雙水相萃取的應(yīng)用課件

1、雙水相萃取的應(yīng)用two aqueous phase extraction 主講人：宋孟嬌1組員：于寶云 劉 紅 高健云 李 洋 王立華 劉永花 孫 越 陳美靜 李志鵬2雙水相萃取雙水相系統(tǒng)：因兩種水溶性聚合物水溶液或一種水溶性聚合物的水溶液與鹽溶液混合時(shí)的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統(tǒng)。特點(diǎn)：因使用的溶劑是水，因此稱(chēng)為雙水相，在這兩相中水分都占很大比例(8595)，活性蛋白或細(xì)胞在這種環(huán)境中不會(huì)失活，但可以不同比例分配于兩相，這就克服了有機(jī)溶劑萃取中蛋白容易失活和強(qiáng)親水性蛋白難溶于有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)。3雙水相萃取可分離多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞組織，以及重金屬離子等，近年

2、來(lái)，還應(yīng)用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應(yīng)系統(tǒng)用于酶反應(yīng)，生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵的產(chǎn)物生產(chǎn)與分離的集成。4萃取原理 雙水相萃取與水-有機(jī)相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時(shí),物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等) 的存在和環(huán)境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。物質(zhì)在雙水相體系中分配系數(shù)K可用下式表示： K= C2/ C1其中K為分配系數(shù)，C2和C1分別為被分離物質(zhì)在上、下相的濃度。 5可形成雙水相的雙聚合物體系很多，如聚乙醇(PEG)/葡聚糖(Dx)，聚丙二醇/ 聚乙二醇和甲基

3、纖維素/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無(wú)機(jī)鹽的混合溶液也可形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀(KPi)、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產(chǎn)物的雙水相萃取。PEG/無(wú)機(jī)鹽系統(tǒng)的上相富含PEG，下相富含無(wú)機(jī)鹽。雙水相體系7常用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx) 體系和PEG/磷酸鹽體系。PEG/Dx體系一般用于小規(guī)模地分離生物大分子、膜、細(xì)胞等，PEG/無(wú)機(jī)鹽體系主要用來(lái)大規(guī)模地提純酶，這是因?yàn)镻EG/無(wú)機(jī)鹽體系的萃取專(zhuān)一性更高，葡聚糖價(jià)格昂貴的緣故。8雙水相萃取的基本特點(diǎn)(1) 體

4、系有生物親和性。兩相中的水分含量通常高達(dá)85%95% ，所用的聚乙二醇PEG、葡聚糖dextran等高聚物或磷酸鹽、硫酸鹽等無(wú)機(jī)鹽對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)無(wú)毒害，甚至還有穩(wěn)定保護(hù)作用，而且相界面張力比水-有機(jī)或有機(jī)-有機(jī)兩相體系的界面張力要小13 個(gè)數(shù)量級(jí)。由于生物活性物質(zhì)在有機(jī)溶劑中易變性，再加上有的生物活性物質(zhì)親水性很強(qiáng)，不溶于有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑萃取等分離技術(shù)難以在生物活性物質(zhì)的分離中發(fā)揮其效能。10(2) 與常用的親和層析相比，雙水相萃取能夠在較少的溶液量和較短的操作時(shí)間內(nèi)獲得較高產(chǎn)量的產(chǎn)品。另外，操作能夠容易、精確地按比例放大，非常適合大規(guī)模應(yīng)用，可進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。而親和層析由于操作

5、難于放大，應(yīng)用受到限制。(3) 聚合物的濃度和分子質(zhì)量、無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)和濃度、pH 以及溫度等均能影響被分配物質(zhì)在兩相間的分配，所以操作容易進(jìn)行控制，進(jìn)而達(dá)到目的產(chǎn)物的最佳萃取條件。(4) 可與細(xì)胞破碎相結(jié)合，即細(xì)胞懸浮液中加入PEG和無(wú)機(jī)鹽后再通入珠磨機(jī)進(jìn)行破碎，然后用離心機(jī)分相。既節(jié)省了萃取設(shè)備和時(shí)間，又避免了胞內(nèi)酶的損失。11(5) 能進(jìn)行萃取性的生物轉(zhuǎn)化。在一些雙水相體系中可將發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的生物轉(zhuǎn)化與下游處理的第1步相結(jié)合，即生物反應(yīng)在其中一相中進(jìn)行，同時(shí)生成的反應(yīng)產(chǎn)物被連續(xù)萃取到另一相中。不僅解決了產(chǎn)物反饋抑制作用造成的產(chǎn)量低的問(wèn)題，而且酶在高聚物溶液中比在緩沖液中更穩(wěn)定，活性更大。

6、因?yàn)樯锓磻?yīng)和生物產(chǎn)物的提取同時(shí)進(jìn)行，尤其適于連續(xù)生產(chǎn)。12雙水相萃取技術(shù):雙水相萃取技術(shù)是一種高效溫和的新分離技術(shù),在生物制藥、分析檢測(cè)、稀有金屬分析等方面均有應(yīng)用,特別是在生化分離工業(yè)中,比傳統(tǒng)的萃取方法有著更加明顯的技術(shù)和條件優(yōu)勢(shì)。14雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用雙水相萃取在生物和食品工業(yè)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用發(fā)展較快。到目前為止，雙水相萃取應(yīng)用及研究主要集中在以下幾個(gè)方面：(1) 提取酶和蛋白質(zhì)。這是雙水相體系研究和應(yīng)用最多的方面，發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液、植物、動(dòng)物組織中細(xì)胞內(nèi)、外的酶和蛋白質(zhì)均可用雙水相體系來(lái)提取。工業(yè)上已有幾種雙水相體系用于從發(fā)酵液中分離提取蛋白質(zhì)和酶，絕大多數(shù)是用PEG作上相成相

7、聚合物，葡聚糖、鹽溶液和羥甲基淀粉的其中一種作下相成相物質(zhì)。15(2) 進(jìn)行萃取性生物轉(zhuǎn)化。應(yīng)用實(shí)例有：利用葡萄糖和淀粉生產(chǎn)乙醇、利用葡萄糖生產(chǎn)丙酮丁醇、利用淀粉和纖維素水解生產(chǎn)葡萄糖、水解酪蛋白、發(fā)酵生產(chǎn)乳酸、將青霉素G轉(zhuǎn)化為6-氨基青霉烷酸等。(3) 食品工業(yè)中用來(lái)從酸水解產(chǎn)物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等風(fēng)味物質(zhì)。在生物技術(shù)方面，可用來(lái)提取DNA。(4) 萃取細(xì)胞、細(xì)胞器、膜等粒子。大多數(shù)都是用親和萃取方法來(lái)達(dá)到目的的。(5) 應(yīng)用于液- 液分配層析(LLPC)。將一種聚合物連接在固體顆粒(支持物) 上，另一種聚合物的溶液作為流動(dòng)相，這種柱層析技術(shù)可分離蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞混合物。17（)

8、 應(yīng)用于金屬離子分離中：傳統(tǒng)的金屬離子溶劑萃取方法存在著溶劑污染環(huán)境、對(duì)人體有害、運(yùn)行成本高、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。近年來(lái)，利用雙水相技術(shù)萃取分離金屬離子達(dá)到了較高的水平。 用雙水相技術(shù)直接從發(fā)酵液中將丙酰螺旋酶素與菌體分離后進(jìn)行提取，可實(shí)現(xiàn)全發(fā)酵液萃取操作，采用PEG/Na2HPO4體系，最佳萃取條件是PH=8.08.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小試收率達(dá)69.12，對(duì)照的乙酸丁酯萃取工藝的收率為53.14%。18()中草藥中有效成分的提?。航陙?lái)有關(guān)雙水相提取天然藥物中有效成分的報(bào)道逐年增多。以乙醇-磷酸氮二鉀-水雙水相體系萃取甘草有效成分，在最佳條件下，分配系數(shù) (

9、K)達(dá)12.8， 收率(Y)高達(dá)98.3%。用雙水相萃取體系富集分離銀杏葉浸取液的研究，也有良好的分配系數(shù)和分離效果。 中藥中含有大量的有機(jī)化合物且成分十分復(fù)雜，提高中草藥中有效成分提取及分離技術(shù)對(duì)我國(guó)中醫(yī)中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)有很大的促進(jìn)作用。中草藥有效成分分子中多具有疏水性結(jié)構(gòu)，因此雙水相萃取技術(shù)在中草藥有效成分分離純化中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。 19案例利用聚乙二醇(PEG)-硫酸銨(NH4)2SO4雙水相體系從酸性溶液中萃取分離金。試驗(yàn)考察了萃取體系中的pH值、PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG的聚合度、萃取溫度等條件對(duì)萃取率的影響;經(jīng)過(guò)三級(jí)萃取,金萃取率達(dá)到97.56%,富集金的PE

10、G相無(wú)需反萃取可直接用Zn置換出單質(zhì)金,還原率達(dá)到95.16%。雙水相萃取為回收廢棄印刷線路板中的金提供了一種新的可行方法。20不同的雙水相體系對(duì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的萃取分離效果，對(duì)聚乙二醇/無(wú)機(jī)鹽成相系統(tǒng)進(jìn)行丁系統(tǒng)的研究，確定PEG1000/NazHP04為研究體系，并考察體系pH值、無(wú)機(jī)鹽對(duì)雙水相體系分配系數(shù)和純化系數(shù)的影響。當(dāng)PEG 1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%, NazHP04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，雙水相體系對(duì)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的分離系數(shù)和純化系數(shù)分別為2.36和2.94 021對(duì)三種雙水相體系進(jìn)行研究，通過(guò)制作相圖，分析得出PEG（/NH4）2SO4雙水相體系是萃取糖化酶最合適體系。研究PEG

11、分子量、PEG溶液濃度、（NH4）2SO4溶液濃度對(duì)糖化酶分配系數(shù)、回收率影響，確定萃取糖化酶最佳條件，即PEG分子量為20 000、PEG溶液濃度為28%、（NH4）2SO4溶液濃度為20%時(shí)，分配系數(shù)為0.15，糖化酶回收率最高為96.1%。 22用雙水相萃取法從工業(yè)粗酶粉中分離純化淀粉酶。實(shí)驗(yàn)表明，由21%22%PEG400和14%17%(NH4）2SO4所組成雙水相體系，在室溫下對(duì)淀粉酶的酶活回收率可達(dá)94.84%，分配系數(shù)可達(dá)17.1。另外，還有雙水相萃取果膠酶、無(wú)花果蛋白酶、粗狀假絲酵母脂肪酶等研究，也都取得滿意結(jié)果 24運(yùn)用雙水相技術(shù)分離提取鈍頂螺旋藻中藻藍(lán)蛋白，對(duì)構(gòu)成雙水相體系

12、中不同分子量PEG和酒石酸鉀鈉濃度影響進(jìn)行分析。確定雙水相組成體系為16%PEG2000和25%酒石酸鉀鈉、pH值為6.0，在此體系中藻藍(lán)蛋白主要分布在上相，最高純度3.69、分配系數(shù)20.7、回收率94.56%。多次雙水相萃取有利于藻藍(lán)蛋白純度提高，3次雙水相萃取后，藻藍(lán)蛋白純化倍數(shù)達(dá)4.15。25親水性離子液體四氟硼酸1丁基3甲基咪唑（BmimBF4）和NaH2PO4制備雙水相體系，萃取分離莧菜紅。結(jié)果表明：NaH2PO4加入量為22.5 g、離子液量為1.02.0 ml、莧菜紅溶液量為1.5 ml、溶液pH值46時(shí)，離子液體雙水相體系對(duì)莧菜紅具有較高萃取率（90%）。 27用聚乙二醇硫酸

13、銨雙水相體系分離常見(jiàn)食用色素葉綠素銅鈉鹽（SCC），總量為50 ml、10%SCC溶液體積為1.0 ml、聚乙二醇濃度為30%、硫酸銨10.0 g、表面活性劑Triton X100 1.0 ml，在中性或微堿性條件下，常見(jiàn)離子不干擾SCC萃取，萃取率達(dá)97.98%。28利用乙醇/硫酸銨組成雙水相體系測(cè)定糧食中鉬含量。該法利用乙醇增敏作用提高體系吸光度，消除常見(jiàn)離子鐵干擾，具有較高選擇性和靈敏度。在乙醇硫酸銨雙水相體系中，所形成 糧食與油脂乙醇相對(duì)鉬與水楊基熒光酮紅色絡(luò)合物具有增敏作用，方法檢出限（3S/N）為0.06 mg/L，回收率為97.4%100.1%。 29甘草是一種應(yīng)用價(jià)值很高的中草

14、藥，甘草的主要成分是具有甜味的皂苷甘草皂苷?；谂c水互溶的有機(jī)溶劑和鹽水相的雙水相萃取體系具有價(jià)廉、低毒、較易揮發(fā)等特點(diǎn)，采用與水互溶的有機(jī)溶劑的新型雙水相體系萃取研究從甘草中提取甘草酸鹽的新工藝，結(jié)果提取甘草酸鹽的最佳溶劑為乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系，此體系的兩相分配完全，分配系數(shù)達(dá)12.8，收率為98.3%。此雙水相體系具有無(wú)需反萃取和避免使用黏稠水溶性高聚物等特點(diǎn)，易回收、易處理、操作簡(jiǎn)便。30中藥黃芩是一種療效確切的傳統(tǒng)中藥，黃芩苷是黃芩主要有效成分,通過(guò)采用非離子表面活性劑聚乙二醇-磷酸氫二鉀-水雙水相體系分離純化黃芩苷，萃取率為98.6%。此方法所形成雙水相體系操作簡(jiǎn)便，萃取率高，

15、方法重復(fù)性好，可適用工業(yè)化生產(chǎn)。31采用微膠囊與雙水相聯(lián)合萃取技術(shù)提取柑桔精油。通過(guò)調(diào)整-環(huán)糊精和硫酸鈉的濃度比，可有效控制囊化萃取物中柑桔精油的質(zhì)量，總收率高達(dá)96%以上。將微膠囊技術(shù)和雙水相萃取技術(shù)相結(jié)合用于提取柑桔精油，不僅能提高柑桔精油的提取率和純度，而且還能避免提取過(guò)程中的高溫、氧化、聚合等情況的發(fā)生，有效地保護(hù)柑桔精油的天然組分。32雙水相萃取提純白黎蘆醇 首先進(jìn)行了雙相體系的選擇，然后考察雙相萃取虎仗的提取也結(jié)果和有機(jī)溶 劑萃取虎仗提取液的結(jié)果。兩種體系萃取結(jié)果比較后得出：雙相萃取時(shí)白藜蘆醇的 損失率為7.72%。稍高于有機(jī)溶劑萃取的損失率5.81%，但是雙相萃取中白藜蘆醇含 量

16、達(dá)34.29%，其含量高出有機(jī)溶劑萃取的5.81%。因此雙水相體系可替代氯仿/水體 系對(duì)虎仗提取液進(jìn)行初步分離，方便產(chǎn)品進(jìn)一步的富集。 33雙水相萃取是一項(xiàng)可以利用不復(fù)雜的設(shè)備，并在溫和條件下進(jìn)行簡(jiǎn)單的操作就可獲得較高收率和純度的有效成分的新型分離技術(shù)。目前利用雙水相萃取技術(shù)從食品及發(fā)酵工業(yè)生物材料中提取有效成分的研究已經(jīng)引起了人們的重視。由于這些生物材料中所含的化合物眾多，而雙水相萃取技術(shù)具有較高的選擇性和專(zhuān)一性，因此，利用這項(xiàng)技術(shù)有希望為從食品及發(fā)酵工業(yè)生物材料中提取有效成分開(kāi)辟了一條嶄新的思路。雙水相萃取技術(shù)工業(yè)應(yīng)用上的問(wèn)題34但是,雙水相萃取技術(shù)目前仍不是十分成熟,理論及技術(shù)均存在一定

17、的問(wèn)題。盡管雙水相體系的分配機(jī)制已成為研究重點(diǎn),但并未徹底清楚; 體系的物理、化學(xué)性質(zhì)還未完全了解,導(dǎo)致難以達(dá)到最佳萃取條件,因而應(yīng)用有限。成相聚合物價(jià)格昂貴是阻礙該技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的主要因素。葡聚糖是醫(yī)療上的血漿代用品，價(jià)格很高，用粗品代替精制品又會(huì)造成葡聚糖相粘度太高，使分離困難。35新型雙水相系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)： 在生物物質(zhì)分離過(guò)程中得到應(yīng)用的雙水相系統(tǒng)有2類(lèi)：非離子型聚合物/非離子型聚合物/水系統(tǒng)和非離子型聚合物/無(wú)機(jī)鹽/水系統(tǒng)。因?yàn)檫@2類(lèi)系統(tǒng)所用的聚合物無(wú)毒性, 己被許多國(guó)家的藥典所收錄, 而且其多元醇、多元糖結(jié)構(gòu)能使生物大分子穩(wěn)定。五、雙水相萃取技術(shù)進(jìn)展及展望36 但在實(shí)際應(yīng)用中,這2類(lèi)

18、雙水相系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn), 前者體系對(duì)生物活性物質(zhì)變性作用低, 界面吸附少, 但是所用的聚合物如葡聚糖價(jià)格較高, 而且體系黏度大, 影響工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的進(jìn)展；后者成本相對(duì)低, 黏度小, 但是由于高濃度的鹽廢水不能直接排入生物氧化池, 使其可行性受到環(huán)保限制, 且有些鹽對(duì)敏感的生物物質(zhì)會(huì)在這類(lèi)體系中失活。37 因此, 尋求新型雙水相體系成為雙水相萃取技術(shù)的主要發(fā)展方向之一, 新型雙水相體系的開(kāi)發(fā)主要有廉價(jià)的雙水相系統(tǒng)及新型功能雙水相系統(tǒng)。廉價(jià)雙水相系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)目前主要集中在尋找一些廉價(jià)的高聚物取代現(xiàn)用昂貴的高聚物, 如采用變性淀粉、麥芽糊精、阿拉伯樹(shù)膠等取代葡聚糖, 羥基纖維素取代PEG等。38對(duì)新型雙水相系統(tǒng)的探索有：PEG/UCON(乙烯基氧與丙烯基氧共聚物的商品名）/水體系、UCON/水體系、EOPO環(huán)氧乙烷(EO)和環(huán)氧丙烷(PO)的隨機(jī)共聚物簡(jiǎn)稱(chēng)EOPO/羥基淀粉/水體系和EOPO/水體系等。這些體系分相的依據(jù)仍是聚合物之間的不相溶性, 但此性質(zhì)與特定的臨界溫度有關(guān)。此類(lèi)雙水相系統(tǒng)也被稱(chēng)作熱分離型雙水相系統(tǒng), 它們的優(yōu)點(diǎn)之一是聚合物易于回收可實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用。3940參考文獻(xiàn)1呂斌，陳有容，陳舜勝.雙水相萃取技術(shù)及其