乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測培訓(xùn)課件

1、乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測技術(shù)的評價三、需要重視的幾個問題2乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測2乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒學(xué)突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化學(xué)突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐藥（genotypic resistance） HBV表型耐藥（phenotypic resistance） 臨床耐藥（clinical resistance） 3乙型肝炎病毒核苷酸類

2、似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關(guān)定義 3乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒學(xué)突破（virologic breakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA水平與最低值相比上升或超過1個log10（10倍）。4乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義4乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義 病毒反跳（viral rebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治療前水平。 5乙型

3、肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義5乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義 生化學(xué)突破（biochemical breakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。6乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義 6乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV基因型耐藥（genotypic resistance）指HBV基因組中的某些位點發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐

4、藥性有直接因果關(guān)系，通過這些變異位點的檢測可判斷HBV有無耐藥性。 7乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義7乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV表型耐藥（phenotypic resistance）通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐藥 IC50 10倍:耐藥8乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義 HBV表型耐藥（phenotyHBV耐藥的有關(guān)定義 臨床耐藥

5、（clinical resistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBV DNA反跳，同時伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。 9乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義9乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測二、各種耐藥檢測技術(shù)及評價病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測10乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測二、各種耐藥檢測技術(shù)及評價10乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測基于對血清HBV DNA載量的動態(tài)監(jiān)測需重視以下三點： 1. HBV DNA載量檢測手段的敏感性 2.檢測技術(shù)的可靠性和

6、穩(wěn)定性 3.監(jiān)測的間隔時間11乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測11乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV基因型耐藥監(jiān)測時機非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用12乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV基因型耐藥監(jiān)測12乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測基因型耐藥相關(guān)變異的命名13乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測基因型耐藥相關(guān)變異的命名13乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢基因型耐藥相關(guān)變異在HBV多聚酶序列中的位置14乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測基因型耐藥相關(guān)變異在HBV多聚酶序列中的位置14乙型肝炎病HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法 直接測序 克隆測序聚合酶鏈

7、式反應(yīng)及限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）基因芯片技術(shù) 實時熒光定量PCR技術(shù) 探針定點突變PCR技術(shù) 引物末端堿基定點突變擴(kuò)增技術(shù) 熔解曲線法 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)15乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法15乙型肝炎病毒核苷直接測序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段

8、，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。簡便、快速、準(zhǔn)確可靠。安全、無放射性污染。模板用量大大減少。測序能力增強。 16乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測直接測序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測序自動化使用特異性引物HBV YMDD變異直接測序結(jié)果圖譜17乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV YMDD變異直接測序結(jié)果圖譜17乙型肝炎病毒核苷酸類直接DNA測序的局限性1. 設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費時。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%

9、時，由于競爭抑制作用不能被擴(kuò)增。直接測序法檢測HBV YMDD變異1.JPG18乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測直接DNA測序的局限性1. 設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費時。18克隆測序法19乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測克隆測序法19乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測克隆測序法優(yōu)點： 1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株 之間的相對比。 2.提高了檢測的靈敏度。局限性： 1.技術(shù)難度較高。 2.檢測周期更長。 3.檢測的費用大大增加。20乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測克隆測序法優(yōu)點：20乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測 堿基變異可能導(dǎo)致： 原有位點消失 產(chǎn)生新的位點 識別位點移

10、位 利用錯配引物使 PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生 特異的酶切位點結(jié)果: 酶切片段長、短變化和多、少變化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)21乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測 堿基變異可能導(dǎo)致：結(jié)果: 酶切片段長、短變化和多限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識別DNA的特異序列，并在識別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：Nde I限制酶的識別序列和切割位點：CA TATGGTAT ACNla Ill限制酶的識別序列和切割位點：CATG NNNGTAC NNN22乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識別DNA的特異序列，并在識別序PCR-RFLP檢測HBV YMD

11、D變異PCR錯配引物設(shè)計23乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異PCR錯配引物設(shè)計2PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異24乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異24乙型肝炎病毒核苷PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異25乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP檢測HBV YMDD變異25乙型肝炎病毒核苷PCR-RFLP技術(shù)的評價優(yōu)點： 簡單、廣泛易開展。缺點： 1.限制性內(nèi)切酶種類有限。 2.錯配引物將導(dǎo)致退火溫度降低、非特異條帶增多。 3.引物非完全匹配，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低、檢測 敏感的下降。 2

12、6乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP技術(shù)的評價優(yōu)點：26乙型肝炎病毒核苷酸類似物反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）27乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測反向雜交分析技術(shù)（INNOLiPA）27乙型肝炎病毒核苷酸INNOLiPA診斷HBV YMDD變異28乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測INNOLiPA診斷HBV YMDD變異28乙型肝炎病毒核DNA芯片技術(shù)BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarray fabricationSample preparationMolecula

13、r hybridizationDetection and analysis29乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測DNA芯片技術(shù)BiologicalAnalyze dataSDNA芯片技術(shù)診斷HBV YMDD變異Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.30乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測DNA芯片技術(shù)診斷H

14、BV YMDD變異Detection oDNA芯片技術(shù) 優(yōu)點 局限性 大通量 技術(shù)和設(shè)備的要求高 快速 檢測成本高 靈敏度高 可平行檢測 31乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測DNA芯片技術(shù) 優(yōu)點 局實時熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針引物末端堿基定點突變擴(kuò)增技術(shù)高分辨熔解曲線法32乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測實時熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點突變PCR技術(shù)-Taqman-MGB探針定點突變PCR技術(shù)33乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測Taqman-MGB探針定點突變PCR技術(shù)33乙型肝炎病毒核Taqman-MGB探針技術(shù)檢測YM

15、DD變異HBV DNA105copies/mlW:M=1:1HBV DNA105copies/mlW:M=10:1HBV DNA探針定點突變PCR技術(shù) 優(yōu)點 不足 靈敏度高 需要相對較貴的熒光PCR儀 特異性好 需要多條熒光探針，成本高 費時短 影響因素多，存在一定誤判35乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測探針定點突變PCR技術(shù)35乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測引物末端堿基定點突變擴(kuò)增技術(shù)36乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測引物末端堿基定點突變擴(kuò)增技術(shù)36乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥引物末端堿基定點突變擴(kuò)增技術(shù)檢測YMDD變異37乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測引物末端堿基定點突變擴(kuò)增

16、技術(shù)檢測YMDD變異37乙型肝炎病熔解曲線法檢測YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析38乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測熔解曲線法檢測YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)原理39乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS檢測HBV YMDD變異的原理酶切分子量.JPG40乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測MALDI-TOF MS檢測HBV YMDD變異的原理酶切基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALD I-TOF MS)優(yōu)點： 高靈敏

17、度、準(zhǔn)確度、分辨率 能發(fā)現(xiàn)相對比例小于1%的變異株。局限性： 設(shè)備昂貴，目前國內(nèi)難以用于臨床檢測。41乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALD I-TOF MSHBV耐藥不同檢測技術(shù)的比較Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-161Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures

18、of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a tests ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd

19、, not determined.42乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥不同檢測技術(shù)的比較Advances in MoleHBV表型耐藥檢測有兩種途徑：1.細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析。2.細(xì)胞藥物敏感性實驗。43乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV表型耐藥檢測有兩種途徑：43乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測培訓(xùn)課件細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析45乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析45乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的細(xì)胞藥物敏感性實驗該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗。目前多采用病毒載體將含有被檢測的含HBV變異位點的全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞源

20、性細(xì)胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后檢測細(xì)胞上清中的HBV DNA含量。 46乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實驗該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗。目前多采用病細(xì)胞藥物敏感性實驗47乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實驗47乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實驗該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。 48乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實驗該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需臨床耐藥監(jiān)測YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化49乙型肝炎病毒核苷酸類似物

21、耐藥的檢測臨床耐藥監(jiān)測YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化49乙型肝HBV MDD變異與病毒學(xué)突破50乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測HBV MDD變異與病毒學(xué)突破50乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐判斷臨床耐藥時的建議1. 結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結(jié)合基因變異位點。 51乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測判斷臨床耐藥時的建議1. 結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載三、需要重視的幾個問題慎重對待天然耐藥的結(jié)論。不要過分依基因型耐藥檢測技術(shù)。正確對待基因分型技術(shù)。 52乙型肝炎病毒核苷酸類似物耐藥的檢測三、需要重視的幾個問題慎重對待天然耐藥的結(jié)論。52乙型肝炎病YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)Akarsu M等采用InnoLipa 法檢測71例未經(jīng)抗病毒的成年慢性乙肝攜帶者，結(jié)果有13例檢測到Y(jié)MDD變異株。Lee CZ等采用引物末端堿基定點突變擴(kuò)增技術(shù)對28例拉米夫定治療前的CHB患