血凝抑制實(shí)驗(yàn)

1、摘要：目前在禽流感血凝抑制試驗(yàn)方面存在很多問題，會對血凝抑制試驗(yàn)的意義造成影響從而導(dǎo)致不正確的結(jié)果；禽流感抗原也存在相的差異，在實(shí)際檢測中也容易出現(xiàn)誤導(dǎo)。關(guān)鍵詞： 血凝抑制 相的差異 標(biāo)定Problems in Hemagglutimation Inhibition Test with Avian InfluenzaLiu Ping , Liu Dong , Li Bin , Wang QunYi ,Huan XiuRong,Wang ZongSheng ，F(xiàn)an GenCheng, Du YuanZhaoQingdao YEBIO Bioengineering Co,National Ani

2、mal QuarantineInstitute ,Ministry of Agriculture ,Qindao ShandongAbstract:Quite a few problems exist with regard to hemagglutinationtest with avan influenza,affecting HI test meanings and leading towrong results.Phase variation exists in avian influanzaantigen,causing mistakes in practical operation

3、 of HI test.Keywords: Hemagglutination inhibition,phase variation,standardization禽流感病毒能夠與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象，這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)（HI）。由于血凝反應(yīng)可被特異性抗體所抑制，抗體與病毒結(jié)合后，血凝素不能吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，因此血凝抑制試驗(yàn)可以用于：1）檢測血清中的抗體水平。2）鑒定病毒。3）輔助診斷病毒性疾病。4）作為適時(shí)免疫的輔助手段，能避免免疫失敗、免疫空擋及重復(fù)免疫造成的損失。目前在禽流感血凝抑制試驗(yàn)方面存在很多問題，會對血凝抑制試驗(yàn)的意義造成影響從

4、而導(dǎo)致不正確的結(jié)果。一、 由于禽流感病毒變異較快，所以在血凝抑制試驗(yàn)中經(jīng)常會出現(xiàn)不同廠家生產(chǎn)的相同亞型的禽流感抗原所測同一血清的血凝抑制價(jià)不同，禽流感亞型病毒株按其血凝抑制試驗(yàn)中所表現(xiàn)的親和力不同而分為三種類型：對本株和異株免疫血清均呈較高效價(jià)的為“R”相；對本株效價(jià)高對異株低的為“P”相；對本株及異株均低的為“Q”相。由此可見養(yǎng)殖戶經(jīng)常反映的打你們廠家的疫苗去別的地方檢測結(jié)果往往會很低，這就是我們所說的“P”相，即抗原相的差異。如果在試驗(yàn)中出現(xiàn)相的差異所測結(jié)果會相差2-3個(gè)滴度，所以在血凝抑制試驗(yàn)操作時(shí)，挑選親和相毒株作為測定抗原較好，這樣會提高診斷的靈敏度(如下表)。對禽流感毒株進(jìn)行抗原分

5、析時(shí)，必須采用交叉的血凝抑制試驗(yàn)，而不能采用單向的血凝抑制測定，以排除相別的影響。同一血清用不同抗原檢測的結(jié)果血清2626二、 禽類血清中往往含有非特異性血凝抑制因子，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)會出現(xiàn)對照孔和對照孔后 2-3 孔有凝集現(xiàn)象。因此，在利用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行血清抗體測定之前，有必要對血清中非特異性因子進(jìn)行排除。熱滅活是一種排除非特異性因子的有效方法，但對特異性抗體破壞較大。利用受體裂解酶處理血清在美國禽流感診斷中已廣泛應(yīng)用。但經(jīng)過我們大量的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水禽血清在經(jīng)過受體裂解酶處理后有明顯的差異，而雞的血清卻沒有明顯差異，所以在做血凝抑制試驗(yàn)時(shí)可對水禽血清用受體裂解酶進(jìn)行處

6、理，雞血清不作處理結(jié)果影響不大。三、在禽流感血凝抑制試驗(yàn)中抗原標(biāo)定也是至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。首先在試驗(yàn)之前要對禽流感抗原用已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行標(biāo)定，以確定抗原的純度。抗原配制完后，需對所配制的抗原進(jìn)行標(biāo)定，看所配制的抗原是否達(dá)到所需標(biāo)準(zhǔn)，如工作抗原效價(jià)過高或過低對結(jié)果都有一定的影響。過高，測定抗體效價(jià)偏低；過低，測定效價(jià)過高，甚至很高。所以在禽流感血凝抑制試驗(yàn)中必須對抗原進(jìn)行標(biāo)定。四、在進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，所以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要嚴(yán)格操作，每次測定應(yīng)有嚴(yán)格的溫度范圍和作用時(shí)間，出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)要認(rèn)真查找原因，以免類似錯(cuò)誤再次出現(xiàn)。另外，所用抗原應(yīng)是穩(wěn)定性好，效價(jià)高的濃縮抗原。以下是容易出現(xiàn)

7、的錯(cuò)誤：1.對照孔凝集 鹽類凝集：所謂鹽類凝集即稀釋液中氯化鈉達(dá)至一定高濃度時(shí)，即使沒有血清抗體也能發(fā)生凝集反應(yīng)。 當(dāng)生理鹽水被細(xì)菌污染時(shí)也可出現(xiàn)對照孔凝集。 血清變質(zhì)或受細(xì)菌污染。2.全部凝集 當(dāng)紅細(xì)胞受細(xì)菌污染或保存時(shí)間過長可出現(xiàn)此現(xiàn)象。 抗原滴加時(shí)出現(xiàn)失誤，工作抗原效價(jià)過高。 生理鹽水受細(xì)菌污染或其它因素.3、 紅細(xì)胞全部下滑當(dāng)配制抗原時(shí)，配制工作抗原效價(jià)過低，不足以凝集雞紅細(xì)胞。加樣時(shí)所有孔全部加成生理鹽水亦出現(xiàn)全部下滑現(xiàn)象。4、不同來源、不同濃度的紅細(xì)胞會使結(jié)果差異很大，所以紅細(xì)胞來源一定要相同：一般需要 3 只或 3 只以上公雞來提供紅細(xì)胞，將 3 只以上公雞紅細(xì)胞混合在一起。也可

8、由 1 只公雞來提供紅細(xì)胞，但必須經(jīng)臨床多次使用證明是可行的。有抗體雞提供的紅細(xì)胞需要更多次數(shù)洗滌。但要注意有時(shí)不同的公雞提供的紅細(xì)胞對禽流感 H5 亞型抗體測定，效價(jià)差異很大。不同濃度的紅細(xì)胞對抗體測定也有影響。5、溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有影響，一般要求在室溫 25-37進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度低于 4時(shí)紅細(xì)胞有時(shí)會發(fā)生自凝現(xiàn)象。6、抗原與抗體作用時(shí)間過長或過短對結(jié)果影響較大：過短出現(xiàn)凝集不完全；過長出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。7、96 孔 V 型板是否洗凈，是否光滑也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？傊谶M(jìn)行禽流感血凝抑制試驗(yàn)時(shí)應(yīng)綜合考慮各方面因素，制定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化操作方法以免對結(jié)果判斷產(chǎn)生誤差，只有把試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化才能正確評價(jià)疫苗免疫存在的意義。新技術(shù)員必看血凝抑制試驗(yàn)易出的問題發(fā)布時(shí)間：2011-01-06114 個(gè)44個(gè)4個(gè)1微24413 4個(gè)4個(gè)423454種 4個(gè)個(gè)3微升234個(gè)68當(dāng)811x8183只按值31淺談血凝抑制試驗(yàn)中存在的問題及解決方法(如新城疫、禽流感病毒等) (HI)1. 42. 33.4.4(HAU)4個(gè) 4 4個(gè)抗原配制不準(zhǔn)確. 4 4 4-6 第3 4 1%1-5 1 50% 4 4個(gè) 4 4 1 4 2-83天內(nèi)效價(jià)基本無變化，1 2-83 34 1 4 16. 2025 20 15 20257