當歸分子生藥學課件

1、當 歸當歸的RAPD分析分子標記在當歸研究中的應用當歸種質資源的研究 黃璐琦簡介 當歸（學名：Angelica sinensis），為傘形科多年生草本植物，在中國分布于甘肅、云南、四川、青海、陜西、湖南、湖北、貴州等地，各地均有栽培。當歸的根可入藥，是最常用的中藥之一。當歸多糖生物學功能的研究進展分子標記在當歸研究中的應用當歸生物技術的研究現狀與展望1. 分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序 列變異為基礎的遺傳標記 ,是DNA水平遺傳 多態(tài)性的直接反映。2. 應用于當歸植物遺傳多樣性分析的分子遺 傳標記主要有RFLP.RAPD.AFLP.ISSR.ITS等 一.分子標記在當歸植物遺傳多樣性研究

2、中的應用 隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)： RAPD技術建立在 PCR技術基礎上,用一系列(通常數百個)不同的隨機排 列堿基序列的寡核苷酸單鏈作為引物,對所研究的基因組DNA進行單引物擴 增. RAPD應用于當歸種質資源鑒定及遺傳多樣性等研究工作中. 擴增片段長度多態(tài)性(AFLP): AFLP是RFLP和PCR相結合的DNA分析技術,它結合了RFLP和RAPD的優(yōu)點，既具有前者的可靠性, 又具有后者的方便性.現已被廣泛應用于生物多樣性 ,指紋圖譜構建,遺傳圖譜構建,基因克隆等諸多領域. 當歸組織培養(yǎng)的研究現狀當歸生物技術研究的總體現狀 1.當歸組織培養(yǎng)的研究現狀: 國內有關當歸組織培養(yǎng)研究的

3、文獻始于1981年，在19812010年的30年間，共有文獻17篇. 目前，當歸生物技術的研究僅局限于當歸組織培養(yǎng)與DNA分子標記方面，其他如當歸發(fā)酵工程、酶工程及蛋白質工程，基因工程等生物技術的研究未見相關報道 2.國內當歸生物技術研究的總體現狀:s當歸RAPD 分析s當歸種子的RAPD 分析當歸道地性RAPD 分析當歸RAPD 反應條件的優(yōu)化s注: M 為DNA Marker; 1 6 分別是表1 中的1 6 號材料。下同 圖1 當歸種子基因組DNA 電泳圖譜 由圖1 可知，用改良CTAB 法提取的當歸種子基因組DNA 片段大小均在20 kb 左右，拖尾現象較少，DNA 降解少，完整性相對

4、較好，能夠滿足RAPD 反應對DNA 質量的要求。s圖2 RAPD 分析電泳圖譜圖2 可知，除了1 號樣品外，其余5 種材料均在250 bp 處有一特征性條帶。因此S 61（隨機引物） 可用于當歸的鑒別。118 為樣品編號圖218 個當歸樣品的RAPD 聚類系統(tǒng)圖s當歸藥材道地性的RAPD 分 對來自不同產地的18 個當歸樣品,提取其基因組DNA, 并進行RAPD 分析。s 圖2 比較直觀地表明絕大多數地理分布距離越近的樣品, 如13 之間, 57 之間, 9, 10 之間及1118 之間, 在聚類樹狀圖上的距離越近, 說明它們之間的遺傳背景差異越小。反之, 地理分布距離越遠的樣品, 如上述各

5、組之間, 在聚類樹狀圖上的距離越遠, 說明它們之間的遺傳背景差異越大。 RAPD 分子標記技術對揭示道地藥材與非道地藥材之間的地理生態(tài)遺傳的差異將是一種十分有效的手段。s當歸RAPD 反應條件的優(yōu)化 為了確定最優(yōu)的PCR 反應體系, 本試驗選取了反應成分中模板濃度、Mg2+ 、引物濃度、dN TPs 的濃度、Tag 酶用量5 個重要因子設計L16 ( 4) 5 正交試驗, 設計正交試驗因素水平表( 表1)s正交試驗結果及分析:上述L16 ( 4 ) 5正交表作PCR 擴增試驗, 結果見圖1。圖1 正交試驗的兩次重復s結果分析：R 值的大小反映了該因素對結果影響的大小, 從表2 中可以看出, 在

6、試驗范圍內, 5 個因子中以T aq 酶用量影響最大, 其次為dNT Ps 濃度, 模板濃度和引物濃度這兩項因子效應相差不大, MgCl2濃度影響最小。s 最后結果：5個試驗因子的最適條件為: 模板DNA 0. 5 ng/ LL, 引物0. 8 Lmo l/ L, dNT Ps 0. 25 mmol/ L, MgCl2 2. 5 mmo l/ L, Taq 酶0. 8 U。當歸主產區(qū)種質資源分析甘肅省 甘肅省是全國當歸種植面積最大的省份，近年來培育出“岷歸1號”、“岷歸2號”兩個新品系。云南省 鶴慶馬廠是云南當歸的道地產區(qū)，馬廠當歸也有“ 紫莖”和“綠莖”以“紫莖”種植面積占絕對優(yōu)勢, “綠莖

7、”極少見。四川省 四川省當歸種植區(qū)主要分布在北部的九寨溝縣、平武縣、寶興縣、漢源縣。湖北省 湖北省適合當歸的種植地方主要集中在恩施、利川、建始等地。當歸種質資源的RAPD分析 隨機擴增DNA 多態(tài)性( Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 技術已廣泛應用于中草藥種質資源遺傳多樣性及藥材道地性的研究中.盛麗等人對來自甘肅省不同產區(qū)所栽培的20 個當歸樣品進行了RAPD 分析, 對其遺傳多樣性和親緣關系進行了考證。1 RAPD多態(tài)性分析 從40 個隨機引物中篩選出7條譜帶清晰、多態(tài)性強并且重復性好的引物, 對供試的20份材料進行PCR擴增, 并對這7 個引

8、物的擴增結果進行統(tǒng)計分析(見表2）。 7條引物共擴增出82 個條帶, 不同引物的擴增帶數變幅為6-17 條, 平均每個引物可擴增出11.7 條帶, 82條DNA 擴增帶中, 58 條帶具有多態(tài)性, 占70.7%, 每個引物可擴增出5-11 條多態(tài)性帶, 平均為8.3 條.2.遺傳相似系數 用NTSYS- pc 統(tǒng)計分析軟件中的Dice 方法得到材料間的相似系數矩陣(表3) ,供試材料間相似系數值的變化范圍為0.545-1.000, 相似系數值越大,材料間的遺傳距離越小, 親緣關系越近; 反之親緣關系越遠. 3 聚類分析 根據RAPD 數據得到的相似系數矩陣, 按UPGMA法進行聚類分析, 建立

9、聚類分支樹狀圖( 圖2)，供試樣品可以聚為5 類： 第一類（9,11,13,20） 第二類（1-8,17,18） 第三類（14,15,16） 第四類（12,10） 第五類（19） 聚類分析結果顯示絕大多數地理分布距離較近的樣品, 如1-3 之間, 4-6 之間, 7、8 之間, 10、1 1、13 之間, 14-16 之間及17、1 8 之間, 在聚類樹狀圖上的距離也較近, 說明它們之間的遺傳背景差異較小.反之亦然。 但是生態(tài)條件特別是小生境對當歸遺傳差異的影響亦不可忽視, 如12 號樣品和9, 10, 11, 13 號樣品之間, 19 號, 20 號樣品和17, 18 號樣品之間在地理分布距

10、離上雖然較近, 但在分子系統(tǒng)樹上的距離卻較遠, 說明它們之間的遺傳差異相對較大, 這可能是由于樣品之間小生境的不同造成的. 以上結果均表明,RAPD 標記技術能較好地反映不同產地當歸親緣關系的遠近, 當歸資源的遺傳距離與其栽培地的地理分布距離有一定的相關性, 這有助于在一定程度上解釋甘肅當歸藥材的道地性, 同時可證明RAPD 技術可用于藥用植物分子生物學水平的種內鑒定與研究.基本信息姓 名：黃璐琦性 別：男 出生年月：1968年3月 學 位：博士畢業(yè)學校：北京大學醫(yī)學部（原北京醫(yī)科大學） 畢業(yè)時間：1995年導師類別：博士研究生導師研究方向：分子生藥學，中藥資源學人 物 名 片從事工作：現為中

11、國中醫(yī)科學院副院長，中藥研究所所長，首席研究員。學術兼職：國務院學位委員會中藥學科評議組委員，世界衛(wèi)生組織傳統(tǒng)醫(yī)學（中藥）合作中心主任，國家藥典委員會委員，中華中醫(yī)藥學會中藥鑒定分會主任委員，中國中西醫(yī)結合學會中藥專業(yè)委員會主任委員，中國生態(tài)學會中藥資源生態(tài)專業(yè)委員會主任委員，中國中藥雜志副主編成就及榮譽分子生藥學的提出提出時間：1995年提出背景：前提優(yōu)點缺點生藥學：是研究生藥的一門科學。 研究生藥的名稱、來源、形態(tài)、性狀、組織、成分、效用及生產、采制、貯藏等的學科。分子生物學：從分子水平上研究生命現象物質基礎、的學科。研究細胞成分的物理、化學性質和變化及這些性質和變化與生命現象的關系，如遺

12、傳信息的傳遞，基因的結構、復制、轉錄、翻譯、表達調控和表達產物的生理功能，以及細胞信號的轉導等。20 世紀末期, 分子生物學及相關學科的飛速發(fā)展, 極大地促進了生藥學的發(fā)展, 其他學科及相關知識的滲入使得生藥學的研究內容不斷擴大, 技術方法不斷更新, 生藥學科的內涵和外延也不斷延伸。如何認識生藥的質量變異? 其物質基礎是什么?生藥優(yōu)質藥材(特別是道地藥材)是如何形成的,其形成的分子遺傳與環(huán)境機理是什么? 生藥藥效成分積累的生物學機理是什么? 受什么因素影響? 如何提高藥效成分的含量? 當時提出時的展望： 在鑒定方面的應用 在生產方面的應用 在獲取有效成分方面應用現代意義： 將生藥的研究層次向微

13、觀推進到基因(genes)水平, 極大地豐富了人們以往對生藥生命現象的認識; 由于不同基因或DNA 片段的進化速度不同, 其在進化中的特殊地位不同, 所反映的遺傳變異的尺度和水平也不同, 這一點強化了人們對生藥細胞、組織、器官、有機體、種群等層次的重新認識和思考。主編書目參考文獻： 1王燕,單體中.當歸多糖的生物學功能的研究進展J.畜牧與飼料科學,2006(2):42-45. 2張尚智,劉玲玲,楊文璽,賀莉萍,韓黎明 .當歸生物技術的研究現狀與展望J.西北藥學雜志,2012,27(5):496-499. 3廖朝林, 王華,廖璐婧,由金文,何美軍,張宇,何銀生.分子標記在當歸屬植物遺傳多樣性研究中的應用J. 湖北農業(yè)科學,2009,48(10):2598-2602. 4盛麗,王蒂,司懷軍.甘肅省當歸種質資源的RAPD分析J.甘肅農業(yè)大學學報，2007，42(4)：60-64s5李紅軍當歸種苗組培繁育技術J.甘肅農業(yè)科技，2004(9):56. 6 盛 麗, 王 蒂,