白藜蘆醇對人乳腺癌MCF7ADM細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)增效作用

1、白藜蘆醇對人乳腺癌MCF-7/ADM細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)增效作用【摘要】目的研究白藜蘆醇(Res)逆轉(zhuǎn)人乳腺癌F-7/阿霉素(AD)細胞多藥耐藥(DR)的作用及初步機制。方法采用TT法測定不同濃度Res對F-7/AD細胞的抑制作用、應(yīng)用金氏公式判斷Res和AD結(jié)合效應(yīng);同時采用熒光分光光度法對不同濃度Res作用下F-7/AD細胞內(nèi)的AD積量進展測定。結(jié)果Res能進步F-7/AD細胞對AD的敏感性，AD結(jié)合4l/LRes時逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.950,8l/L為2.178,12l/L為2.355;Res可進步AD在F-7/AD細胞內(nèi)的蓄積，耐藥細胞F-7/AD內(nèi)AD的濃度明顯升高(與對照組比擬，P0.05)

2、，且細胞內(nèi)AD濃度均隨細胞外AD濃度升高而升高。結(jié)論Res對AD抗人乳腺癌F-7/AD細胞具有增敏作用;Res可以局部逆轉(zhuǎn)DR，其逆轉(zhuǎn)機制與增加AD藥物濃度有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】藜蘆生物堿類;表柔比星;乳腺腫瘤;腫瘤細胞，培養(yǎng)的;抗藥性，腫瘤;抗藥性，多藥筆者先前的研究說明，白藜蘆醇(Resveratrl,Res)結(jié)合阿霉素(AD)對人乳腺癌耐阿霉素細胞(F-7/AD)具有較強的抑制作用，且Res單用或結(jié)合AD對正常肝細胞根本無毒害作用1。筆者繼續(xù)研究Res單用或結(jié)合AD對F-7/AD細胞的增殖抑制效應(yīng)，以討論Res對耐藥性是否具有逆轉(zhuǎn)作用。1材料與方法1.1材料Res(純度99%)、二甲基亞砜(D

3、S)、甲基偶氮唑藍(TT)均購自美國Siga公司，RPI-1640培養(yǎng)液(美國Gib公司);鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份，批號H33021980)。人乳腺癌敏感株細胞(F-7/S)和F-7/AD細胞購自南京凱基生物開展。F-7/AD另加1.0g/LAD以維持其耐藥性。1.2方法1.2.1TT法測F-7/AD細胞的耐藥性將對數(shù)生長期的F-7/S和F-7/AD細胞消化后配成2104L-1細胞懸液，接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，參加AD使其終濃度分別為0.01，0.1，1.0，10和100l/L，并設(shè)置調(diào)零孔(無細胞孔)、溶劑組(0.1%DS)、空白對照組。培養(yǎng)48h后，加含0.5g/LTT200L

4、，培養(yǎng)4h后在酶標(biāo)儀上測定波長570n的D值。根據(jù)公式求出相應(yīng)的細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=1-(實驗孔D值/空白對照組D值)100%再根據(jù)AD抑制F-7/S，F(xiàn)-7/AD細胞I50值求耐藥倍數(shù)：耐藥倍數(shù)=I50(F-7/AD)/I50(F-7/S)1.2.2Res對F-7/S和F-7/AD細胞的抑制作用將Res參加F-7/S、F-7/AD單細胞懸液中，使Res的終濃度分別為4，8，12和16l/L，并設(shè)置調(diào)零孔、空白對照組、溶劑組(0.1%DS)。48h后行TT實驗。計算細胞生長抑制率。1.2.3Res結(jié)合AD對F-7/AD細胞的抑瘤增效和逆轉(zhuǎn)作用F-7/S、F-7/AD細胞分別參加不同

5、濃度的AD和Res，使AD的終濃度分別為2，4，6，8和10l/L，Res的終濃度分別為4，8和12l/L，并設(shè)置調(diào)零孔和空白對照組，培養(yǎng)48h后行TT實驗。參照文獻2-3利用金氏公式求Q值，并進展合用效果的判斷：Q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb)Q值在0.851.15表示(+)，Q值1.152.0表示(+)，Q值0.850.55表示(-)，Q值0.55表示(-)。同時計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)：逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=I50(化療藥物作用組)/I50(化療藥物與多酚類化合物共同作用組)1.2.4熒光分光光度法檢測參照文獻4-5檢測F-7/AD細胞內(nèi)阿霉素濃度的變化。藥物濃度熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測定0

6、，0.01，0.04，0.16，0.64，2.56和10.24l/L系列的阿霉素溶液的吸光度(激發(fā)波長為470n，發(fā)射波長為585n，狹縫寬5n)，獲得細胞內(nèi)阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。細胞內(nèi)藥物濃度的測定在不同細胞的培養(yǎng)液中加4，8，12和16l/L的Res與4，16和64l/L的AD，培養(yǎng)3h后離心，置酸乙醇中于-20過夜。離心取上清液測定其熒光強度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該上清液中AD的濃度。1.3統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以xs表示，采用SPSS13.0軟件進展方差分析和回歸分析。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1F-7/AD細胞耐藥性確實定AD對F-7/AD細胞I50值為21.38l/L;F-7

7、/AD細胞的耐藥倍數(shù)為54.82倍(表1)。表1AD對F-7/S細胞和F-7/AD細胞的影響2.2不同濃度Res對F-7/S細胞和F-7/AD細胞的抑制Res對F-7/AD細胞I10值為11.39l/L，Res在兩種細胞之間無耐藥性(1.35倍，表2)。2.3Res結(jié)合AD對F-7/AD細胞的抑瘤增效和逆轉(zhuǎn)作用對照組的D值為(1.1220.011)。經(jīng)比擬，Res與AD在體外均有相加或增強作用，絕大多數(shù)結(jié)合用藥組的Q1.15，說明二者的作用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用;其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)隨著白藜蘆醇濃度的增高而增加(AD結(jié)合4l/LRes時逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.950，8l/L為2.178，12l/L為2.355，表3

8、)。2.4熒光分光光度法檢測AD的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=119.316+276.394X，R2=0.957表2Res對F-7/S細胞和F-7/AD細胞的影響n=4.Res:白藜蘆醇;F-7/S：人乳腺癌敏感細胞;F-7/AD：人乳腺癌耐阿霉細胞.表3Res結(jié)合AD對F-7/AD細胞的抗腫瘤作用AD在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在F-7/S細胞和F-7/AD細胞中，細胞內(nèi)AD濃度均隨細胞外AD濃度的增加而升高，且耐藥細胞F-7/AD內(nèi)AD的濃度明顯低于敏感細胞F-7/S內(nèi)AD的濃度(P0.01);當(dāng)參加Res后，耐藥細胞F-7/AD內(nèi)AD的濃度明顯升高(P0.05)，且細胞內(nèi)AD濃度均隨細胞外AD

9、濃度升高而升高(表4)。表4Res對AD在F-7/S和F-7/AD細胞的蓄積影響3討論AD是第一個在臨床上使用的蒽環(huán)類抗癌藥，其抗瘤譜廣，是治療乳腺癌最有效的藥物之一，但F-7/AD細胞對阿霉素具有耐藥性。常用的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑如維拉帕米、環(huán)孢菌素A等雖具有體外逆轉(zhuǎn)DR的作用，往往由于嚴重的毒副作用，難以用于臨床。近年來研究說明，Res能通過多種途徑對多種腫瘤細胞有顯著抑制作用6-7。在逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性研究中，認為Res能誘導(dǎo)耐藥細胞的凋亡，其作用機制可能與逆轉(zhuǎn)dr-1RNA基因表達有關(guān)8-9。本局部實驗提示，412l/LRes與210l/LAD在體外結(jié)合應(yīng)用時具有相加或增強作用，絕大多數(shù)結(jié)

10、合用藥組的Q1.15，說明二者的作用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用。關(guān)于Res抑制腫瘤細胞的有效濃度研究中，Res濃度在12.5l/L,作用一定時間(48h)后就能對Hela細胞有著明顯的抑制增殖作用10，本研究結(jié)果與其根本一致。Res能明顯增強化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)的抑癌效果，65l/L的Res與13l/L的5-FU表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，兩藥結(jié)合應(yīng)用后凋亡細胞比例明顯比單用任一種時升高11。本研究結(jié)果與該結(jié)論相似，但本研究的濃度范圍不完全相符。這種不同劑量Res發(fā)揮相似生物學(xué)效應(yīng)的原因可能是由于不同的研究方法以及選用不同的細胞系導(dǎo)致結(jié)果的偏向有關(guān)。討論兩藥協(xié)同作用的機理時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)參加非細胞毒性

11、劑量或低毒劑量的Res后，與對照組比擬，耐藥細胞F-7/AD內(nèi)AD的濃度明顯升高，且細胞內(nèi)AD濃度均隨細胞外AD濃度升高而升高。因此，Res可以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，其逆轉(zhuǎn)機制可能與增加AD藥物濃度有關(guān)。筆者認為，應(yīng)進一步討論Res增加AD在耐藥細胞內(nèi)蓄積性的分子機制?！緟⒖嘉墨I】1黃芳,黃子杰,陳潔,等.植物多酚類化合物抑制人乳腺癌F-7/AD細胞的挑選J.實用腫瘤學(xué)雜志,2022,24(2):121-123.2金正均.合并用藥中的相加J.中國藥理學(xué)報,1980,1(2):70-76.3戴體俊.合并用藥的定量分析J.中國藥理學(xué)通報,1998,14(5):479-480.4habersSK，HaitN

12、，KainskiB，etal.EnhaneentfanthraylinegrthinhibitininparentandDRhinesehastervaryellsbyylsprineAanditsanalguesJ.anerRes,1989,49(22):6275.5anGR,GrabskiD,Ruse,etal.Differentialeffetfthealdulininhibitrtrifluperazinenellularauulatin，retentin，andyttxiityfanthraylinesindxrubiinresistantP388useleukeiaellsJ.an

13、erRes,1984,44(11):5056.6Jang,aiL,UdeaniG,etal.anerhepreventiveativityfresveratrl,anaturalprdutderivedfrgrapesJ.Siene，1997,275(5297):218-220.7杜強,陳燕凌.白藜蘆醇對肝癌Bel-7404細胞增殖、凋亡及侵襲的影響J.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2022,41(06):509-513.8le,GriaudS,DiristinaA.Pterstilbeneand3-hy-drxypterstilbeneareeffetiveapptsis-induingagentsinDRandBR-ABL-expressingleukeiaellsJ.IntJBiheellBil,2022,37(8):1709-1726.9馬泳泳,黃進.白藜蘆醇誘導(dǎo)K5