(fā)展史液相色譜的基本概念影響峰形擴(kuò)展的因素1歷史回顧1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)碳酸鈣吸附劑石油醚1940s - 分配色譜和紙色譜1950s - 氣相, 薄層，凝膠過(guò)濾色譜 梯度洗脫色譜1960s - 商業(yè)高效液相色譜.0NNNNMgCHCH23CH3CH3H C30CH3CH3CH30CH3002高效液相色譜 (HPLC)進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑泵混合器HPLC 結(jié)構(gòu)框圖HPLC 結(jié)構(gòu)框圖3液相色譜類型Types of CompoundsSeparatedNeutralsWeak AcidsWeak

2、 BasesIonics, Bases, AcidsCompounds Insoluble inWater, Organic IsomersIonicsInorganic IonsHigh MW CompoundsPolymersModeReversed-PhaseIo子n-PairNormal-PhaseIon ExchangeSize ExclusionStationary PhaseC-18, C-8,C-18, C-8Silica, Amino, CyanoDiolAnion or Cation Exchange PolystyreneMobile PhaseWater/Organic

3、ModifiersWater/OrganicIon-Pair ReagentOrganicsAqueous/BufferCounter IonGel Filtration-AqueousGel Permeation-OrganicSilicaResinC-4, C-2化合物類型模式固定相流動(dòng)相中性弱酸弱堿反相C18, C8, C4氰基, 氨基水/有機(jī)改性劑離子、堿性、酸性離對(duì)C-18, C-8水/有機(jī)的離子對(duì)試劑不溶于水的化合物正相硅膠、氨基、腈基、二醇有機(jī)物離子型無(wú)機(jī)離子離子交換陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂水/緩沖溶液對(duì)離子高分子量化合物聚合物體積排阻聚苯乙烯硅膠凝膠過(guò)濾 - 水性的 凝膠滲透 -

4、 有機(jī)的4色譜參數(shù)Detector ResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)t = 保留時(shí)間 t = 死時(shí)間R W = 峰底寬度0 定性和定量tR(B) - tR(A)WA + WBR = 2tR(B) - tR(A)W1/2A + W1/2B = 1.176K=tR-t0t05不同R值的峰重疊R=1.5可以得到基線分離0.40.50.60.70.81.001.256影響R值的因素tW=R =1/4Nx- 1xk1 + k容量因子選擇性柱效7容量因子各組份的容量因子（K）隨溶劑洗脫強(qiáng)度的變化增大或縮小增加流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，降低了洗脫物的容量因子對(duì)于反相色譜，增加

5、10的有機(jī)組成等于降低每個(gè)色譜峰的K值的1/2 到2/3。溶劑洗脫強(qiáng)度弱溶劑洗脫強(qiáng)度強(qiáng)246810110070030010060% AcetonitrileTime (min.)mAU20001600600080% AcetonitrileTime (min.)mAU100040% Water20% Water2468108分離選擇性改用不同的流動(dòng)相改變流動(dòng)相的組成改變流動(dòng)相pH值改變柱溫應(yīng)用特殊的化學(xué)效應(yīng)改變固定相()改變分離選擇性的方法t 0 = 1 =kkBAAB23AB12AB12=1.641.58=1.04=1.150.85=1.35=0.950.63=1.50kkBA9溫度對(duì)分離選

6、擇性的影響40 601005Time in Minutes10柱效Detector ResponseInjectTime高柱效低柱效11擴(kuò)散h = A + C uBu.HETP BuC.uA線速度A = 渦流擴(kuò)散B = 自由分子擴(kuò)散C = 傳質(zhì)阻力范德姆特方程 The Van Deemter Equation+12AA = 渦流擴(kuò)散多徑擴(kuò)散仔細(xì)填充柱子使用均一的載體線 速 度HETP擴(kuò)散初始帶寬最終帶寬13擴(kuò)散BB = 自由分子擴(kuò)散縱向擴(kuò)散在液相中影響小在低流速中影響大線速度HETP14擴(kuò)散C.uC = 傳質(zhì)阻力在低流速下可以降低傳質(zhì)阻力使用小顆粒載體可以降低傳質(zhì)阻力HETP線速度滯流的流動(dòng)相

7、流動(dòng)相固定相15柱外效應(yīng)樣品體積 I.連接管路的體積色譜柱進(jìn)口設(shè)計(jì)色譜柱出口設(shè)計(jì)檢測(cè)池體積 ( 10 L )II.III.IV.V.降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間VI.16如何提高分離度通過(guò)下述方法增加保留時(shí)間:選擇合適的分離參數(shù)增加色譜柱長(zhǎng)度增加固定相濃度通過(guò)下述方法降低譜帶寬度:使用均一的載體仔細(xì)填充柱子選擇粒度小的載體優(yōu)化流速減小進(jìn)樣量降低系統(tǒng)死體積降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間17HPLC 儀器簡(jiǎn)介本章內(nèi)容：流動(dòng)相及貯液罐 高壓輸液泵及梯度洗脫裝置進(jìn)樣裝置色譜柱檢測(cè)器色譜數(shù)據(jù)處理裝置18優(yōu)化流路減小死體積流路自上而下堆積配置手持控制器檢測(cè)器 柱溫箱自動(dòng)進(jìn)樣器泵脫氣機(jī) 溶劑柜19HP-IB外設(shè)(x4)每個(gè)部

8、分有獨(dú)立的電源1100各部件均由CAN線連接檢測(cè)器與化學(xué)工作站之間用 LAN線連接 (或用HP-IB連接)脫氣機(jī)與泵之間用遙控線連接 (錯(cuò)誤信號(hào)輸出)BCD板用于外設(shè)和讀取樣品瓶數(shù)量連線20指示燈狀態(tài)Off (power off)Ready (power on)Not ReadyRunErrorResidentBlink儀器LED狀態(tài)顯示電源開(kāi)關(guān)顯示BlackBlackYellowGreenRedYellow blinking6種LED儀器狀態(tài)：21Agilent 1100 泵和在線脫氣機(jī)Agilent 1100系列泵,G1310A, G1311A, G1312A, G1354A和Agilen

9、t 1100 系列在線真空脫氣裝 置(G1322A)22Agilent 1100系列真空脫氣機(jī)建議 .低壓混合進(jìn)行梯度洗脫，提高泵的可靠性能。提高泵在低流速下的操作性能用于需要脫氧的檢測(cè)器性能 /用途與He脫氣相比，更方便，更節(jié)省費(fèi)用。高性能脫氣，避免了煩瑣的操作，提高儀器穩(wěn)定性。 內(nèi)部延遲體積小，便于快速進(jìn)行溶劑切換。4通路系統(tǒng)，操作靈活。與1100其它組件堆積在一起，用遙控線連接，用于傳輸錯(cuò)誤信號(hào)。23在線真空脫氣機(jī)工作原理1 mlSolenoid valve24HP 1100 Series On-line Degasser: Influence on Detector Baselinen

10、o degassinghelium degassingHP on-line degassingAbsorbency123456789Time (min)Solvent: methanol; UV signal: 210 nm25溶劑傳輸系統(tǒng)往復(fù)活塞泵(單向閥)Gold SealSapphireInsertRuby BallSpringInsert26泵頭 - 單元/四元泵Lock ScrewPump head screws27Agilent 1100系列四元泵G1354A; 真空脫氣機(jī)為標(biāo)準(zhǔn)配置!建議 .使用2，4，8mm內(nèi)徑的柱子流量范圍從 0.2 到 10 ml/min應(yīng)用于研究和常規(guī)分析

11、特征/優(yōu)點(diǎn)四通路/低壓混合能靈活地進(jìn)行恒梯度或梯度洗脫。無(wú)需消耗昂貴的He而能進(jìn)行高性能真空脫氣。自動(dòng)沖程調(diào)節(jié)，混合非常均勻，降低基線噪音。對(duì)于高鹽流動(dòng)相，可選擇Seal Wash清洗密封墊。28Agilent 1100系列四元泵G1354A包括真空脫氣機(jī)溶劑柜真空脫氣機(jī) G1322A四元泵 G1311A29四元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperPurge ValveWasteto injection devicefrom solve

12、ntbottlesMCGV 比例閥AIV 主動(dòng)閥OBV 單向閥Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperWastefrom solventbottles30ToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFrom PumpTo Waste手動(dòng)進(jìn)樣器六通閥31六通閥之扎針123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空INJECT32六通閥之裝樣123456泵

13、色譜柱定量環(huán)廢液排空INJECTLOAD33123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空六通閥之進(jìn)樣INJECTLOAD34123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空六通閥之小刻度進(jìn)樣一INJECTLOAD35手動(dòng)閥流路連接樣品回路廢液排空管樣品回路到色譜柱來(lái)自泵出口36手動(dòng)進(jìn)樣器前視圖后視圖樣品定量管37固定相結(jié)構(gòu)本章內(nèi)容：固定相載體結(jié)構(gòu)正相色譜固定相鍵合相色譜固定相38Typical ColumnSiSiSiSiSiPacking SupportsChemically ModifiedSilica GelOHSiOSiOHOOSiOHOSiOOSiOHPoresSilica GelSurface3CHCH3

14、Si - O - Si - (CH2)17CH339正相 HPLC極性固定相有機(jī)流動(dòng)相傳統(tǒng)目前硅膠氧化鋁氰基二醇基氨基吸附色譜鍵合相適用于:同分異構(gòu)體的分離.在有機(jī)/水流動(dòng)相中不溶化合物的分離.適用于中等極性化合物分離.40硅膠柱和氧化鋁柱的缺點(diǎn)容易脫尾樣品被催化分解不易梯度洗脫含水量要控制41正相色譜鍵合相OSiCH3CyanoOSiCH2()nNH2CH2DiolAmineCNSiCHOHCHCHOOH22CH3(CH )2nSiCH3CH3SiSiCH3CH342Particles of ColumnPackings50mLarge PorousParticles30mPellicula

15、rBeads3-10mMicroparticulates2m Active Surface43鍵合相柱優(yōu)點(diǎn)固定相不易被流動(dòng)相洗脫無(wú)需飽和色譜柱非常容易進(jìn)行梯度洗脫柱子平衡非?？焓褂脴O性范圍寬選擇性唯一柱容量大溶質(zhì)不易污染柱子44Agilent 1100 柱溫箱TCC45柱溫箱的特征及優(yōu)點(diǎn)推薦 .溫度控制范圍： 低于室溫1080保留時(shí)間的再現(xiàn)性需要穩(wěn)定 的溫度如果需要在高于或低于室溫 進(jìn)行分離操作時(shí)，需要使用 柱溫箱特征/優(yōu)點(diǎn)大空間，可以容納三根30cm長(zhǎng)色譜柱更換柱子非常方便降溫非常方便安裝柱識(shí)別可以記錄進(jìn)樣次數(shù)使用切換閥可以進(jìn)行柱切換(可選)兩個(gè)單獨(dú)的加熱區(qū)可以分別控制溫度可以進(jìn)行程序升溫內(nèi)

16、部死體積小(左側(cè)3L，右側(cè)6L)46Agilent 1100 二極管陣列檢測(cè)器推薦 . 研究及方法開(kāi)發(fā) 多波長(zhǎng)檢測(cè) 峰純度檢查 峰確認(rèn)（定性） 性能/優(yōu)點(diǎn).靈敏度高 (1x10-5AU)。 兩個(gè)燈，波長(zhǎng)檢測(cè)范圍寬（190950 nm）。1024個(gè)二極管 和 1 nm 狹縫 。可變狹縫。根據(jù)不同需要選擇流動(dòng)池?？梢赃M(jìn)行自動(dòng)峰檢索 。利用紫外譜圖進(jìn)行峰確認(rèn)47Front Elements - DAD 進(jìn)口管可以直接連接到色譜柱出口氘燈流通池室 鎢燈48DAD光路鎢燈耦合透鏡氘燈光源透鏡(消色差透鏡)氧化鈥濾光片支撐透鏡Flow cell光譜透鏡光柵陣列狹縫49檢測(cè)器使用統(tǒng)計(jì)43.0%22.0%10

17、.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractive IndexElectrochemicalConductivityMass specOthers50定性分析-探索三維立體影像 Spectral Acquisition ModesAll spectraEvery 2nd spectrumAll in peakApex+Slopes+BaselinesApex+BaselinesNoneAbsorbanceTime Wavelength 51DAD測(cè)試功能及診斷DAD自檢暗電流測(cè)試燈強(qiáng)度測(cè)試鈥玻璃測(cè)試流通池測(cè)試濾光片測(cè)試波長(zhǎng)校正模擬信號(hào)輸

18、出測(cè)試52色譜數(shù)據(jù)處理裝置1.計(jì)算機(jī)2.色譜工作站53溶劑準(zhǔn)備：過(guò)濾使用HPLC純?nèi)軇┻^(guò)濾裝置真空使用小于 0.5m過(guò)濾膜.有機(jī)物 - Teflon 水 - Nylon 66防止固體顆粒損傷儀器或柱頭日常維護(hù)54溶劑準(zhǔn)備 不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長(zhǎng)菌的溶劑會(huì)阻塞溶劑過(guò)濾器，降低泵的操作性能。 遵從下列建議可以提高性能，延長(zhǎng)溶劑過(guò)濾器的壽命：使用無(wú)菌溶劑瓶避免溶劑長(zhǎng)菌。用濾膜過(guò)濾溶劑去除微生物。每?jī)商旄鼡Q或過(guò)濾溶劑。避免溶劑瓶直接日照。55溶劑脫氣目的排除溶解在流動(dòng)相中的氧氣和氮?dú)饷摎夥椒℉e脫氣真空脫氣回流加熱脫氣超聲脫氣56溶劑信息避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。高濃度的無(wú)機(jī)酸例如：硝酸和硫酸。能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。含有過(guò)氧化物的色譜級(jí)醚必須用氧化鋁干燥劑。在有機(jī)溶劑中的有機(jī)酸溶液。含有強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液。四氯化碳和異丙醇或THF混合液。57初始化HPLC泵移走溶劑與系統(tǒng)中的氣泡使溶劑組成變化更容易 初始化和平衡確保分析結(jié)果再現(xiàn)性對(duì)于反相柱使用510倍柱體積流動(dòng)相平衡色譜柱柱平衡58預(yù)柱和保護(hù)柱從泵來(lái)的流動(dòng)相預(yù)柱進(jìn)樣口保護(hù)柱分析柱至檢測(cè)器預(yù)柱是針對(duì)流動(dòng)相來(lái)保護(hù)色譜柱保