齊魯醫(yī)學(xué)酶工程山東師范大學(xué)

1、 第四章 酶的提取與分離純化預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（rough fractionation） （提取）：除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（fine fractionation） （精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentration and desiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。2021/9/301 第一節(jié) 酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理(一)發(fā)酵液的相對(duì)純化1. 無機(jī)離子的去除 2. 雜蛋白質(zhì)的去除3. 色素及其他物質(zhì)的去除2021/9/302(二）發(fā)酵液的固液分離1 . 影響發(fā)酵液

2、過濾的因素 1）菌種2）培養(yǎng)基組成2. 提高過濾性能的方法 1）絮凝和凝聚 2）稀釋、加熱 3）加助濾劑，常用硅藻土等。 主要方法是離心分離和過濾2021/9/303二、細(xì)胞破碎 （一）細(xì)胞壁組成 細(xì)胞壁的主要成分： 細(xì)菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì) 真菌: 多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖） 2021/9/304微生物 革蘭氏陽性細(xì)菌 革蘭氏陰性細(xì)菌 放線菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 15 50 10 13 同G+100 300 100 250 層次 單層 多層 多層 多層 主要組成 肽聚糖(40% 90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1%2%) 肽聚糖(5%

3、10%)脂蛋白脂多糖(11% 22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30% 40%)甘露聚糖(30%)幾丁質(zhì)(1% 2%)蛋白質(zhì)(6% 8%)脂類(8.5% 13.5%)多聚糖(80% 90%)脂類蛋白質(zhì) 各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 2021/9/305 細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) 2021/9/306酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu) M甘露聚糖；P磷酸二酯鍵；G葡聚糖 2021/9/307（二）細(xì)胞破碎的方法 機(jī)械法 物理法 化學(xué)法 生物法（酶解） 2021/9/3081.機(jī)械法： 1）液體剪切：攪拌、勻漿。 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。2.物理法： 1）超聲波破碎法。 2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等） 平衡后迅速

4、轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。 3）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。2021/9/3093. 化學(xué)法 應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。 1）有機(jī)溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯仿等。 2）表面活性劑處理：常用非離子型表面活性劑，如Triton X-100，Tween等。2021/9/30104.酶解法（enzymatic lysis）： 外加酶法： 根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿浮?自溶法（autolysis）: 細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) 生溶解的現(xiàn)象。2021/9/3011細(xì)胞對(duì)破碎方法的敏感性細(xì)胞 聲波 機(jī)械 滲透壓 凍融動(dòng)植物 + + +

5、+革蘭氏陰性菌 + + + +革蘭氏陽性芽孢菌 + + + +酵母 + + + +革蘭氏陽性球菌 + - + +菌絲 - + - +孢子 - - - -2021/9/3012（三）細(xì)胞破碎確認(rèn) 1.直接測(cè)定破碎前后的細(xì)胞數(shù)： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。 2.測(cè)定導(dǎo)電率： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測(cè)定破碎程度。 3.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力： 測(cè)定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。 2021/9/3013三、酶的提取(extraction) 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原

6、料中引入溶液。 2021/9/3014 提取目標(biāo)： a. 將目的酶最大限度地溶解出來。 b. 保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（010）操作。2021/9/3015提取原則a. 相似相溶。b. 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。2021/9/3016 提取方法：（一）鹽溶液提取 常用稀鹽（常用NaCl）溶液（鹽溶），對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、堿溶液提取（三）有機(jī)溶劑提取2021/9/3017四、 離心分離（一）基本原理1. 離心力 Fc = m ac m r 2 m r （2 N/60）2 N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）； Fc

7、通常以相對(duì)離心力RCF（relative centrifugal force）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。2021/9/3018RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm 2021/9/3019 通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對(duì)離心力（RCF）表 示，如：65000g。 兩者可換算或查測(cè)算圖。2021/9/3020計(jì)算近似RCF的列線圖2021/9/302

8、12. 沉降系數(shù):（sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentation velocity）,用S表示。 由于許多生物大分子的S值很小，所以定義10 13 s 為一個(gè)沉降單位，1S = 11013 s。 常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1 200之間。 2021/9/3022（二）離心機(jī)的種類 按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速） 高速 超速 2021/9/3023名稱 轉(zhuǎn)速(r/min) 注意事項(xiàng) 低速離心機(jī) 6000 常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡 高速離心機(jī) 6000 250

9、00冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡 超速離心機(jī) 25000冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡 離心機(jī)的種類 2021/9/3024實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)溫度類型：常溫及冷凍超速離心機(jī)均為冷凍型。使用冷凍離心機(jī)時(shí)提前降溫，預(yù)冷離心頭。使用超速離心機(jī)時(shí)先抽真空。2021/9/3025離心的形式角式及外擺式：外擺式一般為低速， 角式由低速到超速均有。 2021/9/3026角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。2021/9/3027離心機(jī)的大?。郝涞厥郊芭_(tái)式2021/9/3028小臺(tái)式離心機(jī)2021/9/3029離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：

10、和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋2021/9/3030離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時(shí)。2021/9/3031（三）常用離心方法 差速離心法 沉降速度法 密度梯度離心 沉降平衡法 等密度梯度離心2021/9/30321差速離心 （differential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單 。缺點(diǎn)：1）分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 3）沉降的顆粒受到擠壓。2021/9/3033 差速離心分離示意圖 （a）離心前的懸浮液 （b）（e）離心

11、不同時(shí)間后顆粒的沉降情況 2021/9/30342021/9/30352密度梯度離心 （density gradient centrifugation） 樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。 常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。2021/9/3036特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì)。2021/9/3037 密度梯度離心示意圖 （a）離心前 （b）離心后 2021/9/3038Density gradient ultracentrifugation2021/9/3039密度梯度離心 步驟： A.形成

12、密度梯度 B. 加樣 C.離心 D.收集樣品2021/9/30403. 等密度梯度離心 又稱沉降平衡離心 （sedimentation equilibrium centrifugation）。 根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。 離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀?，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。 2021/9/3041常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點(diǎn)： 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。2021/9/3042 等密度梯度離心示意圖 （a）離心前； （b）離心后 2021/9/3043密度梯

13、度離心等密度梯度離心梯度介質(zhì)通常用蔗糖最大的梯度密度密度最大的沉降樣品離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間，高速度分離依據(jù)密度相近，但沉降系數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)2021/9/3044總結(jié)：等密度梯度離心是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。差速離心是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。2021/9/3045（四）應(yīng)用 根據(jù)不同離心目的，分為制備性離心： 分離純化和制備

14、分析性離心： 測(cè)分子量、沉降系數(shù)、密度、純度2021/9/3046五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龉爬?、?shí)用、簡(jiǎn)單的初步分離方法2021/9/3047在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法： 中性鹽沉淀（鹽析法） 有機(jī)溶劑沉淀 選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性） 等電點(diǎn)沉淀 有機(jī)聚合物沉淀2021/9/3048（一）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶（salting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 2) 鹽析（salting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)

15、的溶解度。2021/9/3049蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對(duì)馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強(qiáng)度鹽 析鹽溶2021/9/3050 原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。2021/9/3051蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 2021/9/30522021/9/30532021/9/30541）中性鹽的選擇 常用（NH4）2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)： a. 溶解度大b. 分離效果好 c. 不易引起變性 d. 價(jià)格便宜2. 鹽析用鹽2021/9/30552) 鹽濃

16、度的表示 用飽和（溶解）度表示: 溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度 溶液的總體積2021/9/30563) 調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。 配制飽和硫酸銨溶液2021/9/3057所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算： S2-S1 V=V0 1-S2式中 V,V0分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積S2,S1分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度2021/9/3058b. 添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時(shí)。按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù) B(S2-S1)W= 1

17、-AS2A,B常數(shù)，與溫度有關(guān)。 實(shí)際使用時(shí)，可直接查表 （各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。2021/9/3059調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表2021/9/3060鹽析操作低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40。高飽和度：固體鹽添加法。不會(huì)大量增加溶液體積。1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。2）冰箱中（4）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。3）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration） 、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。2021/9/3061 3. 鹽析曲線的制作 如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該

18、物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨 飽和度 2021/9/3062 硫酸銨濃度（%） 枯草桿菌-淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 2021/9/30634. 鹽析的影響因素1) 離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：I：離子強(qiáng)度，I = MZ2；M：離子濃度（mol/L）； Z：離子價(jià)數(shù)S：離子強(qiáng)度為I時(shí)的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）S0：離子強(qiáng)度為0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)和鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。 Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越

19、大鹽析效果越好。 2021/9/3064 當(dāng)溫度一定時(shí)，S0對(duì)于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用表示，鹽析方程式可改寫為： log S = - Ks I 兩種鹽析法：Ks分級(jí)鹽析法 ：在一定的pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。分級(jí)鹽析法 ：在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法。2021/9/30652021/9/30662) 蛋白質(zhì)濃度： 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%最好。 3) pH值：等電點(diǎn)處最易沉淀。4) 溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。 一般可在室溫下

20、進(jìn)行。某些對(duì)溫度敏感的酶，可在04下操作。2021/9/3067（二） 有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)） 利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1. 沉淀機(jī)理 降低溶液的介電常數(shù) 部分地引起蛋白質(zhì)脫水2. 常用有機(jī)溶劑 丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。 2021/9/30683.優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高 2） 沉淀不需脫鹽 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。 2021/9/30694. 影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（1）溫度 ：低溫（0）操作。（2）pH 值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。 （

21、3）離子強(qiáng)度：采用0.05mol/L的稀鹽溶液 增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度 目的 防止蛋白質(zhì)變性 （4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為520mg/ml 2021/9/3070（三） 等電點(diǎn)沉淀(isoelectric precipitation) 1.原理 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn) 2. 使用方法 單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。2021/9/30713. 優(yōu)點(diǎn)： 1）大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi) 2）無機(jī)酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價(jià)格較低 3）無需

22、除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化4. 缺點(diǎn)： 酸化時(shí)，容易引起蛋白質(zhì)失活 2021/9/3072（四）有機(jī)聚合物沉淀法 1. 作用機(jī)理： 與有機(jī)溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。2. 沉淀劑：常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，簡(jiǎn)寫 PEG ） 多用分子量為600020000的 PEG。3. 優(yōu)點(diǎn)：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng) 多的生物大分子。沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。2021/9/3073（五）選擇性變性沉淀法 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 熱變性 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝

23、固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。 pH變性 等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。 有機(jī)溶劑變性 使那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。2021/9/3074六、萃?。╡xtraction）分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。特點(diǎn)：1）比化學(xué)沉淀法分離程度高2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快3）比蒸餾法能耗低 2021/9/3075（一）溶劑萃取法 明確幾個(gè)概念：料液：供提取的溶液。 溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì) 。萃取劑 ：用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機(jī)溶劑 。萃取液 ：經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液 。萃余液：

24、被萃取出溶質(zhì)后的料液 。反萃?。╞ack extraction）：完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 2021/9/3076溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑里，達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。 萃取相濃度 C1分配系數(shù) K0 = = 萃余相濃度 C2 K0值隨溶液pH的變化甚大，這是用萃取法實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。2021/9/3077 普通有機(jī)溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離， 因?yàn)?1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機(jī)溶劑2） 蛋白質(zhì)在有機(jī)相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)

25、的提取。 2021/9/3078萃取操作的3個(gè)步驟： 1）混合 2）分離 3）溶劑回收2021/9/3079單級(jí)萃取 使用一個(gè)混合器和一個(gè)分離器 單級(jí)萃取流程932021/9/3080（二） 雙水相萃取技術(shù) 又稱水溶液兩相分配技術(shù)（partion of two aqueous phase system） 用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。 2021/9/3081優(yōu)點(diǎn)：1）每一水相中均有很高的含水量，為 酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良好的環(huán)境；2）PEG、Dextran和

26、無機(jī)鹽對(duì)酶等無毒害作用，不會(huì)引起變性。 2021/9/3082雙水相的形成： 兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。 2021/9/3083a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖2021/9/30842021/9/3085 幾種典型的雙水相系統(tǒng)聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 葡聚糖（Dex） 羥丙基葡聚糖聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、硫酸銨 硫酸鈉、硫酸鎂2021/9/30862. 萃取原理： 利

27、用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。2021/9/30873. 應(yīng)用 胞內(nèi)酶的提取和精制: 除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。 2021/9/3088 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例 酶 菌 種 相系統(tǒng)延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽-半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dex乙醇脫氫酶 Bakers yeast PEG/ 鹽青霉素?；?E. coli PEG/ 鹽2021/9/3089 雙水相萃取法的重要研究方向 親和萃?。ㄓH和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（liga

28、nd）來提高分離選擇性。 2021/9/3090親和萃取酶實(shí)例蛋白質(zhì)配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脫氫酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脫氫酶三嗪染料2021/9/3091（三） 超臨界流體萃取 兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。 超臨界流體(supercritical fluid，SCF）：超過氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn)臨界點(diǎn)后的流體。2021/9/30922021/9/3093 臨界點(diǎn)的概念可用臨界溫度和臨界壓力解釋：臨界溫度：高于此溫度時(shí)，無論加壓多大也不能使氣體液化。臨界壓力：在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。 202

29、1/9/3094SCF性質(zhì)介于液體和氣體之間 ：1) SCF密度接近于液體，溶解度高。2) SCF粘度和擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體， 傳質(zhì)擴(kuò)散快。2021/9/3095基本過程：1）在SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。2）降低壓力，使SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。2021/9/3096常用超臨界液態(tài)CO2作為萃取劑， 因?yàn)椋?）液體CO2無毒2）臨界溫度（304.06K）接近常溫3）臨界壓力（7.38MPa）較低4）操作安全2021/9/3097超臨界CO2萃取技術(shù)在生物、食品等工業(yè)中的應(yīng)用 CO2萃取部分產(chǎn)品原料名稱 產(chǎn)物名稱 原料名稱

30、 產(chǎn)物名稱小麥胚芽 胚芽油 豆子 豆油精煉油啤酒花 啤酒花精油 茉莉花 凈油辣椒 辣椒紅色素 菊花根 除蟲菊酯當(dāng)歸 精油 紫草 紫草寧銀杏葉 銀杏內(nèi)酯 花生 精煉油2021/9/3098（四） 反膠團(tuán)萃取1. 反膠團(tuán)：又稱反膠束（Reversed Micelles） 指表面活性劑（由親水的極性基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)兩部分組成）分散在連續(xù)有機(jī) 溶劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級(jí)的聚集體。 反膠團(tuán)模型親水基團(tuán)向內(nèi)聚集2021/9/3099（正）膠束反膠束形成表面活性劑溶于水，使其濃度超過臨界膠束濃度。表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。構(gòu)造表面活性劑極性基團(tuán)在外，非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成

31、非極性核心。表面活性劑非極性基團(tuán)在外，極性基團(tuán)在內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池（ water pool ）。功能溶解非極性物質(zhì)溶解極性物質(zhì)2021/9/30100p1542021/9/30101 2. 萃取過程第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相 中，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的反萃取過程。2021/9/30102 反膠團(tuán)萃取原理 2021/9/30103 3. 表面活性劑及有機(jī)溶劑 反膠團(tuán)萃取與溶劑萃取的不同，是在有機(jī)溶劑中加入了少量表面活性劑。2021/9/30104（1）表面活性劑 常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸2-乙基

32、己基酯磺酸鈉）。特點(diǎn)：易獲得，強(qiáng)度好；極性基團(tuán)小，形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入。 （2） 非極性有機(jī)溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 2021/9/301054. 優(yōu)點(diǎn)1）萃取率和反萃取率高。2）分離濃縮同時(shí)進(jìn)行，溶劑可反復(fù)利用。3）解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問題。4）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。5）成本低。2021/9/30106 第二節(jié) 酶的精制 酶純化的基本原則：建立一個(gè)方便靈敏的分析方法；選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；常在低溫（4）條件下進(jìn)行純化，以避免酶的變性。 2021/9/30107一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，

33、將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。2021/9/30108（一） 擴(kuò)散膜分離 透析（dialysis）溶質(zhì)分子Y 從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動(dòng)2021/9/30109蛋白質(zhì)透析2021/9/30110 1. 透析膜 商品透析膜大多制成管狀 。 材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)。 2）透析袋的保存 ：防腐劑冷藏。2021/9/301112. 透析方法及裝置 透析袋透析簡(jiǎn)單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖 2021/9/30112（二）加壓膜分離 根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：截留顆粒直徑操作壓力應(yīng)用微濾0.22m0.1MPa除菌超濾20A

34、 0.2 m0.1 0.7MPa分離病毒及生物大分子反滲透20A0.7 13MPa純水制備2021/9/30113微濾(Microfiltration，MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；2021/9/30114超濾 (ultrafiltration，UF ) 一種動(dòng)態(tài)過程，由泵提供推動(dòng)力，在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力：一個(gè)是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個(gè)是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。 超濾原理的示意圖 2021/9/30115利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。超濾法在

35、蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。2021/9/30116常規(guī)過濾(A)和超濾(B)的示意圖 AB2021/9/30117圖4-61 超濾濃縮裝置 2021/9/30118反滲透（Reverse osmosis，RO） 利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑(通常是水)的性質(zhì)，對(duì)溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。2021/9/30119滲透與反滲透2021/9/30120Reverse Osmosis (RO)Nanofiltration (NF)Ultrafiltration (UF)Microfiltration (MF)Membrane Filtration

36、2021/9/301213. 電場(chǎng)膜分離（1）電滲析： 在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。（2）離子交換膜電滲析： 用離子交換膜代替一般的半透膜。 應(yīng)用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。2021/9/30122二、層析法 層析法也稱色譜法，是1903年俄國(guó)植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3 吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開。 2021/9/30123色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒 用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatogr

37、aphy) 。2021/9/30124層析法的基本原理 利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動(dòng)相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。mobile phase：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體 stationary phase：靜止不動(dòng)的一相2021/9/30125層析法的分類 流動(dòng)相有兩種狀態(tài)： *液體作為流動(dòng)相 *氣體作為流動(dòng)相 固定相也有兩種狀態(tài)： *固體吸附劑作為固定相 *以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析 液-固層析 液-液層析 氣相層析 氣-固層析 氣-液層析2021/9

38、/30126 按層析過程的機(jī)理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。2021/9/30127 按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。2021/9/30128Column Chromatography2021/9/3012

39、9 層析柱的制備與層析操作 柱層析的設(shè)備: 層析柱、蠕動(dòng)泵（恒流泵）、紫外檢測(cè)儀、部分收集器、梯度洗脫器。2021/9/301302021/9/30131層析設(shè)備層析裝置： 梯度混和器 蠕動(dòng)泵 層析柱 監(jiān)測(cè)儀 記錄儀 收集器 2021/9/30132記錄儀2021/9/30133低溫層析柜2021/9/30134層析操作分離前：1）樹脂預(yù)處理：凝膠溶漲。離子交換纖維素需作酸堿處理。2）裝柱：重力沉降法，要求均勻，無氣泡。3）平衡：層析柱使用前，須用緩沖液平衡至所需的pH值和離子強(qiáng)度。2021/9/30135層析操作分離中： 上樣：體積盡可能小。 平衡：用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。 洗脫：

40、連續(xù)梯度洗脫：連續(xù)改變緩沖液的pH或離子強(qiáng)度。 階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的pH或離子強(qiáng)度。 等溫平衡洗脫：用平衡緩沖液直接進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。 同時(shí)進(jìn)行分步收集和檢測(cè)。 分離后：再生，平衡，保存。2021/9/30136蛋白質(zhì)定量-分光比色儀(A280)法 蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr 的共軛雙鍵）對(duì)紫外光有吸收，以色氨酸吸收最強(qiáng)，最大吸收峰為280nm。2021/9/30137在波長(zhǎng)280nm具有吸光的氨基酸2021/9/30138分光比色儀裝置圖2021/9/30139紫外吸收法平衡、吸附鹽梯度沖洗分管收集蛋白測(cè)定制圖測(cè)A2802021/9

41、/30140（一）吸附層析（adsorption chromatography） 1. 原理 利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。2021/9/301412021/9/30142吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。2021/9/301432.吸附劑 吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。1）吸附劑的選擇：根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉 中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭2021/9/30144吸附劑的選擇根據(jù)相似相

42、溶原則：極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。 但為了便于解吸附，對(duì)于極性強(qiáng)的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附。 2021/9/301452）吸附劑的性質(zhì)：活性炭：常用的吸附介質(zhì)。硅膠：常用的極性吸附介質(zhì)。羥基磷灰石 （HA） Ca10(PO4)6.(OH)2 : 微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)； 酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。 吸附原理是HA的Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。 2021/9/301463. 洗脫劑要求： 粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分,易與目標(biāo)分子分離。選擇： 具

43、有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動(dòng)相。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。2021/9/30147 4. 應(yīng)用 分離純化生物大分子2021/9/30148（二）凝膠過濾層析 凝膠過濾（gel filtration）又稱分子篩層析（molecular sieve chromatography）、排阻層析（exclusion chromatography）,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。2021/9/301491. 基本原理 大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。202

44、1/9/301502021/9/301512021/9/301522021/9/30153Size-exclusion chromatography2021/9/301542021/9/30155凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時(shí)的洗脫液體積（ml）2021/9/30156凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰. Kd=0時(shí),即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。. Kd=1時(shí),即V

45、e=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙，最后流出。. 其它組分0Kd1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。2021/9/30157 分配系數(shù)Kd的意義：1) 可定量地衡量各組分的流出順序。2) 判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好， Kd差異小，分離效果差。2021/9/301582.凝膠的種類和性質(zhì) 1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextran gel) 商品名:Sephadex 型號(hào) Sephadex G10至G-200 G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。2021/9/30159凝膠型號(hào) 顆粒大小/m 溶脹體積/(m

46、l/g) 分離范圍（Mr） Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Sephadex G-50 Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150Sephadex G-2004120 4120 50150 50150 40120 40120 40120 40120 23 2.53.5 46 911 1215 1520 2030 2030 小于7102 小于1.5103 1.01035.0103 1.51033.01043.01038.0104 4.01031.0105 5.01033.0105 5.01036.01

47、05 葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 2021/9/301602）瓊脂糖凝膠（agarose gel) 商品名:Sepharose （瑞典）; Bio-Gel A (美國(guó)） 依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。2021/9/30161型號(hào) 使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖（） 6BSepharose 4B 2B10431061053107106108 64 2 6BSepharose CL 4B 2B 同上 同上 0.5mBio-Gel A 1.5m 5m 15m 50m 150m10500103101500105000401500010050000 100015

48、0000 108642 1 Sepharose及Bio-gel A 型號(hào) 2021/9/301623）聚丙烯酰胺凝膠 （polyacrylamide gel） 商品名為Bio-Gel,型號(hào)從 Bio-Gel P2至P-300，P值越大，孔徑也越大。 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。2021/9/301633. 操作：1）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。 將干膠懸浮于510倍的蒸餾水中 ，充分溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇 采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。2021/9/301643）加樣 體積不能過多，不超過床體積的

49、5，脫鹽時(shí)可在10左右。4）洗脫 洗脫液與平衡時(shí)用的buffer一致。 洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存 洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。 用0.02%NaN3防腐。2021/9/301652021/9/301662021/9/301674. 應(yīng)用 1）脫鹽) 生物大分子物質(zhì)的分離純化 3）分子量的測(cè)定 4）溶液濃縮 2021/9/30168LogMABCLogM測(cè)V測(cè)LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積） 先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。蛋白質(zhì)的洗脫體積與其分子量有關(guān)2021/9/3

50、0169（三）離子交換層析 （ion exchange chromatography，IEC）1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離 純化方法。2021/9/301701）離子交換劑： 離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。 如羧甲基纖維素離子交換劑組成 纖維素OCH2COO-Na+ 載體 電荷基團(tuán) 反離子2021/9/30171 化學(xué)原料合成 ：樹脂類物質(zhì) 載體 天然材料制成： cellulose sephadex sepharose 陽離子交換劑: 電荷基團(tuán)（）, 反離子（）電荷基團(tuán) 陰離子交換劑: 電荷基團(tuán)（）, 反離子（） 如：DEAE-纖維素， CM-Sepharose2021

51、/9/30172離子交換劑-帶有電荷基團(tuán)的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE) 陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì)) 陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))2021/9/30173兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基 CM CH2COO 磺丙基 SP C3H6SO3DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH32021/9/30174 離子交換葡聚糖 以Sephadex G-25, G-50為骨架，接入離子交換基團(tuán)

52、。 DEAE（QAE） Sephadex A-25，A-50 CM（SP） Sephadex C-25，C-50 A：anion 陰離子 C: cation 陽離子2021/9/30175類型說明功能基反離子DEAE-Sephadex A-25 ，A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-Sephadex A-25 ，A-50強(qiáng)堿性陰離子交換劑二乙氨基己基2-羥丙基氯CM-Sephadex C-25 ，C-50弱酸性陽離子交換劑羧甲基鈉SP-Sephadex C-25 ，C-50強(qiáng)酸性陽離子交換劑磺丙基鈉離子交換葡聚糖2021/9/30176 離子交換劑的選擇a. 強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇

53、：強(qiáng)型：適用的pH范圍廣，制備無離子水 弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì) b. 陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性若pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑2021/9/301772）蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)2021/9/30178pH 值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù)24681012140系統(tǒng) pH+ 蛋白質(zhì)帶正電荷 蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷等電點(diǎn)-2021/9/30179 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理 利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷不同，因而與離子交換劑有不同吸附力而分離。pH6.0pI 6.0 蛋白質(zhì)帶正電pI 6.0 蛋白質(zhì)帶負(fù)電2021/9/301802. 陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程平衡吸附去吸附分離結(jié)束再

54、生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-2021/9/30181Ion-exchange chromatography2021/9/301823. 操作 平衡 上樣 平衡 洗脫 再生1）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。2）洗脫: 增加溶液的離子強(qiáng)度 梯度洗脫法 改變?nèi)芤旱膒H值 3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl處理。4.應(yīng)用 制備純化生物大分子2021/9/30183圖4-39 梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a

55、）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度2021/9/30184（四）疏水層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 從分離純化的機(jī)制看，屬吸附層析類。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì) ，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。2021/9/30185 大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，但分子內(nèi)部存在一個(gè)疏水核心， 欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)?。╤ydrophobic patch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。原理:2021/

56、9/30186 在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進(jìn)行解吸附。2021/9/301872021/9/30188 2. 吸附劑 親水性（如 Sepharose） 基質(zhì)固定相 疏水性（如硅膠、樹脂） 配體 （疏水性基團(tuán)）（苯基、辛基、烷基）2021/9/30189產(chǎn)品名稱 載體 配基 生產(chǎn)公司 苯基Sepharose 4B 瓊脂糖凝膠珠 苯基 Pharnacia 辛基 Sepharose 4B 瓊脂糖凝膠珠 辛基 Pharnacia 烷基交聯(lián)瓊脂糖凝膠珠 瓊脂糖凝膠珠 烷基(Cn)

57、以 色 列 一些商品疏水層析介質(zhì) 2021/9/301903. 操作1） 加樣：樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。2） 洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3） 再生：除去固定相吸附的雜質(zhì) ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。4. 應(yīng)用 主要用于分離純化大分子物質(zhì)。2021/9/30191 （五）親和層析(Affinity Chromatography) 由吸附層析發(fā)展起來的 ，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。 又稱： 功能層析（function chromatography） 生物專一吸附（biospecific adsorption）選擇層析（selective chromatography）

58、2021/9/30192 1.原理 利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。2021/9/30193 將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來，實(shí)現(xiàn)分離提純。2021/9/30194+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附2021/9/30195Affinitychromatography2021/9/301962. 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： 高度的親水性。 極

59、低的非特異性吸附性（惰性）。 具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。 適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴?較好的理化穩(wěn)定性。2021/9/30197可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體）： （按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 最常用的是瓊脂糖，Sepharose 1B到10B2021/9/301983. 配體的選擇 一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。 優(yōu)良配體須具備的條件：1）與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。2）具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。2021/9/30199所要分離的目的產(chǎn)物 相應(yīng)的配基 酶抗體凝集素激素底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗原、病毒、細(xì)胞多糖、糖蛋白、細(xì)胞

60、受體受體、載體蛋白 目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基 2021/9/302004. 偶聯(lián)（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質(zhì)）1）基質(zhì)活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。2021/9/30201溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr 作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2021/9/302022）引入連接臂（space arm） 又稱手臂（spacer ）“接臂” 的目的： 克服影響配基與生物大分子的結(jié)合的空間障礙?！敖颖邸钡耐緩剑?常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前帶有各種手臂的系列載體已有