-PCR相關(guān)資料課件

1、 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 目錄 PCR定義 PCR發(fā)展簡史 PCR技術(shù)原理、工作原理 工作步驟 PCR的反應(yīng)特點(diǎn) PCR的主要作用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法PCR定義聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診

2、斷或任何有DNA、RNA的地方。PCR發(fā)展簡史人類對于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。1985年，美國科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得

3、到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR發(fā)展簡史最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué)分析的根本性基石。由于PCR方法被不斷改進(jìn)，它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長達(dá)幾十個(gè)kb的D

4、NA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。PCR工作原理PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至9095一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至5560，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與

5、半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，13小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。工作步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步： 94（預(yù)變性）4min 94（變性）4min 36（退火）1min 72（延伸）1.5min 72（延伸）5min 4保存PCR的反應(yīng)特點(diǎn) 特異性強(qiáng) 靈敏度高 簡便、快速 對標(biāo)本的純度要求低 PCR的主要作用1、基礎(chǔ)研究方面應(yīng)用 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子 ；克隆基因； 基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究；基因組測序 ；制備單鏈模板 。2、PC

6、R在臨應(yīng)上的應(yīng)用 檢測病原體； 在基因分型中的應(yīng)用 ； 在遺傳學(xué)上的應(yīng)用 ； 在腫瘤研究中的應(yīng)用 3、在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別； 親子鑒定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強(qiáng)弱的變化來即時(shí)分析目的基因的拷貝數(shù)目，通過與加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺期。標(biāo)本的運(yùn)送 標(biāo)本采集后，應(yīng)盡快送至檢測實(shí)驗(yàn)室。采集后的所有樣本在送至實(shí)驗(yàn)室之前，均應(yīng)暫放在28臨時(shí)保存。靶核酸為DNA的標(biāo)本，如為無菌條件下采

7、集，可在室溫下8小時(shí)內(nèi)運(yùn)送。靶核酸為RNA的標(biāo)本，短時(shí)間內(nèi)的運(yùn)送（如10min左右），可在室溫下運(yùn)送；如時(shí)間較長，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送。如在標(biāo)本中加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑（如GITC）的血標(biāo)本，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。靶核酸為RNA的標(biāo)本，采集后建議在4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本運(yùn)送過程中應(yīng)充分考慮生物安全問題。有合適的容器轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本，帶蓋的透明轉(zhuǎn)運(yùn)盒，有生物危害標(biāo)識。標(biāo)本的驗(yàn)收采樣質(zhì)量評價(jià)血清（漿）標(biāo)本：體積不少于2ml。觀察是否溶血、脂血、黃疸及其程度。嚴(yán)重溶血：血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴(kuò)增效率明顯降低。嚴(yán)重黃疸：膽紅素可抑制Taq酶活性。脂血：低密度脂蛋白對熒光有屏蔽和吸收作

8、用，故對Real Time PCR有干擾。從細(xì)胞組成、所需類型細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行評價(jià)泌尿生殖道分泌物標(biāo)本可以顯微鏡下觀察是否有上皮細(xì)胞存在。痰液標(biāo)本：體積不少于5ml。外觀規(guī)定膿樣、血性、干酪樣及膿性粘液樣痰為合格。鏡下用油鏡觀察白細(xì)胞大于10個(gè)。 閾值與CT值 熒光閾值 是指在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)（即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）。為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，首先需設(shè)定一個(gè)熒光信號的閾值，熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上認(rèn)為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上。一般熒光閾值設(shè)置為315個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。threshold = 10 SDcycle 3-

9、15 循環(huán)閾值（Ct） 即PCR擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。閾值線擴(kuò)增曲線S型曲線的四個(gè)特征性階段線性基線期：指PCR反應(yīng)處于起始階段。此階段，擴(kuò)增產(chǎn)物很少，所產(chǎn)生的熒光信號很低，反應(yīng)系統(tǒng)背景情況。指數(shù)擴(kuò)增期：指PCR達(dá)到最大的擴(kuò)增階段，理想條件下，每一循環(huán)后，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)倍增加。線性增長期：指PCR達(dá)到穩(wěn)定的線性擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物呈幾倍數(shù)增加。平臺期：由于原料消耗殆盡，擴(kuò)增減緩，熒光信號不再隨循環(huán)數(shù)增加而增加。PCR曲線擴(kuò)增對數(shù)圖PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與管理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為臨床基因診斷的主要手段，實(shí)驗(yàn)室分為三個(gè)區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)（第一區(qū)）、標(biāo)本

10、處理區(qū)（第二區(qū)）、擴(kuò)增分析區(qū)（第三區(qū)）。每一工作區(qū)配備專用的設(shè)備、儀器、輔助設(shè)施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標(biāo)識。各區(qū)標(biāo)簽顏色：紅色（第一區(qū)）、白色或綠色（第二區(qū)）、藍(lán)色（第三區(qū)）；專用工作服：粉紅色（第一區(qū)）、白色（第二區(qū)）、藍(lán)色（第三區(qū)）。標(biāo)本的接收則在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收處進(jìn)行。各工作區(qū)專用的儀器設(shè)備、辦公用品、工作服、實(shí)驗(yàn)耗材和清潔用具等，不可混用。各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務(wù)管理見各相關(guān)SOP文件。嚴(yán)格遵守從“試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本處理區(qū)擴(kuò)增分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進(jìn)入前一工作區(qū)。非本實(shí)驗(yàn)室工作人員，未經(jīng)許可不得入內(nèi) 。PCR實(shí)驗(yàn)室的儀器配置試劑貯存與準(zhǔn)備區(qū)：超凈工作臺、-20冰箱、微型離心機(jī)、混勻器、加樣槍（1-1000UL）、紫外線燈、消耗品、一次性手套、耐高溫處理的離心管及加樣槍器頭、專用工作服、專用辦公品、干濕溫度計(jì)等。標(biāo)本處理區(qū)：安全生物柜、高速臺式離心機(jī)、恒溫水浴或恒溫金屬?。?00 ）、離心機(jī)、紫外線燈、消耗品、一次性乳膠手套、耐高溫處理的離心管及加樣槍器頭、專用工作服、專用辦公品、干濕溫度計(jì)等。擴(kuò)增分析區(qū)：熒光擴(kuò)增儀與電腦、消耗品、專