當(dāng)歸分子生藥學(xué)課件

1、當(dāng) 歸當(dāng)歸的RAPD分析分子標(biāo)記在當(dāng)歸研究中的應(yīng)用當(dāng)歸種質(zhì)資源的研究 黃璐琦簡(jiǎn)介 當(dāng)歸（學(xué)名：Angelica sinensis），為傘形科多年生草本植物，在中國(guó)分布于甘肅、云南、四川、青海、陜西、湖南、湖北、貴州等地，各地均有栽培。當(dāng)歸的根可入藥，是最常用的中藥之一。當(dāng)歸多糖生物學(xué)功能的研究進(jìn)展分子標(biāo)記在當(dāng)歸研究中的應(yīng)用當(dāng)歸生物技術(shù)的研究現(xiàn)狀與展望1. 分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序 列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記 ,是DNA水平遺傳 多態(tài)性的直接反映。2. 應(yīng)用于當(dāng)歸植物遺傳多樣性分析的分子遺 傳標(biāo)記主要有RFLP.RAPD.AFLP.ISSR.ITS等 一.分子標(biāo)記在當(dāng)歸植物遺傳多樣性研究

2、中的應(yīng)用 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)： RAPD技術(shù)建立在 PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,用一系列(通常數(shù)百個(gè))不同的隨機(jī)排 列堿基序列的寡核苷酸單鏈作為引物,對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行單引物擴(kuò) 增. RAPD應(yīng)用于當(dāng)歸種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性等研究工作中. 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP): AFLP是RFLP和PCR相結(jié)合的DNA分析技術(shù),它結(jié)合了RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，既具有前者的可靠性, 又具有后者的方便性.現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物多樣性 ,指紋圖譜構(gòu)建,遺傳圖譜構(gòu)建,基因克隆等諸多領(lǐng)域. 當(dāng)歸組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀當(dāng)歸生物技術(shù)研究的總體現(xiàn)狀 1.當(dāng)歸組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀: 國(guó)內(nèi)有關(guān)當(dāng)歸組織培養(yǎng)研究的

3、文獻(xiàn)始于1981年，在19812010年的30年間，共有文獻(xiàn)17篇. 目前，當(dāng)歸生物技術(shù)的研究?jī)H局限于當(dāng)歸組織培養(yǎng)與DNA分子標(biāo)記方面，其他如當(dāng)歸發(fā)酵工程、酶工程及蛋白質(zhì)工程，基因工程等生物技術(shù)的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道 2.國(guó)內(nèi)當(dāng)歸生物技術(shù)研究的總體現(xiàn)狀:s當(dāng)歸RAPD 分析s當(dāng)歸種子的RAPD 分析當(dāng)歸道地性RAPD 分析當(dāng)歸RAPD 反應(yīng)條件的優(yōu)化s注: M 為DNA Marker; 1 6 分別是表1 中的1 6 號(hào)材料。下同 圖1 當(dāng)歸種子基因組DNA 電泳圖譜 由圖1 可知，用改良CTAB 法提取的當(dāng)歸種子基因組DNA 片段大小均在20 kb 左右，拖尾現(xiàn)象較少，DNA 降解少，完整性相對(duì)

4、較好，能夠滿足RAPD 反應(yīng)對(duì)DNA 質(zhì)量的要求。s圖2 RAPD 分析電泳圖譜圖2 可知，除了1 號(hào)樣品外，其余5 種材料均在250 bp 處有一特征性條帶。因此S 61（隨機(jī)引物） 可用于當(dāng)歸的鑒別。118 為樣品編號(hào)圖218 個(gè)當(dāng)歸樣品的RAPD 聚類系統(tǒng)圖s當(dāng)歸藥材道地性的RAPD 分 對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的18 個(gè)當(dāng)歸樣品,提取其基因組DNA, 并進(jìn)行RAPD 分析。s 圖2 比較直觀地表明絕大多數(shù)地理分布距離越近的樣品, 如13 之間, 57 之間, 9, 10 之間及1118 之間, 在聚類樹(shù)狀圖上的距離越近, 說(shuō)明它們之間的遺傳背景差異越小。反之, 地理分布距離越遠(yuǎn)的樣品, 如上述各

5、組之間, 在聚類樹(shù)狀圖上的距離越遠(yuǎn), 說(shuō)明它們之間的遺傳背景差異越大。 RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)揭示道地藥材與非道地藥材之間的地理生態(tài)遺傳的差異將是一種十分有效的手段。s當(dāng)歸RAPD 反應(yīng)條件的優(yōu)化 為了確定最優(yōu)的PCR 反應(yīng)體系, 本試驗(yàn)選取了反應(yīng)成分中模板濃度、Mg2+ 、引物濃度、dN TPs 的濃度、Tag 酶用量5 個(gè)重要因子設(shè)計(jì)L16 ( 4) 5 正交試驗(yàn), 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表( 表1)s正交試驗(yàn)結(jié)果及分析:上述L16 ( 4 ) 5正交表作PCR 擴(kuò)增試驗(yàn), 結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1 正交試驗(yàn)的兩次重復(fù)s結(jié)果分析：R 值的大小反映了該因素對(duì)結(jié)果影響的大小, 從表2 中可以看出, 在

6、試驗(yàn)范圍內(nèi), 5 個(gè)因子中以T aq 酶用量影響最大, 其次為dNT Ps 濃度, 模板濃度和引物濃度這兩項(xiàng)因子效應(yīng)相差不大, MgCl2濃度影響最小。s 最后結(jié)果：5個(gè)試驗(yàn)因子的最適條件為: 模板DNA 0. 5 ng/ LL, 引物0. 8 Lmo l/ L, dNT Ps 0. 25 mmol/ L, MgCl2 2. 5 mmo l/ L, Taq 酶0. 8 U。當(dāng)歸主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源分析甘肅省 甘肅省是全國(guó)當(dāng)歸種植面積最大的省份，近年來(lái)培育出“岷歸1號(hào)”、“岷歸2號(hào)”兩個(gè)新品系。云南省 鶴慶馬廠是云南當(dāng)歸的道地產(chǎn)區(qū)，馬廠當(dāng)歸也有“ 紫莖”和“綠莖”以“紫莖”種植面積占絕對(duì)優(yōu)勢(shì), “綠莖

7、”極少見(jiàn)。四川省 四川省當(dāng)歸種植區(qū)主要分布在北部的九寨溝縣、平武縣、寶興縣、漢源縣。湖北省 湖北省適合當(dāng)歸的種植地方主要集中在恩施、利川、建始等地。當(dāng)歸種質(zhì)資源的RAPD分析 隨機(jī)擴(kuò)增DNA 多態(tài)性( Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中草藥種質(zhì)資源遺傳多樣性及藥材道地性的研究中.盛麗等人對(duì)來(lái)自甘肅省不同產(chǎn)區(qū)所栽培的20 個(gè)當(dāng)歸樣品進(jìn)行了RAPD 分析, 對(duì)其遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了考證。1 RAPD多態(tài)性分析 從40 個(gè)隨機(jī)引物中篩選出7條譜帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)并且重復(fù)性好的引物, 對(duì)供試的20份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 并對(duì)這7 個(gè)引

8、物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(見(jiàn)表2）。 7條引物共擴(kuò)增出82 個(gè)條帶, 不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)變幅為6-17 條, 平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出11.7 條帶, 82條DNA 擴(kuò)增帶中, 58 條帶具有多態(tài)性, 占70.7%, 每個(gè)引物可擴(kuò)增出5-11 條多態(tài)性帶, 平均為8.3 條.2.遺傳相似系數(shù) 用NTSYS- pc 統(tǒng)計(jì)分析軟件中的Dice 方法得到材料間的相似系數(shù)矩陣(表3) ,供試材料間相似系數(shù)值的變化范圍為0.545-1.000, 相似系數(shù)值越大,材料間的遺傳距離越小, 親緣關(guān)系越近; 反之親緣關(guān)系越遠(yuǎn). 3 聚類分析 根據(jù)RAPD 數(shù)據(jù)得到的相似系數(shù)矩陣, 按UPGMA法進(jìn)行聚類分析, 建立

9、聚類分支樹(shù)狀圖( 圖2)，供試樣品可以聚為5 類： 第一類（9,11,13,20） 第二類（1-8,17,18） 第三類（14,15,16） 第四類（12,10） 第五類（19） 聚類分析結(jié)果顯示絕大多數(shù)地理分布距離較近的樣品, 如1-3 之間, 4-6 之間, 7、8 之間, 10、1 1、13 之間, 14-16 之間及17、1 8 之間, 在聚類樹(shù)狀圖上的距離也較近, 說(shuō)明它們之間的遺傳背景差異較小.反之亦然。 但是生態(tài)條件特別是小生境對(duì)當(dāng)歸遺傳差異的影響亦不可忽視, 如12 號(hào)樣品和9, 10, 11, 13 號(hào)樣品之間, 19 號(hào), 20 號(hào)樣品和17, 18 號(hào)樣品之間在地理分布距

10、離上雖然較近, 但在分子系統(tǒng)樹(shù)上的距離卻較遠(yuǎn), 說(shuō)明它們之間的遺傳差異相對(duì)較大, 這可能是由于樣品之間小生境的不同造成的. 以上結(jié)果均表明,RAPD 標(biāo)記技術(shù)能較好地反映不同產(chǎn)地當(dāng)歸親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近, 當(dāng)歸資源的遺傳距離與其栽培地的地理分布距離有一定的相關(guān)性, 這有助于在一定程度上解釋甘肅當(dāng)歸藥材的道地性, 同時(shí)可證明RAPD 技術(shù)可用于藥用植物分子生物學(xué)水平的種內(nèi)鑒定與研究.基本信息姓 名：黃璐琦性 別：男 出生年月：1968年3月 學(xué) 位：博士畢業(yè)學(xué)校：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（原北京醫(yī)科大學(xué)） 畢業(yè)時(shí)間：1995年導(dǎo)師類別：博士研究生導(dǎo)師研究方向：分子生藥學(xué)，中藥資源學(xué)人 物 名 片從事工作：現(xiàn)為中

11、國(guó)中醫(yī)科學(xué)院副院長(zhǎng)，中藥研究所所長(zhǎng)，首席研究員。學(xué)術(shù)兼職：國(guó)務(wù)院學(xué)位委員會(huì)中藥學(xué)科評(píng)議組委員，世界衛(wèi)生組織傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)（中藥）合作中心主任，國(guó)家藥典委員會(huì)委員，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥鑒定分會(huì)主任委員，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)中藥專業(yè)委員會(huì)主任委員，中國(guó)生態(tài)學(xué)會(huì)中藥資源生態(tài)專業(yè)委員會(huì)主任委員，中國(guó)中藥雜志副主編成就及榮譽(yù)分子生藥學(xué)的提出提出時(shí)間：1995年提出背景：前提優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)生藥學(xué)：是研究生藥的一門(mén)科學(xué)。 研究生藥的名稱、來(lái)源、形態(tài)、性狀、組織、成分、效用及生產(chǎn)、采制、貯藏等的學(xué)科。分子生物學(xué)：從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)、的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)性質(zhì)和變化及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺

12、傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。20 世紀(jì)末期, 分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展, 極大地促進(jìn)了生藥學(xué)的發(fā)展, 其他學(xué)科及相關(guān)知識(shí)的滲入使得生藥學(xué)的研究?jī)?nèi)容不斷擴(kuò)大, 技術(shù)方法不斷更新, 生藥學(xué)科的內(nèi)涵和外延也不斷延伸。如何認(rèn)識(shí)生藥的質(zhì)量變異? 其物質(zhì)基礎(chǔ)是什么?生藥優(yōu)質(zhì)藥材(特別是道地藥材)是如何形成的,其形成的分子遺傳與環(huán)境機(jī)理是什么? 生藥藥效成分積累的生物學(xué)機(jī)理是什么? 受什么因素影響? 如何提高藥效成分的含量? 當(dāng)時(shí)提出時(shí)的展望： 在鑒定方面的應(yīng)用 在生產(chǎn)方面的應(yīng)用 在獲取有效成分方面應(yīng)用現(xiàn)代意義： 將生藥的研究層次向微

13、觀推進(jìn)到基因(genes)水平, 極大地豐富了人們以往對(duì)生藥生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí); 由于不同基因或DNA 片段的進(jìn)化速度不同, 其在進(jìn)化中的特殊地位不同, 所反映的遺傳變異的尺度和水平也不同, 這一點(diǎn)強(qiáng)化了人們對(duì)生藥細(xì)胞、組織、器官、有機(jī)體、種群等層次的重新認(rèn)識(shí)和思考。主編書(shū)目參考文獻(xiàn)： 1王燕,單體中.當(dāng)歸多糖的生物學(xué)功能的研究進(jìn)展J.畜牧與飼料科學(xué),2006(2):42-45. 2張尚智,劉玲玲,楊文璽,賀莉萍,韓黎明 .當(dāng)歸生物技術(shù)的研究現(xiàn)狀與展望J.西北藥學(xué)雜志,2012,27(5):496-499. 3廖朝林, 王華,廖璐婧,由金文,何美軍,張宇,何銀生.分子標(biāo)記在當(dāng)歸屬植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用J. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,48(10):2598-2602. 4盛麗,王蒂,司懷軍.甘肅省當(dāng)歸種質(zhì)資源的RAPD分析J.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(4)：60-64s5李紅軍當(dāng)歸種苗組培繁育技術(shù)J.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2004(9):56. 6 盛 麗, 王 蒂,