KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件

1、KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件任務(wù)6 食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定6.1 蛋白質(zhì)測定的基本原理蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 蛋白質(zhì)是以為氨基酸為基本單位、復(fù)雜的含氮生物大分子，主要元素組成()為：C（5055）；H（68）；O（2030）；N（1518）；S（04）。另外，還有P、Fe、Zn、Cu、l等元素。項目四 食品中營養(yǎng)成分檢驗技術(shù)任務(wù)6 食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的測定6.1 蛋白質(zhì)測定的基 氨基酸的特點氨基酸的存在形式 組成蛋白質(zhì)氨基酸有20多種氨基酸。非蛋白氨基酸 已發(fā)現(xiàn)有150多種，存在于各種細(xì)胞組織中，呈游離狀態(tài)或結(jié)合狀態(tài)，其氮為非蛋白氮。 氨基酸的特點氨基酸的存在形式 蛋白質(zhì)系數(shù) 不同蛋白質(zhì)

2、其氨基酸組成的比例不同，所以不同的蛋白質(zhì)，其含氮量也不同。一般含氮量為16 ，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，稱之為蛋白質(zhì)系數(shù)。 蛋白質(zhì)系數(shù) 蛋白質(zhì)測定的基本原理利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量，肽鍵和折射率的性質(zhì)利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)的性質(zhì)。 蛋白質(zhì)測定的基6.2 蛋白質(zhì)測定的方法凱氏定氮法雙縮脲法（快速法）水楊酸比色法（快速法）染料結(jié)合法酸試劑法紅外分析儀6.2 蛋白質(zhì)測定的方法凱氏定氮法雙縮脲法（快速法）水楊 常量凱氏定氮法 原理6.2.1 凱氏定氮法 常量凱氏定氮法 原理6.2.1 凱氏定氮法 KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件適用范圍 適用于各類食品中蛋白

3、質(zhì)含量的測定。試劑 濃H2SO4 CuSO4 K2SO4 40 % NaOH 4 % H3BO3 0.1 M HCl 甲基紅溴甲酚綠指示劑適用范圍KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件 微量凱氏定氮法原理 同常量凱氏定氮法。主要儀器 凱氏燒瓶（100 ml）；微量凱氏定氮裝置。試劑 0.0100 mol/L HCl標(biāo)液；其他同常量凱氏定氮法。操作方法 略 微量凱氏定氮法KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件6.2.2 雙縮脲法原理 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（-CO-NH-），與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，呈現(xiàn)雙縮脲反應(yīng)。在一定條件下其顏色深淺（吸收波長560 nm）與蛋白質(zhì)含量成正比

4、。適用范圍與特點 適用范圍：豆類，油料，米谷等作物種子及肉類。 特點：靈敏度較低，但操作簡單。主要儀器 分光光度計 離心機(jī)（4000 r / min）6.2.2 雙縮脲法原理KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件6.2.3 水楊酸比色法 原理 蛋白質(zhì) 硫酸消化 銨鹽溶液NaClO 一定酸度和溫度 藍(lán)色化合物（可在660 nm進(jìn)行比色）。 主要儀器 分光光度 恒溫水浴箱6.2.3 水楊酸比色法 原理 主要儀器 試劑 氮標(biāo)準(zhǔn)液：(NH4)2SO4 100 2 h 稱取0.4719 g 小燒杯 移入100 ml容量瓶 定容 搖勻 10 mgN / ml 稀釋成2.50 g / ml 試劑6.2.4 紫外

5、分光光度計 原理 蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)殘基(-NH-CR-CO-)，在紫外區(qū)內(nèi)對一定波長(280 nm)的光具有選擇吸收作用，在此波長下，光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度(3 - 8 mg / ml)成直線關(guān)系。6.2.4 紫外分光光度計 6.3 氨基酸總量的測定（氨基態(tài)氮的測定）茚三酮比色法雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法6.3 氨基酸總量的測定（氨基態(tài)氮的測定）茚三酮比色法雙指示6.3.1 雙指示劑甲醛滴定法 原 理 氨基酸含有酸性的-COOH，也含有堿性的-NH2，它們互相作用使氨基酸成為中性內(nèi)鹽，不能直接用堿液滴定它的羧基，當(dāng)加入甲醛時，-NH2與甲醛結(jié)合，起堿性消失，使-COOH基顯示出酸性

6、，可用NaOH標(biāo)液滴定。6.3.1 雙指示劑甲醛滴定法 操作方法 1.樣品(氨基酸20 mg) 250 ml三角燒瓶 加入50 ml水，3滴0.1 中性紅 搖勻 0.05 mol / L NaOH滴定至琥珀色。 2.樣品(氨基酸20 mg) 250 ml三角燒瓶 加入50 ml水，3滴0.1百里酚酞，20 中性甲醛 搖勻，靜置1 min 0.05 mol/L NaOH滴定至淡藍(lán)色。 操作方法KJ01-蛋白質(zhì)和氨基酸的測定課件6.3.2 電位滴定法 原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用NaOH標(biāo)液滴定，依

7、據(jù)酸度計指示的pH值判斷終點。6.3.2 電位滴定法 6.3.3 茚三酮比色法6.3.3 茚三酮比色法實訓(xùn)（一）食品中蛋白質(zhì)含量測定 凱氏定氮法一、實訓(xùn)目的1學(xué)習(xí)凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理。2掌握凱氏定氮法的操作技術(shù)，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質(zhì)含量計算等。實訓(xùn)（一）食品中蛋白質(zhì)含量測定一、實訓(xùn)目的1學(xué)習(xí)凱氏定氮法二、實訓(xùn)原理 蛋白質(zhì)是含氮的化合物。樣品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水溢出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨，并與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系

8、數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。二、實訓(xùn)原理 蛋白質(zhì)是含氮的化合物。樣品與濃硫酸和催化三、儀器與試劑1儀器 定氮儀；凱氏燒瓶；消化爐。2試劑（1）硫酸銅（CuSO45H20）（2）硫酸鉀；（3）硫酸（密度為1.8419g/L）；（4）硼酸溶液（20g/L）；（5）氫氧化鈉溶液（400g/L）；（6）0.01mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；（7）混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份,臨用時混合；（8）黃豆粉。三、儀器與試劑1儀器四、操作流程 樣品消化 樣品蒸餾 硼酸吸收 滴定 結(jié)果分析四、操作流程 五、操作要點1樣品消化 稱取黃豆粉約0.3g（0.001g），移入干燥的10

9、0mL 凱氏燒瓶中，加入0.2g 硫酸銅和6g硫酸鉀，稍搖勻后瓶口放一小漏斗，加入20mL 濃硫酸，將瓶以450 角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，使用萬用電爐，在通風(fēng)櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5h，取下放冷，小心加20mL 水，放冷后，無損地轉(zhuǎn)移到100mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。五、操作要點1樣品消化3堿化蒸餾 量取硼酸試劑20mL 于三角瓶中，加入混合指示劑23滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夾a 關(guān)閉，螺旋夾b 開啟的狀態(tài)下，準(zhǔn)確吸取10.0mL 樣品消化液，由

10、小漏斗流入反應(yīng)室，并以10mL蒸餾水洗滌進(jìn)樣口流入反應(yīng)室，棒狀玻塞塞緊。使10mL 氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，用少量水沖洗立即將玻塞蓋堅，并加水于小玻杯以防漏氣，開啟螺旋夾a，關(guān)閉螺旋夾b，開始蒸餾。通入蒸汽蒸騰10min 后，移動接收瓶，液面離開凝管下端，再蒸餾2min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，準(zhǔn)備滴定。3堿化蒸餾4樣品滴定 以0.01mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色為終點。 同時吸取10.0mL 試劑空白消化液按上法蒸餾操作，得滴定空白液。4樣品滴定六、結(jié)果與分析1數(shù)據(jù)記錄于下表。 數(shù)據(jù)記錄表項目第一次第二次第三次樣品消化液（mL）空白滴定消

11、耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液平均值（mL）六、結(jié)果與分析1數(shù)據(jù)記錄于下表。項目第一次第二次第三次樣品2計算 按下式計算每百克樣品蛋白質(zhì)含量，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。式中 X樣品蛋白質(zhì)含量，g/100g； V1樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL； V2空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L； 0.0140 1.0mL 鹽酸c= 1.000mol / L標(biāo) 液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì) 量，g； m樣品的質(zhì)量，g； F氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；

12、大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。2計算七、注意事項與說明1本法也適用于半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣范圍為2.00g5.00g；液體樣品取樣10.0mL25.0mL（約相當(dāng)?shù)?0mg40mg）。檢測液體樣品，結(jié)果以g/100mL表示。2消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失?？杉尤肷倭啃链蓟蛞后w石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。3消化時應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入30過氧化氫

13、23mL，再加熱消化至完全。七、注意事項與說明1本法也適用于半固體試樣以及液體樣品檢測4硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40，否則氨吸收減弱，造成檢測結(jié)果偏低?？砂呀邮掌恐糜诶渌≈?。5在重復(fù)性條件下獲得兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。6混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。4硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40，否則氨吸收減弱，造成檢測八、思考與討論1、蒸餾時為什么要加入氫氧化鈉溶液？加入量對測定結(jié)果有何影響？2、在蒸汽發(fā)生瓶水中、加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸的作用是什么？若在蒸餾過程中才發(fā)現(xiàn)蒸汽發(fā)生瓶中的水變?yōu)辄S色，馬上補(bǔ)加硫酸行嗎？3、實驗操作過程

14、中，影響測定準(zhǔn)確性的因素有哪些？八、思考與討論1、蒸餾時為什么要加入氫氧化鈉溶液？加入量對測實訓(xùn)（二）電位滴定法測定食品中氨基酸總量一、實訓(xùn)目的 學(xué)習(xí)電位滴定法測定食品中氨基酸總量的基本原理和操作方法。實訓(xùn)（二）電位滴定法測定食品中氨基酸總量一、實訓(xùn)目的 二、實訓(xùn)原理 利用氨基酸兩性電解質(zhì)作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以酸度計控制測定終點。二、實訓(xùn)原理 利用氨基酸兩性電解質(zhì)作用，加入甲醛以固定三、儀器與試劑1儀器 酸度計；磁力攪拌器；10mL 微量滴定管。2試劑及材料（1）36%甲醛：應(yīng)不含有聚合物。（2）0.050mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。（3

15、）醬油。三、儀器與試劑1儀器四、操作流程 樣品處理 總酸含量滴定 氨基酸態(tài)氮含量滴定 空白滴定 結(jié)果分析四、操作流程 五、操作要點1樣品處理吸取醬油5.0mL，加水稀釋并定容至100mL。2樣品測定（1）吸取20.0mL 試樣，置于200mL 燒杯中，加60mL 蒸餾水，開動磁力攪拌器，待攪拌穩(wěn)定后把酸度計的復(fù)合電極小心放入燒杯的合適位置，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，按總算計算公式，可計算總酸含量。五、操作要點1樣品處理（2）準(zhǔn)確加入10.00mL 甲醛溶液，混勻，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液

16、的毫升數(shù)，供計算氨基酸態(tài)氮含量用。（3）同時量取80mL 水，先用0.05mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 為8.2（記錄用去氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，此為測總酸的試劑空白試驗），再加入10.00mL 甲醛溶液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至9.2，第二次所用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為測定氨基酸態(tài)氮的試劑空白對照。（2）準(zhǔn)確加入10.00mL 甲醛溶液，混勻，再用氫氧化鈉標(biāo)六、結(jié)果與分析1數(shù)據(jù)記錄于下表。 數(shù)據(jù)記錄表項目第一次第二次第三次平均值滴定至pH 8.2消耗NaOH 體積（mL）滴定至pH 9.2消耗NaOH 體積（mL）六、結(jié)果與分析1數(shù)據(jù)記錄于下表。項目第一次第二次第三次平均2計算 按下

17、式計算每百毫升樣品中氨基酸態(tài)氮含量，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。式中 X樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100mL； V1測定樣品在加入甲醛后滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； V2空白試驗加入甲醛后滴定至終點所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； c氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L； 0.014 與1.00mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(NaOH)=1.000mol/L 相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；2計算七、注意事項與說明1本法具有準(zhǔn)確快速的特點，可用于各類食品游離氨基酸含量測定。2對固體樣品一般應(yīng)進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后加適量水在50水浴中萃取0.5h，再進(jìn)行檢測。3醬油中的銨鹽影響氨基酸態(tài)氮的測定，可使氨基酸態(tài)氮測定結(jié)果偏高。因此要同時測定銨鹽，將氨基酸態(tài)氮的結(jié)果減去