細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)習(xí)題

1、名稱解釋細(xì)胞培養(yǎng)（動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)）：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指將動(dòng)物活體體內(nèi)取出的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單細(xì)胞懸液，然后放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)與功能的方法。組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出活的組織（多只組織塊）在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。有時(shí)泛指所有的體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)：是將活體內(nèi)的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進(jìn)行培養(yǎng)的方法。合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的、配方恒定的培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子（生長(zhǎng)因子和激素、結(jié)合蛋白等）組成。完全培養(yǎng)基：在合成培養(yǎng)基里添加血清后的培養(yǎng)基。

2、接觸抑制：體外培養(yǎng)的細(xì)胞在貼附底物上連接成片、相互接觸后失去運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。無(wú)限細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無(wú)限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。去分化（脫分化）：細(xì)胞在體外不可逆地失去原有特性。注意：去分化不意味分化能力完全喪失！在適當(dāng)調(diào)節(jié)信號(hào)刺激下仍能表現(xiàn)出分化特性。但分化能力會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸喪失。不適應(yīng)：各種分化細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)逐漸失去各自的形態(tài)與功能特征，表現(xiàn)出某種趨同性。原因：培養(yǎng)條件變化使分化發(fā)生阻抑細(xì)胞分裂指數(shù)（MI）：是指細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)量細(xì)胞群體倍增時(shí)間：是指培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的

3、時(shí)間。原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。1）體外培養(yǎng)細(xì)胞，其生長(zhǎng)方式主要有貼壁生長(zhǎng)和懸浮生長(zhǎng)兩種，分別稱為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。2）一般可將貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的體外培養(yǎng)細(xì)胞大體分為成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走細(xì)胞型、多行細(xì)胞型四種類型，最常見(jiàn)的為前兩種。3）體外培養(yǎng)細(xì)胞的主要生長(zhǎng)特點(diǎn)：貼附生長(zhǎng)接觸抑制密度依賴性 培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化：去分化（脫分化）不適應(yīng)1、細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求有哪些和工作方法要求：1）培養(yǎng)前準(zhǔn)備2）操作間消

4、毒3）洗手和著裝4）火焰消毒培養(yǎng)前的準(zhǔn)備的基本要求：培養(yǎng)基的選擇和無(wú)菌配制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的類型、配制和無(wú)菌處理方法：1）操作程序規(guī)范2）試劑設(shè)備專人負(fù)責(zé)3）培養(yǎng)用品定點(diǎn)存放2、平衡鹽溶液（BBS）：（1）成分：無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖，少量酚紅。（2）作用：維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度（3）常用：Hanks液、PBS等 消化液（1）作用：分散組織或細(xì)胞團(tuán)。2）常用：胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液、EDTA-2Na液、蝸牛酶等2、消化液中的胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液、EDTA-2Na液作用的原理是什么？胰蛋白酶消化液主要作用是水解細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞相互分離。EDTA-2Na液：是一種化學(xué)螯合劑，其

5、溶液又稱Versen液，對(duì)細(xì)胞有一定的離解的作用。EDTA-2Na液的主要作用是通過(guò)結(jié)合（螯合）細(xì)胞間質(zhì)中的二價(jià)陽(yáng)離子從而破壞細(xì)胞之間的細(xì)胞連接。達(dá)到分散細(xì)胞的目的。膠原酶溶液：膠原酶是從細(xì)胞中提取的一種酶，對(duì)膠原組織和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，而對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞一般不產(chǎn)生損傷，常在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)用來(lái)離散細(xì)胞與膠原組織。3、1）天然培養(yǎng)基：定義:主要指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。優(yōu)點(diǎn)：含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滲透壓、pH等也與體內(nèi)環(huán)境相似，培養(yǎng)效果好。缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，批間差異大，易被支原體污染。2）合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用

6、人工方法模擬合成 的，配方恒定的培養(yǎng)基。 成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú) 機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量固定。成本低。 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。3）完全培養(yǎng)基;定義：在合成培養(yǎng)基里添加血清后的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基:常用培養(yǎng)基，血清含量高, 10-20%。維持培養(yǎng)基:維持細(xì)胞不死或緩慢生長(zhǎng)，血清含量低, 2-5%。4）無(wú)血清培養(yǎng)基：定義：由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充因子（生長(zhǎng)因子和激素、結(jié)合蛋白等）組成。用途：用于研究細(xì)胞生長(zhǎng)因子、單克隆抗體制備、細(xì)胞分泌產(chǎn)物研究等。優(yōu)點(diǎn)：保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化提純和鑒定等程序

7、。 3、完全培養(yǎng)基中各成分的作用是什么？ 合成培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）的成分只能維持細(xì)胞生存血清：常用牛血清，含有促進(jìn)細(xì)胞增殖的各種生長(zhǎng)因子和其他多種有利于細(xì)胞生存的物質(zhì)。一定量的抗生素：防止污染 4、體外培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞的差異都有哪些？5、論述培養(yǎng)細(xì)胞的一代生存期可分為幾個(gè)階段及其特點(diǎn)？培養(yǎng)細(xì)胞的“一代生存期”，是指從細(xì)胞接種后到再次傳代培養(yǎng)之前的這一段時(shí)間，它與細(xì)胞世代或倍增時(shí)間不同?？煞譃闈摲凇⒅笖?shù)生長(zhǎng)期、停滯期（平頂期）1.潛伏期特點(diǎn)：1）細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的恢復(fù)期（包括懸浮期、貼壁期、潛伏期三個(gè)時(shí)期）2）可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。2.指數(shù)生長(zhǎng)期特點(diǎn)：1）細(xì)胞增殖最旺盛的時(shí)

8、期，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)生長(zhǎng)，是實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)的主要階段。2）用細(xì)胞分裂指數(shù)和細(xì)胞群體倍增時(shí)間表示。3.停滯期特點(diǎn)：特點(diǎn)：細(xì)胞數(shù)量不再增加，仍有代謝活動(dòng)6、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)具有一系列優(yōu)點(diǎn)：可簡(jiǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境。在細(xì)胞存活的基礎(chǔ)上獨(dú)立研究細(xì)胞生命活動(dòng)、逐項(xiàng)研究細(xì)胞生存條件和細(xì)胞功能。能夠方便地控制實(shí)驗(yàn)因素。 研究某種實(shí)驗(yàn)因素對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)作用，只需在培養(yǎng)液中有針對(duì)性地加入或者刪除這種成分。易于觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究細(xì)胞的生命活動(dòng)規(guī)律，可以很方便地采用各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法來(lái)觀察、檢測(cè)和記錄。可供研究的細(xì)胞種類極其廣泛?？赏瑫r(shí)提供大量均一性較好的細(xì)胞群，降低實(shí)驗(yàn)成本。能夠進(jìn)行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)。包

9、括酶、單克隆抗體以及多種疫苗等生物制品或者基因工程產(chǎn)品。2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)：體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較高。動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格。體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞存在或多或少的差異。（形態(tài)和功能的差異）7.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室有哪幾個(gè)部分組成？理想的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可分為：準(zhǔn)備室、緩沖室（與培養(yǎng)室相連的消毒房間，作為隔離培養(yǎng)室與外面非消毒房間的緩沖地帶）、培養(yǎng)室（一間或幾間），普通實(shí)驗(yàn)室、辦公室。8.論述細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)特點(diǎn)。培養(yǎng)細(xì)胞生命期：指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。包括三個(gè)階段：原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期、衰退期。1.原代培養(yǎng)期 （也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第

10、一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周） 特點(diǎn)：二倍體，細(xì)胞分裂次數(shù)少，異質(zhì)性，獨(dú)立生存性差。 用途：藥物測(cè)試，疫苗制備等。2.傳代培養(yǎng)期（定義：原代細(xì)胞接種到兩個(gè)或以上的器皿繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)標(biāo)志進(jìn)入傳代培養(yǎng)期）特點(diǎn)：細(xì)胞分裂增殖旺盛，去分化，在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，傳代10-50次。3.衰退期（定義：傳代培養(yǎng)一定代數(shù)后，細(xì)胞生命活動(dòng)明顯減弱，增殖很慢或不增殖，直至衰退死亡的時(shí)期。）細(xì)胞特點(diǎn)：細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，色澤變暗，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)暗的顆粒樣結(jié)構(gòu)及空泡狀結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)突起回縮，最后衰退凋亡。9.論述玻璃制品清洗步驟10、論述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1.在生物學(xué)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用（1）在細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)

11、用 研究細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)、代謝以及病變等微觀過(guò)程。（2）在遺傳學(xué)上的應(yīng)用 染色體分析，雜交育種。（3）在胚胎學(xué)上的應(yīng)用 通過(guò)體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞，進(jìn)行體外受精、胚胎分割和移植。（4）在病毒學(xué)上的應(yīng)用 培養(yǎng)細(xì)胞為病毒的增殖提供場(chǎng)所。（5）在藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 藥品、食品添加劑等對(duì)機(jī)體的毒性及其產(chǎn)生不良影響的安全性調(diào)查。（許多致畸、致癌物質(zhì)加入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液后，培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異。）2.在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（1）用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)前診斷 用羊膜穿刺技術(shù)獲得胎兒細(xì)胞，培養(yǎng)后進(jìn)行染色體分析，診斷胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型。（2）用于癌癥的早期診斷和預(yù)防 通過(guò)

12、培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，對(duì)其染色體進(jìn)行對(duì)比分析檢測(cè)出易患癌癥的病人，進(jìn)行及早的預(yù)防和治療。（3）用于臨床治療 目前已有將正常骨髓細(xì)胞經(jīng)大量培養(yǎng)后植入患造血障礙癥患者體內(nèi)進(jìn)行治療的報(bào)道。（4）用于藥物效應(yīng)的檢測(cè) 檢測(cè)的藥物具有組織特異性時(shí)，可選用相應(yīng)的細(xì)胞，如檢測(cè)治療肝病的藥物可選用肝細(xì)胞、檢測(cè)抗癌藥物可選用癌細(xì)胞。3.在動(dòng)物育種上的應(yīng)用 新品種的培育可大大縮短育種進(jìn)程，且更加經(jīng)濟(jì)有效。胚胎干細(xì)胞的研究成果和克隆羊多莉的問(wèn)世為動(dòng)物遺傳育種開(kāi)辟了一條新途徑。4.在生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用 用動(dòng)物細(xì)胞可生產(chǎn)的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長(zhǎng)因子、病毒殺蟲(chóng)劑、單克隆抗體等。11、血清種類：人血清、牛血清、

13、馬血清等。成分：基本營(yíng)養(yǎng)物、激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。標(biāo)準(zhǔn): 透明,淡黃色,無(wú)沉淀物,無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。 使用：逐步解凍，熱滅活， 10%濃度，超低溫保存。牛血清又分胎牛血清和小牛血清，它們的區(qū)別胎牛血清是從母牛剖腹取出的胎牛中分離出來(lái)的血清，對(duì)許多細(xì)胞系均有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，主要用于細(xì)胞株的保藏及特殊嬌貴細(xì)胞株的體外培養(yǎng)，但價(jià)格昂貴。小牛血清是從剛出生但尚未哺乳的小牛分離出來(lái)的血清。12、細(xì)胞傳代方法貼壁細(xì)胞的消化法傳代步驟（1）吸出或倒掉瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液。（2）加入適量的消化液消化。（3）鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。（4）吹打瓶壁細(xì)胞，制成細(xì)胞

14、懸液。（5）計(jì)數(shù)，接種到新的培養(yǎng)瓶。懸浮細(xì)胞多采用離心法傳代將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800-1000rpm離心5min,然后取出上清，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打使之形成細(xì)胞懸液，然后傳代接種。13、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測(cè)技術(shù)1）培養(yǎng)液 觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。 正常培養(yǎng)液pH介于7.27.4之間，呈桃紅色、清亮透明。培養(yǎng)中細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物會(huì)使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色變淺變黃。23天或34天換液一次。2）細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 倒置顯微鏡觀察。原代細(xì)胞培養(yǎng)中最先可見(jiàn)從組織塊中邊緣“長(zhǎng)出”細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是最易生長(zhǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%應(yīng)及時(shí)傳代。3、細(xì)胞形狀變化 生

15、長(zhǎng)良好的細(xì)胞：透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良的細(xì)胞：輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)酰吘壊积R，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。采取措施：換液、排污、廢棄。4、微生物污染細(xì)菌污染：培養(yǎng)液渾濁、漂浮菌絲。支原體污染：生長(zhǎng)減緩、胞質(zhì)顆粒增多、培養(yǎng)液不變混。細(xì)胞交叉污染?；瘜W(xué)物質(zhì)污染。14、去分化和不適應(yīng)的區(qū)別“去分化”不可逆（染色體變化）?！安贿m應(yīng)”可重新誘導(dǎo)（培養(yǎng)條件變化）關(guān)于去分化需要注意： 去分化并不意味著完全返回胚胎時(shí)期的原始細(xì)胞狀態(tài)。如:高度分化的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù)，但已經(jīng)具備的生物電活動(dòng)特性不會(huì)完全失去

16、 ?？芍匦卤憩F(xiàn)出分化特點(diǎn)。 如：把表皮細(xì)胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的角質(zhì)細(xì)胞 、內(nèi)皮細(xì)胞，但，這種能力會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸喪失。15、谷氨酰胺在培養(yǎng)基中的主要作用？配液時(shí)應(yīng)該注意哪些問(wèn)題？作用：在細(xì)胞代謝中有重要作用，是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需氨基酸，（在缺少時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良死亡）配液時(shí)：由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20度冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4度冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。第二章1、細(xì)胞冷凍的原理是什么細(xì)胞凍存的原則：慢凍快融 2）加冷凍保護(hù)劑（常用：甘油或二甲基亞砜（DMSO)）主要原因：1）冷凍速度過(guò)快

17、，細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰形成冰晶，造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞引起細(xì)胞死亡。冷卻速度越快，冰晶損傷越大。2）細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏。冷凍保護(hù)劑作用機(jī)理：1）冷凍保護(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成 ；2）通過(guò)其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。2、復(fù)蘇原理復(fù)蘇時(shí)融解細(xì)胞速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞最易受損的-50度，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使

18、水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害，以防止細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胞死亡。3、細(xì)胞復(fù)蘇的過(guò)程將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至3740。從液氮中取出凍存小管，立即投入3740溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解。要在12min內(nèi)完成復(fù)溫。將細(xì)胞凍存懸液移入離心管，加入約5m1培養(yǎng)液，輕輕吹勻。 將細(xì)胞懸液經(jīng)8001000 r/min離心5min。棄上清液。給細(xì)胞沉淀物加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加培養(yǎng)液37、5%CO2培養(yǎng)。4、細(xì)胞活性檢查1.染色法：使損傷或死亡細(xì)胞著色。結(jié)晶紫、臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑等。2.四唑鹽（MTT）比色法：活細(xì)胞可沉淀四唑鹽并形成藍(lán)紫色結(jié)晶，再用DMSO溶解

19、結(jié)晶物，溶液顏色的深淺與所含的甲躦量成正比。用酶標(biāo)儀在5 7 0nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度OD值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)。第三章1、原代細(xì)胞培養(yǎng)常用組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。2、組織塊培養(yǎng)法 定義：組織塊培養(yǎng)是即將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的方法?；痉椒ǎ簩⒓舫傻男〗M織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，組織塊易損傷，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，適于組織量少的原代培養(yǎng)。基本過(guò)程：取材修剪沖洗；剪成1mm3左右的小塊；移入培養(yǎng)瓶；間距5mm分布組織小塊；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶37靜止2-4h；翻正培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；原代細(xì)胞培養(yǎng)。3、消化培養(yǎng)法

20、定義：利用組織消化分散法將細(xì)胞間質(zhì)物質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液培養(yǎng)的方法。特點(diǎn)：容易獲得大量細(xì)胞，生長(zhǎng)速度快，適于培養(yǎng)大量組織，但步驟繁瑣，易污染，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高。過(guò)程：消化分離法消化細(xì)胞、鏡檢；發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，終止消化，篩網(wǎng)過(guò)濾，大塊繼續(xù)消化；過(guò)濾的消化液，低速離心，加培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接入培養(yǎng)瓶。4、原代取材的基本要求（1）無(wú)菌取材：嚴(yán)格無(wú)菌操作。（2）取材器械鋒利：防止機(jī)械損傷。（3）及時(shí)培養(yǎng)：可培養(yǎng)液4暫存。（4）去除無(wú)用組織，避免干燥。（5）營(yíng)養(yǎng)豐富：添加10%血清。（6）采用易培養(yǎng)組織：組織類型、分化程度、年齡等。（7）作好記錄：來(lái)源等信息及標(biāo)本要保留。5、組織材

21、料的分離1) 細(xì)胞懸液的分離方法 來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用離心法分離。一般采用50001000r/min的低速離心510分鐘。2)組織材料的分離方法 可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法。1.機(jī)械分散法 方法:注射針芯擠壓法。 特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。2.剪切分散法 利用剪切法將組織剪切成1平方毫米的小塊。3.消化分離法 定義：消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進(jìn)一步分散的方法。 種類：胰蛋白酶法、膠原酶法、EDTA法。6、應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行中瘤研究具有的優(yōu)點(diǎn)1，可以免受機(jī)體內(nèi)部因素的影響

22、，從而便于研究理化和生物等因素對(duì)腫瘤細(xì)胞生命的影響2、便與研究腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能3、腫瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期保存以便觀察其遺傳行為的變化4、可用抗癌藥物的快速篩選7、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)生物學(xué)特性：永生性、侵襲性，不受控增殖性，遺傳性質(zhì)改變，異質(zhì)性、成瘤性。第四章動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：指在人工條件下，在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)微載體：微載體指直徑在60250微米，能適用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的微珠，一般由葡聚糖或各種合成聚合物組成。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用中空纖維給培養(yǎng)細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種大規(guī)模培養(yǎng)方法微囊化培養(yǎng)是指在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)

23、胞、生物活性物質(zhì)以及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 1.貼壁培養(yǎng)2.固定化培養(yǎng)3.懸浮培養(yǎng)（一）貼壁培養(yǎng)定義：指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)方式。優(yōu)點(diǎn)：適用細(xì)胞種類多；容易采用灌流培養(yǎng)；容易更換培養(yǎng)液。缺點(diǎn)：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差，投資大。培養(yǎng)方式：旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、細(xì)胞工廠培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)。（二）固定化培養(yǎng)定義：將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)的方式。優(yōu)點(diǎn)：既適用于貼壁依賴性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)，細(xì)胞密度高，抗剪切力和抗

24、污染力強(qiáng)，易于分離純化。方法：吸附法、包埋法、微囊法（三）懸浮培養(yǎng)定義：指細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。缺點(diǎn)：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌式和氣升式。2、微載體的選擇有何要求微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性，適用細(xì)胞附著、伸展和增殖；微載體無(wú)毒、惰性，不與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學(xué)變化，也不會(huì)吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分；微載體的比重在1.0301.045g/ml，使載體在低速攪拌下就可懸浮，而在靜止時(shí)又可很快沉降，便于換液和收獲；粒徑在60250m（溶脹后）之間，均一，差異不大于20 m 。

25、有利于細(xì)胞均勻分布在各微載體表面；具有良好的光學(xué)透明性，利于觀察細(xì)胞在載體上的生長(zhǎng)情況；可耐120高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌； 原料充足，價(jià)廉，制備簡(jiǎn)便，經(jīng)簡(jiǎn)單的適當(dāng)處理后，可反復(fù)多次地使用。3、微載體培養(yǎng)的操作包括哪些步驟培養(yǎng)初期階段；粘附貼壁階段；維持培養(yǎng)階段；細(xì)胞收獲階段；微載體培養(yǎng)放大階段4、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用5、微囊化培養(yǎng)中微囊的制備應(yīng)注意哪些問(wèn)題1）溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作2）所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害3）膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)4）膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中的攪拌。6、理想的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器應(yīng)滿足哪些基本要求？使比較教材所介紹

26、的幾種生物反應(yīng)器各自優(yōu)缺點(diǎn)能提供充足氧氣；良好的傳質(zhì)傳熱及密閉性能；制備材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒；有自動(dòng)檢測(cè)調(diào)控系統(tǒng)；便于操作維護(hù)。1、攪拌式細(xì)胞生物反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：避免向培養(yǎng)基直接通氣時(shí)氣泡損傷細(xì)胞，沒(méi)有移動(dòng)部件，密封好，氧轉(zhuǎn)換率較高，便于放大。 缺點(diǎn)：氧傳遞系數(shù)小，氣路系統(tǒng)不能就地滅菌。2、氣升式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn):器內(nèi)氣流溫和均勻剪切力小，完全密封，便于無(wú)菌操作，氧的轉(zhuǎn)換率高，便于放大生產(chǎn) 缺點(diǎn)：1）這種生物反應(yīng)器只能用于需要?dú)怏w的反應(yīng)，或者是需要有氣體的場(chǎng)合2）在培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡，從而會(huì)對(duì)正在培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響3）這種生物反應(yīng)器，如果沒(méi)有其他裝置的幫助就只能培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)

27、的細(xì)胞。3、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)1）培養(yǎng)器體積小，細(xì)胞高細(xì)胞損害??；2）濃縮產(chǎn)品；3）易于分離產(chǎn)物，產(chǎn)物純度高，不易污染；4）自動(dòng)化程度高，細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。 缺點(diǎn):細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，代謝物容易堵塞孔徑，不易清洗維護(hù)，價(jià)格高第五章抗原上可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇?？贵w：是指機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。單克隆抗體：即單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體。是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無(wú)限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過(guò)有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。多克隆抗體：一個(gè)抗原上可以有好幾個(gè)不同的抗原決定簇，進(jìn)入機(jī)體后會(huì)刺激好

28、幾中B細(xì)胞增殖，因而使機(jī)體產(chǎn)生幾種不同的抗體，成為多克隆抗體基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：將外源性基因采用化學(xué)或物理的方法人工導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)。主要用于癌基因研究。1、 什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？單克隆抗體是由一種B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的只針對(duì)某一特定抗原決定簇的抗體分子。局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍；反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體；制備技術(shù)復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，價(jià)格較高。特性：理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制不同：?jiǎn)慰寺】贵w的特異性強(qiáng)，只針對(duì)單一的抗原表位；而多克隆抗體則可以與多個(gè)抗原表位結(jié)合，當(dāng)抗原的某個(gè)抗原表位改變時(shí)，單抗

29、不能發(fā)揮其作用2、簡(jiǎn)述單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用。應(yīng)用：1）用于疾病的診斷和治療：2）作為載體制備導(dǎo)向藥物。3、骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合過(guò)程中應(yīng)特別注意的幾個(gè)問(wèn)題是什么1)細(xì)胞比例2）反應(yīng)時(shí)間3）反應(yīng)溫度4）PEG的選擇4、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的基本原理1）要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)。2）而骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞融合，得到雜種骨髓瘤細(xì)胞。3）雜種細(xì)胞既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原

30、決定簇的特異單克隆抗體。與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。5、HAT篩選雜交瘤細(xì)胞原理細(xì)胞融合時(shí)加入HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基喋呤、T為胸腺嘧啶）選擇系統(tǒng)，目的是保證只有雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。HAT培養(yǎng)基是含有由次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)、的一種選擇性培養(yǎng)基，這三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。A可阻斷細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，細(xì)胞在含有氨基碟呤的培養(yǎng)基中不能通過(guò)正常途徑合成DNA。這時(shí)正常細(xì)胞可以通過(guò)“補(bǔ)救合成途徑”,由胸腺嘧啶激酶（HK）和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）利用T和H合成核酸而繁殖。骨髓瘤細(xì)胞都是HGPRT缺乏株，不能利用

31、H和T合成DNA，而B(niǎo)細(xì)胞中有這種酶，但在體外培養(yǎng)只存活57天，所以只有脾-瘤才能在HAT選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。6、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。 第六章外植體：用于植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段）。愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上，由外植體的表面形成的一團(tuán)不定形的排列疏松的薄壁細(xì)胞。細(xì)胞全能性：植物的每個(gè)細(xì)胞都攜帶一整套遺傳信息，具有發(fā)育成完整植株的潛力。 脫分化：已經(jīng)分化的細(xì)胞、組織、器官在人工培養(yǎng)的條件下又變成未分化的細(xì)胞和組

32、織的過(guò)程。 再分化：通過(guò)脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化為胚狀體或直接分化出器官。植物細(xì)胞培養(yǎng)：在離體條件下將易分散的植物組織或植物的愈傷組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞（單個(gè)細(xì)胞），通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來(lái)獲得大量細(xì)胞群體的方法。1、植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別與聯(lián)系培養(yǎng)對(duì)象不同植物組織培養(yǎng)包括植物器官和組織如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)包括各種單細(xì)胞、單倍體細(xì)胞、原生質(zhì)體、小細(xì)胞團(tuán)、固定化細(xì)胞等。愈傷組織培養(yǎng)既屬于組織培養(yǎng)又屬于細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)目的不同 組織培養(yǎng)：獲得植物組織和再生成植株，或利用發(fā)狀根培養(yǎng)生產(chǎn)某些次級(jí)代謝物。主要用于植株的產(chǎn)業(yè)化

33、生產(chǎn)和繁育。 細(xì)胞培養(yǎng)：獲得細(xì)胞和產(chǎn)物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)行種質(zhì)保存、人工種子的制備和植株的大規(guī)?？焖俜敝场?、外植體的選擇和預(yù)處理1、外植體的選擇：適當(dāng)生長(zhǎng)期的健康植株、細(xì)胞之間粘連程度小，如 葉片組織。2、外植體的預(yù)處理：（1）沖刷材料： 流水 ，幾分鐘-數(shù)小時(shí)，加洗衣粉、 吐溫等表面清洗劑。 (2) 表面浸潤(rùn)滅菌：超凈臺(tái)，70%酒精，10-30S。（3）深層滅菌：氯化汞、次氯酸鈉等。 （4）無(wú)菌水沖洗。 3min/次，3-10次。3、愈傷組織培養(yǎng)的一般程序1.培養(yǎng)基配制2.愈傷組織誘導(dǎo)3.繼代培養(yǎng)4.從愈傷組織分離得到細(xì)胞4、一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要

34、求？特性：松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，松散易碎。要求：選擇適宜的外植體：胚、胚軸、子葉是最常用的外植體，特別是幼胚。選擇適宜的培養(yǎng)基：生長(zhǎng)素濃度很重要配合一定濃度的細(xì)胞分裂素；添加附加物。愈傷組織要進(jìn)行繼代選擇：選擇疏松好、細(xì)胞狀態(tài)好的細(xì)胞不斷繼代培養(yǎng)。5、為什么要進(jìn)行植物組織固定化培養(yǎng)雖然細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能夠產(chǎn)生大量次生代謝物，但是人們所期待的次生代謝物往往產(chǎn)量不高，細(xì)胞固定后的密集而緩慢的生長(zhǎng)有利于細(xì)胞的分化和組織化，從而有利于次生代謝物質(zhì)的合成。此外，細(xì)胞固定化后不僅便于對(duì)環(huán)境因子的參數(shù)進(jìn)行調(diào)控，而且有利于在細(xì)胞團(tuán)間形成各種化學(xué)物質(zhì)和物理因素的梯度，這可能是調(diào)控高產(chǎn)次生物質(zhì)的關(guān)鍵。與植物懸浮培養(yǎng)比較，固定化植物細(xì)胞具有穩(wěn)定性好，產(chǎn)物容易分離、利于連續(xù)花生產(chǎn)等特點(diǎn)。但是只適用可以分泌到細(xì)胞外的次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。6、常見(jiàn)的植物細(xì)胞生物反應(yīng)器有有哪些？各有和優(yōu)缺點(diǎn)？1）攪拌式生物反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：混合性好，傳氧效率高，操作彈性大，可用于細(xì)胞高密度培養(yǎng)等。缺點(diǎn)：由于植物細(xì)胞對(duì)攪拌是所產(chǎn)生的剪切力的忍耐力較差，傳統(tǒng)的攪拌式生物反應(yīng)器通常易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害。2）氣升式生物反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：剪切力小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，好的無(wú)菌狀態(tài)。氧的傳遞速率較高。缺點(diǎn)：操作彈性小，低氣速在高密度培養(yǎng)時(shí)，其混合效果較差，植物細(xì)胞生長(zhǎng)較慢。3）鼓泡式生物反應(yīng)器 優(yōu)點(diǎn)：容