獸用疫苗生產(chǎn)和檢驗(yàn)技術(shù)

1、關(guān)于獸用疫苗生產(chǎn)與檢驗(yàn)技術(shù)第1頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 獸用生物制品系指用天然或人工改造的微生物（細(xì)菌、病毒、衣原體、鉤端螺旋體等）及其代謝產(chǎn)物、寄生蟲、動(dòng)物血液或組織等為原材料，采用生物學(xué)、分子生物學(xué)或生物化學(xué)等相應(yīng)技術(shù)制成的生物制劑，用于預(yù)防、治療或診斷畜禽疫病。 1、按照性質(zhì)和制造方法 疫（菌）苗、類毒素、抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。 2、按照作用與用途 預(yù)防、診斷和治療用生物制品。 一、獸用生物制品分類第2頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 將細(xì)菌、病毒、寄生蟲等接種于特殊基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，收獲其抗原單位或亞單位，或用人工合

2、成的抗原單位或亞單位制備而成的活的或滅活的、具有特異性和免疫原性的生物制品，用于預(yù)防靶動(dòng)物的疾病。 預(yù)防用獸用生物制品包括：滅活疫苗、活疫苗、重組亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、重組活載體疫苗和核酸（DNA）疫苗。 （一）預(yù)防用獸用生物制品第3頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 1)強(qiáng)毒(菌)或弱毒（菌）培養(yǎng)滅活或加熱純化或濃縮佐劑或防腐劑。 2)滅活的毒素或提取的亞單位或rDNA產(chǎn)生亞單位。 滅活疫苗穩(wěn)定、安全，便于運(yùn)輸和保存，易于提純純化和制備多價(jià)、多聯(lián)苗。但用量較大、接種次數(shù)多、免疫力產(chǎn)生慢、注射困難、注射局部可能有反應(yīng)等。 1、滅活疫苗(死疫苗)第4頁，

3、共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 1）致弱的弱毒（菌、蟲）株 動(dòng)物、組織、細(xì)胞、雞胚或培養(yǎng)基培養(yǎng)降低毒力、保留免疫原性篩選。 2）自然弱（無）毒（菌、蟲）株。 3）異種毒（菌、蟲）株。 4）基因工程改造弱毒株。 活疫苗對(duì)原宿主動(dòng)物無致病性或引起亞臨床感染，能產(chǎn)生主動(dòng)免疫力，用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長(zhǎng)。但可能存在不安全風(fēng)險(xiǎn)。2、活疫苗(弱毒疫苗)第5頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 1）微生物物理和化學(xué)方法提取有效抗原成分。 2）病原基因工程技術(shù)保護(hù)性抗原基因序列插入合適的表達(dá)質(zhì)粒高效穩(wěn)定表達(dá)生產(chǎn)抗原亞單位疫苗。3、重組亞單位疫苗第

4、6頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四用化學(xué)方法人工合成多肽作為抗原。純度高、穩(wěn)定，但只能線性表達(dá)，不能折疊，免疫原性較差。4、合成肽疫苗第7頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 病原體基因工程方法缺失致病性基因或非必要糖蛋白保持免疫原性降低致病性。疫苗毒力不易恢復(fù)，穩(wěn)定性好，可配合鑒別診斷方法，區(qū)別免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物。5、基因缺失疫苗第8頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四病原保護(hù)性抗原基因序列插入另一種無毒或弱毒的微生物基因組表達(dá)構(gòu)建重組活載體疫苗株?？梢酝瑫r(shí)表達(dá)多種抗原，制成多價(jià)或多聯(lián)疫苗，毒力不返強(qiáng)。6、重組活

5、載體疫苗第9頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 病原保護(hù)性抗原基因連接細(xì)菌或病毒DNA 直接導(dǎo)入動(dòng)物體表達(dá)抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)。制造簡(jiǎn)便、成本低、安全、免疫期長(zhǎng)、熱穩(wěn)定性好，但仍未商品化生產(chǎn)。 7、核酸疫苗（基因或DNA疫苗）第10頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1、常規(guī)免疫血清學(xué)診斷技術(shù) （1）凝集試驗(yàn)抗原： 直接凝集試驗(yàn)（平板法、試管法）：抗原和抗體混合后直接發(fā)生凝集反應(yīng)。 間接凝集試驗(yàn)（間接血凝、膠乳凝集和反相間接血凝試驗(yàn)）。 （二）診斷用制品第11頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（2）免疫沉淀試驗(yàn)抗原：包

6、括試管沉淀法、單相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和雙相免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳、對(duì)流免疫電泳等。（3）中和試驗(yàn)：將特異性血清與相應(yīng)病原混合，用血清病毒混合物接種靶動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察感染情況進(jìn)行疾病診斷。（4）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原：抗原抗體復(fù)合物可以激活補(bǔ)體，出現(xiàn)各種生物學(xué)反應(yīng)。1、常規(guī)免疫血清學(xué)診斷技術(shù)第12頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：包括直接法、間接法、雙抗體夾心、競(jìng)爭(zhēng)ELISA等。（6）熒光抗體染色技術(shù)：直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等。 （7）膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)。（8）免疫組化診斷試劑。1、常規(guī)免疫血清學(xué)診斷技術(shù)第13頁，共110頁，2022

7、年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（1）生物技術(shù)：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)（熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù)）。 （2）分子生物學(xué)技術(shù)。PCR（RTPCR）擴(kuò)增技術(shù)。熒光定量PCR（RTPCR）。基于核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）。核酸探針。2、生物技術(shù)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)第14頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1、抗血清：用抗原多次免疫動(dòng)物，提取血清制成，用于治療或預(yù)防動(dòng)物疾病。2、微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體菌群、增強(qiáng)免疫力、促生長(zhǎng)等。3、卵黃抗體：用抗原多次免疫禽類，提取卵黃抗體制成，用于治療或預(yù)防動(dòng)物疾病。4、干擾素：用病毒等誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。5、轉(zhuǎn)移因子：

8、用動(dòng)物臟器或組織提取制成，作為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，提高生產(chǎn)性能。（三）治療及其他制品第15頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（一）獸用滅活疫苗的制備技術(shù) 滅活疫苗是用菌（毒）種培養(yǎng)物或含毒組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)化學(xué)滅活劑滅活或加熱處理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎┗蚣尤朊庖咦魟┲瞥伞?二、獸用疫苗制備技術(shù)第16頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1.1、菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn)歷史清楚；生物學(xué)性狀明顯；遺傳穩(wěn)定；優(yōu)良的免疫原性與反應(yīng)原性；毒力在規(guī)定的范圍內(nèi)。1、菌（毒）種第17頁，共110頁，2022年，5月20日，1

9、0點(diǎn)15分，星期四原種 細(xì)菌原種應(yīng)規(guī)定其培養(yǎng)特性、生化特性、血清學(xué)特性、毒力和免疫原性等，并作純粹檢查。病毒原種應(yīng)規(guī)定其生物學(xué)特性、理化特性、血清學(xué)特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等，并純粹?；A(chǔ)種子 基礎(chǔ)種子由原種制備而來，基礎(chǔ)種子為企業(yè)生產(chǎn)獸用生物制品提供種子來源，應(yīng)作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次。生產(chǎn)種子 生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)用基礎(chǔ)種子進(jìn)行復(fù)壯、繁殖。細(xì)菌等生產(chǎn)種子應(yīng)作純粹檢查。病毒生產(chǎn)種子應(yīng)作含量測(cè)定和純凈檢查。1.1、菌（毒）種標(biāo)準(zhǔn)第18頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四菌種的選育 分離病原純粹檢驗(yàn)致病性鑒定和抗原性測(cè)定設(shè)計(jì)制成滅活疫苗接種實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物攻毒用本動(dòng)物進(jìn)

10、行保護(hù)率測(cè)定以確定疫苗候選株。毒種的選育 弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒株；強(qiáng)毒毒株分離系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強(qiáng)而穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相符）疫苗候選株。1.2 、菌（毒）種選育第19頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四冷凍真空干燥法 凍干的菌種一般在28C保存；凍干的毒種一般在-20C以下保存，溫度越低保存期越長(zhǎng)。結(jié)凍保存 有些病毒可用含毒組織在低溫條件下（-20C以下）。液氮保存 有些細(xì)胞結(jié)合毒須在196C的液氮中保存。動(dòng)物繼代保存 蟲種一般通過動(dòng)物繼代保存。1.3 、菌（毒）種保存第20頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星

11、期四生產(chǎn)檢驗(yàn)用菌（毒）種實(shí)行分級(jí)管理制度，種子分三級(jí)（原種、基礎(chǔ)種子和生產(chǎn)種子）。原種和由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心或分中心負(fù)責(zé)保管；基礎(chǔ)種子由菌種中心或分中心負(fù)責(zé)制備、鑒定、保管和供應(yīng)；生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)自行制備、鑒定和保管。1.4、菌（毒）種的管理第21頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四供應(yīng)：菌種中心及分中心統(tǒng)一供應(yīng)。索?。喉毘钟邢鄳?yīng)級(jí)別機(jī)構(gòu)出具的正式公函，說明菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。一、二類菌種時(shí)，必須由?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）獸醫(yī)行政主管部門審核，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)后，方可供應(yīng)。有產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)者，可由生產(chǎn)企業(yè)直接向菌種中心或分中心領(lǐng)取。要求：其他任何單位不得轉(zhuǎn)發(fā)生產(chǎn)用菌（

12、毒）種。烈性傳染病或人畜共患傳染病的強(qiáng)毒菌（毒）種，必須有專職技術(shù)人員領(lǐng)取。 1.5、菌（毒）種索取與分發(fā) 第22頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)細(xì)菌的繁殖是以二分裂法進(jìn)行，分四個(gè)時(shí)期：遲緩期（細(xì)菌處于靜止適應(yīng)狀態(tài)）；對(duì)數(shù)增殖期（以恒定的速度增殖）；穩(wěn)定期（細(xì)菌增加數(shù)與死亡數(shù)保存平衡）；衰退期（活菌數(shù)下降）。1.2、病原培養(yǎng)第23頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 需氧菌的培養(yǎng) 平板培養(yǎng)法 有平板劃線培養(yǎng)法和傾注培養(yǎng)法。需氧芽孢菌的培養(yǎng) 將接種材料先接種于液體培養(yǎng)基中，置水浴加入至80C，維持1520分鐘，以殺死非芽

13、孢菌，然后在37C作增菌培養(yǎng)。抑菌分離培養(yǎng) 利用某些化學(xué)藥品對(duì)某類細(xì)菌的抑制或殺滅作用，而對(duì)另一些細(xì)菌不生產(chǎn)明顯的作用，來分離培養(yǎng)某些細(xì)菌。接種試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行培養(yǎng)。1.2.1、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)第24頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四厭氧菌的培養(yǎng) 生物學(xué)方法 在培養(yǎng)基中加入植物或動(dòng)物組織（如馬鈴薯、發(fā)芽谷物、滅菌的新鮮動(dòng)物組織塊），以消耗養(yǎng)氣或使氧化還原電勢(shì)下降。用這些培養(yǎng)基培養(yǎng)厭氧菌時(shí)，先將培養(yǎng)基煮沸1530分鐘，降溫后在培養(yǎng)基表面加一層滅菌的液體石蠟，然后接種培養(yǎng)。1.2.1、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)第25頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四化學(xué)方法 利用還原

14、作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，吸收環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)氣或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化還原電勢(shì)。物理學(xué)方法 利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的養(yǎng)氣，形成無氧狀態(tài)，以利于厭氧菌的生長(zhǎng)。常用的有厭氧罐法。厭氧菌的培養(yǎng)第26頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四有些細(xì)菌特別是初次分離培養(yǎng)，在含有510CO2環(huán)境下生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)時(shí)，可直接利用二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照需要調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳的濃度。在沒有條件的實(shí)驗(yàn)室，簡(jiǎn)便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點(diǎn)燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產(chǎn)生二氧化碳，蠟燭即熄滅。此時(shí)容器內(nèi)含有較高濃度的二氧化碳，將容器放

15、入適宜溫度培養(yǎng)。 含二氧化碳條件下的細(xì)菌培養(yǎng)第27頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，由于病毒缺乏自主復(fù)制的酶系統(tǒng)，不能獨(dú)自進(jìn)行物質(zhì)代謝，必須依賴宿主細(xì)胞或細(xì)胞的某些成分合成核酸和蛋白質(zhì)，所以只能在易感的細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制的方式進(jìn)行增殖，而不能在任何無細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)生長(zhǎng)。除少數(shù)病毒外，大多數(shù)動(dòng)物病毒能在試驗(yàn)動(dòng)物、受精卵和細(xì)胞培養(yǎng)中增殖。1.2.2、病毒培養(yǎng)基本技術(shù)第28頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求1）無機(jī)離子 維持滲透壓、提供細(xì)胞酶與代謝活動(dòng)所需要的物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞貼壁等。常用弱碳酸氫鹽來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液

16、的pH值，培養(yǎng)液的pH值一般維持在7.2-7.4。2) 碳水化合物 常用的碳水化合物是葡萄糖。有些復(fù)雜的培養(yǎng)基，還需添加其它糖類或簡(jiǎn)單的化合物如乳酸、丙酮酸及醋酸，或代替葡萄糖。3) 氨基酸 細(xì)胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構(gòu)體。維持細(xì)胞生長(zhǎng)的最低營(yíng)養(yǎng)要求需要以下13種氨基酸。1.2.2、病毒培養(yǎng)基本技術(shù)第29頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四4) 維生素 大部分維生素與細(xì)胞代謝有關(guān)。使用較多的維生素主要是B族維生素，復(fù)雜的培養(yǎng)液中還含有還原劑、谷胱甘肽、抗壞血酸及L半胱氨酸。在不含血清的培養(yǎng)液中，常含有脂溶性維生素。5) 蛋白質(zhì) 動(dòng)物血清是蛋白質(zhì)的主要來源，常用的有胎牛

17、血清或犢牛血清。血清起營(yíng)養(yǎng)作用，保護(hù)細(xì)胞或去毒，抑制蛋白溶解酶，促進(jìn)細(xì)胞在玻璃上附著和鋪開。6）抗生素 控制細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)菌的污染，常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、制霉菌素或兩性霉素B。病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求第30頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 細(xì)胞培養(yǎng)類型 （1）原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是用動(dòng)物新鮮組織如胚胎或幼畜的組織或受精卵，經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制備而成。病毒對(duì)原代細(xì)胞易感，繁殖滴度高，且無致瘤性等。但原代細(xì)胞不能在體外多次傳代，組織原材料的來源不固定，易混入外源病原，造成外源病毒污染，不易控制其質(zhì)量，影響產(chǎn)品的純凈和安全性。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第31頁，共110頁，202

18、2年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四2） 二倍體細(xì)胞株 原代細(xì)胞次代細(xì)胞多次連續(xù)傳代成為二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)可能發(fā)生變化，但細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。不能在體外無限制傳代，從幾代至幾十代，兼有原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，病毒對(duì)其易感，質(zhì)量可控，適用于繁殖病毒。 3）傳代細(xì)胞系 由腫瘤組織培養(yǎng)而成或由細(xì)胞株轉(zhuǎn)化而來?？稍隗w外無限制的傳代，其染色體數(shù)不正常，成為異倍體。適宜于許多動(dòng)物病毒的生長(zhǎng)，易于培養(yǎng)，可以建立種子庫，質(zhì)量易控制。但存在潛在的致瘤性，要求背景情況應(yīng)詳細(xì)，并作系統(tǒng)鑒定合格后，方可用于繁殖病毒生產(chǎn)滅活疫苗。細(xì)胞培養(yǎng)類型第32頁，共110頁，2022年，5月20日，10

19、點(diǎn)15分，星期四各種傳代水平細(xì)胞系檢查檢驗(yàn)項(xiàng)目主細(xì)胞庫工作細(xì)胞庫最高限制代次細(xì)胞高于最高代次10代的細(xì)胞顯微鏡檢查細(xì)菌和霉菌支原體病毒細(xì)胞鑒別胞核學(xué)檢查致瘤和致癌性第33頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1) 細(xì)胞保存 收集新鮮細(xì)胞，用細(xì)胞冷凍保護(hù)液(含20犢牛血清、510二甲基亞砜的營(yíng)養(yǎng)液)調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)100萬一200萬個(gè)細(xì)胞m1，分裝于安瓿中，封口， 4預(yù)冷30min，封口嚴(yán)密的安瓿移至-5070C冰箱中預(yù)冷，然后移至液氮罐內(nèi)貯存，可保存數(shù)年。 2) 細(xì)胞復(fù)蘇 將安瓶自液氮罐取出后立即放入3740溫水中，在lmin之內(nèi)使細(xì)胞融化，換液培養(yǎng)至形成細(xì)胞單層。3) 細(xì)

20、胞運(yùn)輸 單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶裝滿生長(zhǎng)液，以防液體振蕩沖脫細(xì)胞，或只留少量生長(zhǎng)液能覆蓋單層，以防細(xì)胞干燥。細(xì)胞懸液裝于冰盒保持溫度在1525左右。傳代細(xì)胞的保存第34頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）靜止培養(yǎng) 靜止培養(yǎng)是指將制備好的細(xì)胞懸液分裝在適宜的培養(yǎng)瓶中，密閉瓶口，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)或以松口的容器通入二氧化碳或在含二氧化碳的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，形成細(xì)胞單層后，接種病毒懸液，3738C左右繼續(xù)培養(yǎng)。2）轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng) 將制備好的細(xì)胞懸液分裝在玻璃或塑料轉(zhuǎn)瓶中，密閉瓶口，置轉(zhuǎn)瓶機(jī)上，以每小時(shí)510轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)，細(xì)胞在轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，貼附于瓶壁四周，長(zhǎng)成細(xì)胞單層后，接種病毒懸液，3

21、738C左右繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)方法第35頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四3）懸浮培養(yǎng) 在懸浮培養(yǎng)罐中通過不斷攪拌，并隨時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)液和校正pH值，使細(xì)胞在懸浮的條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)。由于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能及時(shí)得到充足的營(yíng)養(yǎng)和養(yǎng)氣，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)量高，可以得到大量的細(xì)胞。4）微載體培養(yǎng) 通過攪拌使微載體懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞通過貼附在微載體固體顆粒表面上生長(zhǎng)形成細(xì)胞單層，細(xì)胞的濃度較大、生長(zhǎng)快。微載體培養(yǎng)可采用通氣攪拌法，也可采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)方法第36頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四雞胚的選擇 必須是來源于健康易感的種雞群，其種蛋必須

22、新鮮，清潔。種雞群必須定期監(jiān)測(cè)，不得含有繁殖病毒的相應(yīng)抗體。雞胚接種途徑和接種方法1）尿囊腔途徑 取911日齡的雞胚，在燈光照射下，在離氣室約0.30.5cm處無大血管的位置作一標(biāo)記，作為接種部位，在氣室和待接種部位各打一小孔，將受精卵橫放在蛋盤上，在待接種處垂直刺入針頭約0.5cm，接種0.050.2ml病毒溶液，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可將氣室向上放于蛋盤中，在氣室距邊緣約0.5cm處打一小孔。沿受精卵長(zhǎng)徑平行方向刺入針頭約1cm，注入接種物0.050.2ml，用石蠟封孔，繼續(xù)孵化。1.2.3 雞胚接種技術(shù)第37頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四2）絨毛尿囊膜途徑

23、 在氣室中心鉆一小孔，直接從氣室處刺入針頭約0.5cm，滴入0.10.2ml病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。也可用人工氣室法進(jìn)行，在胚胎附近處和氣室處各打一小孔，然后用吸球緊貼氣室小孔處輕輕吸氣，造成負(fù)壓，形成人工氣室，接種0.10.2ml病毒溶液，用石蠟封孔。3）卵黃囊途徑 在氣室中心鉆一小孔，垂直刺入針頭約3cm，注入接種物0.20.5ml，用石蠟封口，繼續(xù)孵化。也可在氣室外和卵長(zhǎng)徑的1/2處各打一小孔，并在中間孔處刺入針頭約1.5cm，接種0.10.5ml病毒溶液，用石蠟封孔。 雞胚接種途徑和接種方法第38頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，

24、星期四4）羊膜腔途徑 將氣室端靠近胚胎側(cè)的卵殼鋸穿，在卵膜上滴入一滴無菌液體石蠟或生理鹽水，避開血管，在氣室處刺入針頭約0.5cm，在氣室內(nèi)的卵膜上滴入0.10.2ml病毒溶液，繼續(xù)垂直刺入針頭，穿過卵膜和絨毛尿囊膜，拔出針頭。或在人工氣室孔處呈30角刺入針頭約0.5cm，接種0.10.2ml病毒溶液，用石蠟封孔。5）靜脈途徑 畫出直而粗的靜脈處位置，卵殼，加一滴液體石蠟，使卵膜透明。用長(zhǎng)約1.5cm的4號(hào)針頭插入血管內(nèi)注射接種物0.02-0.05ml。雞胚接種途徑和接種方法第39頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四接種后一般在37C左右繼續(xù)孵化27天，不必翻蛋。每日照

25、蛋12次，棄去接種后24小時(shí)內(nèi)非特異死亡的雞胚，24小時(shí)后死亡的雞胚隨時(shí)撿出，置48C冷卻424小時(shí)。觀察期結(jié)束，所有活胚同樣冷卻處理。分別收獲收獲胚體、卵黃囊、尿囊液、絨毛尿囊膜等。收獲期間注意檢查胚胎、絨毛尿囊膜的病變情況、尿囊液是否渾濁等。接種后的檢查及病毒的收獲第40頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四幾種病毒接種途徑及收獲材料病毒胚齡接種途徑培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間雞胚變化收獲材料雞新城疫911尿囊腔37左右35天出血、死亡、血凝尿囊液雞痘1011CAM37左右5天膜上痘皰CAM雞傳染性喉氣管炎1011CAM37左右5天膜上痘皰CAM狂犬67卵黃囊37左右810天卵黃

26、囊乙腦68卵黃囊37左右3天死亡雞胚第41頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 2.4.1 動(dòng)物接種途徑和接種方法1）腦內(nèi)接種 給小鼠和地鼠腦內(nèi)接種時(shí)，用左手大拇指和食指固定頭部，消毒左側(cè)眼與耳之間上部注射部位，并于眼后角、耳前緣及顱前后中線所構(gòu)成之位置中間刺入針頭23mm，乳鼠接種0.01-0.02ml，成年鼠和地鼠為0.03-0.05ml。給豚鼠和家兔進(jìn)行腦內(nèi)接種時(shí)，先作麻醉或人工固定，在顱前后中線旁邊5mm平行線與動(dòng)物瞳孔橫線交叉處消毒，用錐刺穿顱骨，然后用針頭刺入410mm，接種0.1-0.025ml。綿羊腦內(nèi)接種時(shí)，先固定在接種臺(tái)上，剪去頭頂部的毛，并用硫化鋇

27、脫毛，碘酊消毒后，在顱頂部中線左或右側(cè)，用錐鉆一小孔，硬腦膜下或腦內(nèi)接種1ml，立即用火棉膠封閉接種孔。1.2.4 動(dòng)物接種技術(shù) 第42頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四2）皮內(nèi)接種 常用于大動(dòng)物。在背部、頸部、腹部、耳部及尾根部先剪毛，碘酊消毒，以左手拇指和食指提起注射部位皮膚，用針頭斜面向外，與皮膚面平行刺入23mm，接種0.1-0.2ml。注射劑量較大時(shí)，可分點(diǎn)注射。牛、羊舌面皮內(nèi)注射時(shí)，先固定動(dòng)物，抓住動(dòng)物舌頭并固定，然后接種。3）皮下注射 豚鼠和家兔可選擇腹部及大腿內(nèi)側(cè)皮膚松弛處，小鼠可選擇尾根部或背部，碘酊消毒皮膚處，用針頭水平方向挑起皮膚，刺入1.5-2

28、cm，緩慢注入接種物0.2-1ml。動(dòng)物接種途徑和接種方法第43頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四4）靜脈接種 小鼠尾靜脈注射時(shí)，先將小鼠尾巴在5055C水中浸泡1分鐘，使尾靜脈擴(kuò)張，用鼠缸扣住鼠體，露出尾部，用左手拇指和中指將鼠尾拉直，以食指托住尾部，消毒注射部位后由靠近尾尖端處平行刺入針頭，再向下刺入靜脈，慢慢注入0.1-1ml接種物。家兔耳靜脈注射時(shí)，先固定在特制固定器上或人工固定，剃耳毛，用酒精棉球涂擦注射部位靜脈1分鐘，使靜脈擴(kuò)張，再用左手拇指及中食指抓住耳尖部，刺入針頭緩慢注射15ml接種物。雞翅下肱靜脈注射時(shí)，側(cè)臥固定，張開翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊

29、消毒，用針頭斜面朝上刺入靜脈注射15ml接種物。動(dòng)物接種途徑和接種方法第44頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四5）腹腔接種 家兔和豚鼠先在腹股溝處刺入皮下，進(jìn)針少許后再刺入腹腔注射0.5-5ml。小鼠腹腔接種時(shí)，用右手提起鼠尾，左手拇指和食指捏其頭背部，翻轉(zhuǎn)鼠體使腹部向上，把鼠尾和右后腳夾于小指和無名指之間，右手將針頭平行刺入腿根處腹部皮下，向下斜行刺入腹腔，注射0.5-1ml。動(dòng)物接種途徑和接種方法第45頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四動(dòng)物接種后應(yīng)每天觀察，注意動(dòng)物的活動(dòng)、飲食、糞便與尿液及皮毛體表等情況，還應(yīng)根據(jù)接種微生物的特性及動(dòng)物性

30、別、年齡等的不同而有所側(cè)重，如體溫曲線、特征性臨床癥狀的出現(xiàn)及注射部位的特征性變化等。根據(jù)觀察結(jié)果，選出接種后符合要求的反應(yīng)特征的動(dòng)物，按照規(guī)定方法剖殺動(dòng)物，收集含毒血液或采集含毒組織、器官等。動(dòng)物接種后的觀察及含毒組織的收獲第46頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四大量培養(yǎng)細(xì)菌的方法 （1） 固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法 此法是將溶化的肉湯瓊脂培養(yǎng)基，分裝于大扁瓶(大型克氏瓶)，滅菌后平放使凝固，經(jīng)培養(yǎng)觀察無污染，在無菌室接入種子液，使均勻分布于表面，平放溫室靜置培養(yǎng)，然后傾去凝集水，收集菌苔制成菌懸浮液。 1.3、工業(yè)化大規(guī)模繁殖病原的方法第47頁，共110頁，2022年，

31、5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（2） 液體靜置培養(yǎng)法 此法適于一般菌苗的生產(chǎn)，培養(yǎng)容器可用大玻瓶也可用培養(yǎng)罐(或稱發(fā)酵罐)，按容器的深度，裝入適量培養(yǎng)基，一般是容器深度的1223為宜，經(jīng)高壓蒸汽滅菌之后，冷至室溫接入細(xì)菌種子，保持適宜溫度靜置培養(yǎng)。 （3）液體深層通氣培養(yǎng)法 使用培養(yǎng)罐（反應(yīng)缸），帶有攪拌器和通氣系統(tǒng)，或自動(dòng)控制裝置，用人工控制培養(yǎng)溫度和通氣量。培養(yǎng)基與佐劑（氫氧化鋁膠、油佐劑等）均可在缸內(nèi)消毒，在缸內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)及滅活、加佐劑配苗與分裝等，可大量生產(chǎn)出質(zhì)量較好的菌苗。大量培養(yǎng)細(xì)菌的方法第48頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（1） 單層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

32、是在轉(zhuǎn)鼓條件下發(fā)展起來的，專用于大量生產(chǎn)細(xì)胞的一種設(shè)備，能自動(dòng)調(diào)溫、調(diào)速和報(bào)警，靠一臺(tái)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)瓶架分上、中、下幾層，每層可放一排1萬1.5萬m1的轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)瓶是擱置在滾軸上，以每小時(shí)915轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)。國(guó)際上普遍使用無毒塑料轉(zhuǎn)瓶，直徑為1520cm，長(zhǎng)度為3080cm，多為一次性使用。工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第49頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（2） 培養(yǎng)罐培養(yǎng) 培養(yǎng)罐罐體結(jié)構(gòu)均為不銹鋼質(zhì)，可以自動(dòng)調(diào)溫、調(diào)pH值，用無級(jí)馬達(dá)、磁攪拌、消泡、控制氧壓、自動(dòng)補(bǔ)液、換液、自動(dòng)高壓滅菌、自動(dòng)計(jì)算呼吸商等。深層懸浮培養(yǎng)法能控制一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件，可大規(guī)模生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)物

33、可通過高速離心棄去培養(yǎng)液，使病毒更加純凈，可減少異性蛋白質(zhì)的含量。工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第50頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（3）微載體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) 微載體的直徑在60250 m，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。此法兼有懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)，容易大量培養(yǎng)細(xì)胞，特別是適合那些不能被懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞和原代細(xì)胞。工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第51頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（4） 生物反應(yīng)器 反應(yīng)器控制系統(tǒng)由高性能、智能化的微機(jī)控制儀及附屬功能電路和器件所組成，實(shí)現(xiàn)了空氣、氧氣、氮?dú)?/p>

34、和C02氣體與pH值、溶氧的關(guān)聯(lián)控制，能準(zhǔn)確控制溫度、轉(zhuǎn)速、pH值、溶解氧濃度和液位。細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器可連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，隨時(shí)采樣觀察，生產(chǎn)效率提高200300，大大降低產(chǎn)品的成本；有完善的由計(jì)算機(jī)控制的檢測(cè)及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運(yùn)行的安全；體積小，減少了生產(chǎn)車間所需的凈化空間面積；自動(dòng)化程度高，大大降低了污染率。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法第52頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 3.1、 滅活劑（1） 甲醛溶液 （福爾馬林） 常用的甲醛溶液約含37%甲醛氣體（重量計(jì)），為強(qiáng)還原劑，能與微生物蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合，形成具有其它性質(zhì)的化合物，而擾亂微生物的代謝，適當(dāng)濃度可使

35、微生物喪失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于滅活細(xì)菌的濃度為0.1%0.8%，用于滅活病毒時(shí)濃度為0.05%0.2%。必要時(shí)在甲醛滅活后加入焦亞硫酸鈉以終止反應(yīng)。（2） 烷化劑類 為一類含有烷基分子去一個(gè)氫原子的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，其滅活作用主要是烷化病毒DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)，防礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂，使病毒完全喪失感染力，但不損傷保護(hù)性抗原，廣泛用于病毒的滅活。常用的為BEI和AEI。3、滅活工藝第53頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（3）丙烯內(nèi)脂（BPL） 本品為無

36、色有刺激氣味的液體，對(duì)皮膚、粘膜有強(qiáng)刺激性，并具有致癌性。水中溶解度37（V/V），能與丙酮、醚和氯仿混合。吸入空氣中的水分子時(shí)緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于48C保存較穩(wěn)定。（4）硫柳汞鈉鹽 又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，本品為劇毒品，能溶于水和醇，在空氣中穩(wěn)定，在日光下不穩(wěn)定。對(duì)細(xì)菌、霉菌和病毒有一定的滅活作用，用于滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，常用終濃度為0.02%0.01%。3.1、 滅活劑第54頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四（5）苯酚 又名石炭酸，為羥基與芳烴族（苯環(huán)與稠丙環(huán)）直接連接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。本品有

37、毒、腐蝕性及特殊氣味，其滅活機(jī)制是使微生物蛋白質(zhì)變性和抑制特異酶系統(tǒng)，使其失去活性或感染性。常作為細(xì)菌滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，用量為0.30.5%。（6）結(jié)晶紫 別名甲基青蓮或甲紫，為一種堿性染料，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰電的羥基形成弱電力的化合物，防礙微生物的正常代謝，也可擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢(shì)太高，不利于微生物的增殖。3.1、 滅活劑第55頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）物理滅活方法 有熱滅活、射線照射滅活和超聲波裂解等方法。采用熱滅活方法牛副結(jié)核滅活疫苗和草魚出血病滅活疫苗。超聲波裂解應(yīng)放冰浴中間斷

38、進(jìn)行，以免升溫過高影響微生物的抗原性。60Co照射處理，應(yīng)根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離和劑量。2）化學(xué)滅活方法 早在20世紀(jì)初，就開始用甲醛減毒制備破傷風(fēng)類毒素，之后有用甲醛或苯酚滅活制成犬瘟熱疫苗。20世紀(jì)30年代，用結(jié)晶紫成功地研制出豬瘟疫苗。1957年，采用丙烯內(nèi)脂研制成功了口蹄疫滅活疫苗等。3.2、滅活方法第56頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四4.1、佐劑作用 對(duì)抗原的作用 佐劑吸附抗原后增加抗原的表面積，并改變活性基因的構(gòu)型，因而增強(qiáng)抗原的免疫原性；佐劑和抗原被巨噬細(xì)胞吞噬，對(duì)抗原加工處理，賦予較強(qiáng)的免疫原性，增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞的協(xié)同作用；

39、延長(zhǎng)抗原在組織內(nèi)的貯存時(shí)間，是抗原緩慢降解和緩慢釋放。4、佐劑配制第57頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四對(duì)機(jī)體的作用 引起巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)其繁殖，增強(qiáng)其活性；加速淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化成效應(yīng)細(xì)胞；增加細(xì)胞膜的活性和胞漿變化，分泌輔助性因子；改變細(xì)胞功能，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為數(shù)量增多、膜表面積增大、產(chǎn)生大量輔助因子和前列腺素等調(diào)節(jié)因子，T細(xì)胞和B細(xì)胞表現(xiàn)為數(shù)目增多、進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，膜表面成分發(fā)生改變，產(chǎn)生大量輔助因子（LK），B細(xì)胞則分化為漿細(xì)胞，分泌大量的抗體。4.1、佐劑作用第58頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四無致癌或輔

40、助致癌作用，不能誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤形成；無毒性，純度高，注射、口服等對(duì)動(dòng)物安全，無任何毒、副作用；符合相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；具有一定的吸附力；能在動(dòng)物體內(nèi)降解吸收，不易在組織中長(zhǎng)期存留而誘發(fā)組織損傷；不誘發(fā)自身超敏反應(yīng)及與血清抗體結(jié)合形成有害的免疫復(fù)合物；不含有與動(dòng)物發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原物質(zhì)；性能穩(wěn)定，佐劑抗原混合物儲(chǔ)存后不分解、不變質(zhì)、不產(chǎn)生有害物質(zhì)。4.2、佐劑標(biāo)準(zhǔn)第59頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）不溶性鋁鹽佐劑 包括氫氧化鋁膠、各種明礬和磷酸鋁等，與抗原混合后成為凝膠狀態(tài)，注射動(dòng)物后可較長(zhǎng)期存留在機(jī)體內(nèi)，持續(xù)釋放抗原，顯著提高抗體滴度。 這類佐劑在獸用生物制品中廣

41、泛采用，規(guī)程現(xiàn)有的滅活疫苗中大多數(shù)用氫氧化鋁膠作為佐劑，如牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗等。鋁膠的質(zhì)量對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量有直接影響，因此規(guī)程中明確規(guī)定了氫氧化鋁膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4.3、佐劑的類型第60頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 早期有弗氏佐劑，以羊毛脂為乳化劑，具有親油親水性，乳化作用較好，但制出的乳劑非常粘稠。國(guó)外所用的油佐劑中廣泛采用的是礦物油和縮水甘露醇單油酸酯（Arlacel A）。國(guó)內(nèi)廣泛選用注射白油、司本-80和吐溫-80作為油佐劑。 規(guī)程中明確規(guī)定了注射白油（輕質(zhì)礦物油）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，要求其性狀（相對(duì)密度、粘度）、酸度、重金屬、鉛、砷、稠環(huán)芳烴

42、、固形石蠟及易碳化物等項(xiàng)檢驗(yàn)均應(yīng)符合規(guī)定。 乳化劑不同、礦物油不同、乳化劑配合比例不同及乳化方法不同，均影響著乳劑的性狀和穩(wěn)定性。目前常用的劑型為油包水和水包油包水型。2）油佐劑第61頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四3）蜂膠佐劑 蜂膠是蜜蜂采集植物分泌的樹脂，混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉和其他一些有機(jī)與無機(jī)物的一種天然物質(zhì)，具有廣譜的生物活性。蜂膠作為疫苗佐劑需進(jìn)行純化，蜂膠佐劑具有良好的免疫增強(qiáng)作用，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力。4.3、佐劑的類型第62頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期

43、四4）人工合成佐劑 研究最多的屬胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、海藻糖合成衍生物，已合成了多種MDP的類似物和衍生物，這類佐劑和抗原形成油包水乳劑，接種動(dòng)物具有有效的佐劑活性，但作為水溶液接種動(dòng)物后，迅速排出，其佐劑活性受到限制。海藻糖合成衍生物有海藻糖-6，6-雙霉菌酸酯（TDM），又稱索狀因子，最初從分枝桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。TDM有多種生物學(xué)活性，抗感染和抗腫瘤。4.3、佐劑的類型第63頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四5）微生物及其代謝產(chǎn)物佐劑 為細(xì)菌的菌體成分，具有明顯的佐劑作用。如革蘭氏陰性菌外膜脂多糖（LPS）、分枝菌的胞壁成分、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸（LTA

44、）、蛋白毒素等。 6）免疫刺激復(fù)合物佐劑（ISCOM） 是由兩歧性抗原與Quil A和膽固醇1：1：1的分子混勻共價(jià)結(jié)合而成的一種較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。Quil A是從皂樹皮提取的一種糖苷，純化的Quil A能與病毒被膜蛋白或細(xì)菌和寄生蟲的外膜蛋白的疏水基結(jié)合。ISCOM現(xiàn)已廣泛用于多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲病的疫苗。 4.3、佐劑的類型第64頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四7）細(xì)胞因子類佐劑 多種細(xì)胞因子是有效的免疫增強(qiáng)劑，能增強(qiáng)由病毒、細(xì)菌和寄生蟲疫苗產(chǎn)生的保護(hù)作用。這類細(xì)胞因子主要有白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-1、-干擾素及白細(xì)胞介素-12。8）其它佐劑 這類佐

45、劑主要有非離子阻斷共聚物表面活性劑、核酸及其類似物佐劑和左旋咪唑等。 4.3、佐劑的類型第65頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 1）用鋁膠作佐劑 配苗時(shí)，將滅活的菌液和氫氧化鋁膠以一定的比例（3：19：1）混合，再加入適量的硫柳汞和苯酚充分振蕩而成。用明礬作佐劑配苗時(shí)，按滅活的菌液量加入明礬溶液12，充分振蕩，然后沉淀而成。2）用油佐劑配苗，以白油、司本和硬脂酸鋁為油相，以含24%吐溫的抗原液為水相，按水相與油相1：11：4（V/V）的比例配制。在膠體磨或乳劑缸內(nèi)配制成油包水或水包油包水疫苗。3）蜂膠作佐劑 配苗時(shí)，在滅活的抗原液（病毒液或菌液）中加入蜂膠乙醇浸液，

46、使每ml抗原液中含蜂膠10mg，變加變振蕩，成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。4.4 制苗工藝第66頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 弱毒活疫苗是用人工培育的弱菌（毒）株或自然弱（無）毒菌（毒）株或異種菌（毒）株或基因工程弱毒疫苗株生產(chǎn)的，對(duì)原宿主動(dòng)物無致病性或引起亞臨床感染，但能使接種動(dòng)物產(chǎn)生免疫力，以抵抗由該種病原引起的疾病。弱毒疫苗又稱活疫苗，大多數(shù)采用冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)成凍干疫苗，少數(shù)為液體（濕）疫苗。弱毒疫苗具有用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。 （二）活疫苗制備技術(shù)第67頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1.1、 菌種的選

47、育1） 自然弱毒菌株 自然界中存在著具有免疫原性的自然弱毒株，可以用于生產(chǎn)活疫苗。如布魯氏菌病豬2號(hào)株就是自然界中存在的弱毒株，已成功地用于制作活疫苗。2） 人工傳代致弱菌株 在培養(yǎng)基中或非宿主體內(nèi)等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗。如致弱的兔、山羊、綿羊牛傳染性胸膜肺炎菌株、布魯氏菌羊型5號(hào)菌株、乳兔肺致弱的豬支原體肺炎疫苗株等。1、菌（毒）種的選育第68頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四3） 改變培養(yǎng)環(huán)境致弱菌株 在體外培養(yǎng)傳代病原菌時(shí)，某些突變株在正常環(huán)境中不易生長(zhǎng)發(fā)育而死亡，但改變培養(yǎng)溫度（提高或降低），或在培養(yǎng)基中加入有抑制病原的化學(xué)物質(zhì)，有利于某些突

48、變株的發(fā)育，如在培養(yǎng)基中加醋酸鉈分離培育出了抗醋酸鉈的豬副傷寒沙門氏菌和馬流產(chǎn)沙門氏菌弱毒菌株。4） 誘變菌株 射線處理病原微生物或在體外的培養(yǎng)基中加入化學(xué)誘變劑，都能提高微生物的突變率，從而有助于弱毒株的培育。如用黃色素培養(yǎng)基培育豬丹毒弱毒菌株。許多疫苗的溫度敏感株（ts）都經(jīng)過誘變選擇的。1.1、 菌種的選育第69頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 1） 自然弱毒株 選用自然界中具有免疫原性的天然弱毒株，可以用于生產(chǎn)動(dòng)物用活疫苗。如NDVLa Sota株和B1株，雞馬立克氏病血清II型（SB1、Z4）毒株，已成功地用于制作活疫苗。2） 同屬異種的微生物 選擇與病原

49、同屬不同種，但具有一定的交叉免疫原性，天然宿主不同的微生物株系作為疫苗株，如火雞皰疹病毒預(yù)防雞馬立克氏病，山羊痘細(xì)胞致弱毒株預(yù)防綿羊痘和羊接觸傳染性膿皰皮炎等。1.2、毒種的選育第70頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四3） 人工傳代致弱毒株 在培組織或細(xì)胞培養(yǎng)中、雞胚內(nèi)或非宿主體內(nèi)等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗，如豬瘟活疫苗。4） 基因工程疫苗株的構(gòu)建 利用基因工程技術(shù)改造微生物，構(gòu)建基因工程弱毒活疫苗株。1）基因缺失疫苗株 2）重組載體疫苗株。1.2、毒種的選育第71頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1） 免疫抑制試驗(yàn) 當(dāng)疫苗毒可

50、能存在免疫抑制作用時(shí)，如雞傳染性法氏囊病、豬繁殖與呼吸綜合癥等，應(yīng)對(duì)毒種進(jìn)行免疫抑制試驗(yàn)。靶動(dòng)物接種菌（毒）種后，與未接種的動(dòng)物同時(shí)觀察免疫器官或組織的變化，或同時(shí)再免疫接種其它疫苗，觀察兩組的疫苗抗體產(chǎn)生情況和/或抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)情況。1.3、菌（毒）種的鑒定第72頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四2） 毒力返強(qiáng)試驗(yàn) 用基礎(chǔ)菌（毒）種較早代次，按實(shí)際接種途徑大劑量接種各種最易感日齡的靶動(dòng)物，一定時(shí)間后，采集含菌（毒）靶組織制成懸液，再接種另一組易感的靶動(dòng)物，如此至少傳5代次，觀察每次傳代動(dòng)物的反應(yīng)情況，并比較第一代和最后一代動(dòng)物的反應(yīng)和毒力或致病性增強(qiáng)的趨勢(shì)情況。1

51、.3、菌（毒）種的鑒定第73頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四禽源種毒1) 雞胚接種檢查法 將種毒中和后分別經(jīng)尿囊腔和絨毛尿囊膜途徑接種911日齡的SPF雞胚10枚，雞胚應(yīng)發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，雞胚尿囊液對(duì)雞紅細(xì)胞凝集陰性。2) 雞接種檢查法 將種毒接種適宜日齡的SPF雛雞20只，點(diǎn)眼、滴鼻接種10頭份；肌肉注射100頭份，接種后21日，重復(fù)接種1次，第一次接種后42日采血，測(cè)定相關(guān)病原的抗體。觀察期間不應(yīng)由種毒引起的特異性局部或全身和呼吸道癥狀或死亡。3) 細(xì)胞接種檢查法 將種毒中和后接種CEF后，培養(yǎng)57日，不應(yīng)有特異的細(xì)胞病變（CPE）產(chǎn)生，并不應(yīng)出現(xiàn)吸附

52、紅細(xì)胞現(xiàn)象。此外禽白血病病毒的檢驗(yàn)（COFEL或ELISA）和REV（IFA）應(yīng)為陰性。3） 外源病毒檢驗(yàn)第74頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四非禽源種毒 1) 熒光抗體檢查法 先用相應(yīng)的陽性血清中和種毒后，接種細(xì)胞連傳2代，視被檢的種毒不同，選用不同的細(xì)胞和不同的熒光抗體。經(jīng)熒光抗體染色后，不應(yīng)出現(xiàn)特異的熒光。2) 綠猴腎(vero)傳代細(xì)胞檢查法 將中和后的接種vero細(xì)胞，連傳2代，不應(yīng)出現(xiàn)CPE，同時(shí)進(jìn)行紅細(xì)胞（豚鼠、雞和人紅細(xì)胞混合物）吸附試驗(yàn)和熒光抗體試驗(yàn)，均應(yīng)為陰性。3) 致細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)檢查法 經(jīng)接種傳代培養(yǎng)7日的細(xì)胞，用適宜染色液對(duì)細(xì)胞單

53、層進(jìn)行染色，檢查后不應(yīng)出現(xiàn)包涵體、巨細(xì)胞或其它由外源病原引起的CPE。此外不應(yīng)出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。3） 外源病毒檢驗(yàn)第75頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）SPF雞或雞胚 所有禽用病毒性活疫苗及其種毒制備所用的雞胚必須符合獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，即必須來源于SPF雞。生產(chǎn)禽用疫苗用SPF雞應(yīng)在隔離環(huán)境中飼養(yǎng)，使用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)的無菌飼料。必須經(jīng)17種病原（13種病毒，2種細(xì)菌，2種支原體的檢測(cè)，結(jié)果陰性方可使用。2）試驗(yàn)動(dòng)物 當(dāng)采用動(dòng)物及其動(dòng)物組織生產(chǎn)病毒性活疫苗時(shí)，要求制苗用動(dòng)物應(yīng)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的來源、品種、品系不同、動(dòng)物級(jí)別不同和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，分開飼養(yǎng)，飼喂質(zhì)

54、量合格的全價(jià)飼料。2、制苗用主要原材料第76頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 2008年1月1日起，農(nóng)業(yè)部將對(duì)GMP疫苗生產(chǎn)企業(yè)疫苗菌(毒)種制備與鑒定、活疫苗生產(chǎn)以及疫苗檢驗(yàn)使用無特定病原體(SPF級(jí))雞、雞胚情況進(jìn)行全面監(jiān)督檢查。對(duì)達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)要求的，將根據(jù)獸藥管理?xiàng)l例規(guī)定進(jìn)行處理。農(nóng)業(yè)部關(guān)于加強(qiáng)獸用生物制品生產(chǎn)檢驗(yàn)原料監(jiān)督管理的通知 (2006.11.22 農(nóng)醫(yī)發(fā)2006l0號(hào)令)第77頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四血清、化學(xué)試劑和生物制劑 細(xì)胞培養(yǎng)用血清能提供人工合成培養(yǎng)液必須的物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞附著和保護(hù)有明顯的作用，各種動(dòng)物的血清都

55、能應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)室常用新生犢牛血清，既可大量采集，又有良好的細(xì)胞培養(yǎng)效果。也可應(yīng)用馬血清、大牛血清、綿羊血清或雞、兔血清等。用成年動(dòng)物血清培養(yǎng)細(xì)胞，效果大都不如犢牛血清，常含有抗病毒抗體或其它抑制病毒的物質(zhì)，抑制病毒的生長(zhǎng)。3）其它原材料第78頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）制苗用菌液的制備 液體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基量的一定比例接入二級(jí)種子菌液，在37C左右搖動(dòng)培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，當(dāng)菌液混濁或pH下降時(shí)，停止培養(yǎng)，冷卻后收獲菌液或離心后收獲菌泥，適當(dāng)稀釋后置28C保存?zhèn)溆?。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，將檢驗(yàn)合格的二級(jí)種子接種于瓊脂培養(yǎng)基上布勻，置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，經(jīng)檢查合格后加

56、入穩(wěn)定劑將菌苔洗下，過濾，28C靜置沉淀。2）制苗用病毒液的制備 將一定量的生產(chǎn)毒種接種動(dòng)物、組織、雞胚或細(xì)胞，每天觀察接種動(dòng)物的反應(yīng)，接種雞胚的觀察雞胚的死亡或感染情況，接種細(xì)胞的既可靜止培養(yǎng)，也可轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變，待病毒繁殖充分后收獲含毒器官、組織或含毒細(xì)胞液，收獲的含毒組織或細(xì)胞液。3、疫苗原液的繁殖第79頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）液體（濕）苗的配制 疫苗原液或半成品檢驗(yàn)合格后，將菌（毒）液混合，按規(guī)定頭份定量分裝，每頭份疫苗不得低于規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn)。 2）凍干苗的配制 按疫苗原液量加入一定比例的保護(hù)（穩(wěn)定）劑，病毒性組織苗需預(yù)先制成乳劑后，

57、加入一定比例的保護(hù)（穩(wěn)定）劑，充分混合后，按規(guī)定頭份定量分裝，分裝過程中應(yīng)隨時(shí)振搖，分裝結(jié)束后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥。凍干后在真空狀態(tài)下在凍干柜內(nèi)自動(dòng)壓塞，出箱后壓上鋁帽。4、疫苗配制與凍干第80頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）凍干疫苗保護(hù)劑（穩(wěn)定劑） 防止疫苗在凍干過程中活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶；保護(hù)微生物中活性物質(zhì)的活性與抗原性；降低細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差；保持弱毒疫苗中微生物在干燥狀態(tài)下的活力和復(fù)蘇時(shí)迅速恢復(fù)活力；對(duì)疫苗的免疫效果無影響；對(duì)微生物的保護(hù)性能（尤其是耐熱性能）良好；凍干產(chǎn)品的物理性狀（外觀、色澤、溶解性等）符合要求。常用的有：5%蔗糖

58、（乳糖）脫脂乳、明膠蔗糖、40%蔗糖明膠、聚乙烯吡咯烷酮乳糖和SPGA。2）液體疫苗保護(hù)劑 甘油 甘油作為保護(hù)劑廣泛用于活疫苗，如50甘油鹽水，可以殺滅大多數(shù)細(xì)菌，而病毒卻可存活 二甲基亞砜（DMSO） 二甲基亞砜可以減少冷凍過程中微小冰晶的形成，因而保護(hù)冷凍的病毒。5、疫苗保護(hù)劑第81頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四不同微生物保護(hù)劑的主要成分微生物類型凍干保護(hù)劑主要成分細(xì)菌10%蔗糖、5%蔗糖脫脂乳、5%蔗糖、1.5%明膠；1020%脫脂乳、含1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳；5%牛血清白蛋白的蔗糖；滅活馬血清等厭氧菌含0.1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳，10 %脫脂乳，7

59、.5%葡萄糖血清等病毒常用下列物質(zhì)的不同濃度或按不同比例混合組成凍干保護(hù)劑：明膠、血清、谷氨酸鈉、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、乳酸鈣、海藻糖、硫脲等支原體50%馬血清、1%牛血清白蛋白、5%脫脂乳、7.5%葡萄糖馬血清等立克次體10%脫脂乳酵母菌馬血清或含7.5%葡萄糖馬血清、含1%谷氨酸鈉的10%脫脂乳等第82頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四 1、疫苗質(zhì)量中問題 弱毒活疫苗：凍干保護(hù)劑；毒力偏強(qiáng)；外源病原污染。 滅活疫苗:抗原繁殖、濃縮和純化技術(shù)落后，抗原純度不夠，副反應(yīng)太大；油佐劑滅活苗穩(wěn)定性差，副反應(yīng)大；

60、免疫效果差。 （三）疫苗質(zhì)量改進(jìn)新技術(shù)第83頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四1）分子設(shè)計(jì)與基因工程技術(shù) 亞單位疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、DNA疫苗轉(zhuǎn)基因植物疫苗等。2）抗原緩釋技術(shù) 將抗原制成聚合物，增加抗原效能、延長(zhǎng)疫苗免疫期。3）新型免疫佐劑 減少副反應(yīng)，提高細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。4）新型生物發(fā)酵技術(shù) 傳統(tǒng)的生物發(fā)酵罐變?yōu)樯锓磻?yīng)器，實(shí)現(xiàn)了程序化操作。5）現(xiàn)代細(xì)胞工程技術(shù) 利用細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。2、改進(jìn)新技術(shù)第84頁，共110頁，2022年，5月20日，10點(diǎn)15分，星期四獸用診斷制品中使用的微生物都具有抗原性，根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合或