蛋白質結構解析技術研究現(xiàn)狀與方向

1、蛋白質結構解析技術研究現(xiàn)狀與方向摘要：蛋白質是生物體維持生命活動不可或缺的功能性大分子物質，解析蛋白質結構對于人們了解蛋白質的 生物學功能及其生理特性具有重要意義。近些年來，蛋白質結構解析技術不斷發(fā)展，除了傳統(tǒng)意義上的 X射線晶體衍射法和核磁共振技術等，具備高分辨率的冷凍電鏡技術的出現(xiàn)令此領域有了革命性的進 步。文章分析及比對了蛋白質結構解析技術的作用機制、技術進展以及它們未來的研究方向。關鍵詞：蛋白質結構；X射線晶體衍射；核磁共振；冷凍電鏡蛋白質是生物的生命進程中的主要功能性大分 子物質，結構生物學即利用蛋白質分子空間結構的 解析來分析蛋白質生物學功能，并進一步研究生物 體生命活動分子機制囚

2、。故解析蛋白質分子結構是日 前較為熱門的研究方向$現(xiàn)階段對蛋白質分子空間 結構的解析方法主要有較為傳統(tǒng)的核磁共振技術 (nuclear magnetic resonance)X 射線晶體衍射法(X- ray crystalline diffraction)以及近期研究較多的冷凍 電鏡技術(Cryo-Electron Microscopy)2等 $一、X射線晶體衍射法自從1895年倫琴發(fā)現(xiàn)X射線后，物理學家們就 開始探索X射線的特性及其應用方向叫在1934年， 貝爾納和克勞福特得到了第一張蛋白質(胃蛋白酶) 晶體的X射線衍射圖片$ 1953年，蛋白質晶體學家 佩魯茨通過將重金屬粒子引入蛋白晶體里

3、，進行同 晶置換來解決蛋白晶體X射線衍射相位問題，提出 了蛋白質晶體分子結構可測定型的理論基礎，并進 行了低分辨率的蛋白晶體衍射解構凱歷史上，用X 射線晶體衍射法第一個測定蛋白質大分子結構并對 其分子結構進行解釋的是布萊克和菲利普斯，他們 分別測出了溶菌酶的三維空間結構并解釋了其分子 作用機理叫后期，X射線大多由同步輻射光源產(chǎn)生。X射線衍射法測定蛋白質空間結構時，需要先 對目標蛋白進行純化及結晶$解析蛋白晶體結構所 涉及的X射線波長約為1A，這是因為蛋白晶體結構 中的分子均為規(guī)律性分布，且晶體內(nèi)原子間的距離 與此波長范圍的數(shù)量級相同時$當光打到蛋白晶體 上，蛋白晶體內(nèi)每個原子都產(chǎn)生次生射線相互

4、疊加 且干涉，且形成強X射線衍射成像。其晶體衍射狀況 和晶體自身結構相關，具備強烈的規(guī)律性及特征性$ 其衍射強度與單位晶胞中的重金屬原子排列周期及 方式等特性相關，衍射的方向和單位晶胞的大小及 形狀等相關e$人們利用晶體中衍射位點的間距及排 列分析蛋白晶體結構的排列規(guī)律及方式，并通過計 算機輔助計算，利用衍射強度的不同，分析蛋白空間 結構中單個原子的坐標位點%8，以此解構蛋白晶體$二、核磁共振技術核磁共振包括固相和液相技術，其最大特點是 液相核磁共振技術$固相核磁共振技術主要用于不 可溶蛋白結構，而液相核磁共振技術的應用更為廣 闊，它可以在液相環(huán)境中，在各類如溫度、離子濃度 及pH值等因素接近

5、生理條件情況下，對蛋白進行解 構。1978年，核磁共振技術首次被用于蛋白質結構的 解析，獲得首個高分辨率病毒衣殼蛋白三維結構(西 紅柿叢矮病毒淚；在2008年，利用固體核磁共振技 術輔助電子顯微鏡，科學家獲得了 ！片層結構的淀 粉樣纖維蛋白的完整結構，此蛋白與阿爾茨海默病 關聯(lián)緊密，有助于人們對此病癥分子機理及診療手 段的研究網(wǎng);核磁共振技術中取得重要進展領域之一 是通過核磁共振技術無損獲得細胞中分子結構信 息，2009年，有研究顯示，核磁共振技術展示了泛素 在細胞內(nèi)外質子交換速率之差，以及細胞中蛋白 FKBP12與免疫抑制劑相互作用方式明，令人類社會 進一步了解了分子及原子水平中生物大分子功

6、能 ， 以及蛋白質結構和功能的關系&在應用液相核磁共振技術對蛋白結構進行研究 的過程中，首先需要通過同位素對蛋白樣品進行標 記，主要是在培養(yǎng)基中利用15N對氮源標記、利用13C 對碳源標記，用同位素標記的碳源或氮源為唯一碳 素或氮素的來源&通過核磁共振技術處理后，需要指 認核磁共振譜圖上的化學位移，即得到蛋白結構中 可形成核磁共振記號的每個原子化學位移的數(shù)值& 包括主鏈上及側鏈上每個原子的化學位移&化學位 移指認可通過主鏈試驗HNCA、HN （CO）CA等或側 鏈特殊實驗（HB）CB（CGCD）HD等確認$12&。正確選擇 原始結構是后續(xù)步驟的重要基礎，通過一些自動化 軟件，如CYANA中的C

7、ANDID軟件包，或ARIA等問, 確認NOE約束歸屬而獲得粗糙的蛋白原始折疊空 間構像&在此基礎上，繼續(xù)研究，獲得其結構約束，進 一步通過如 ANSO、SANE、Xplor-NIH 或 CYANA 等 軟件計算結構，結構確認后最后通過如AMBER、 CHARMM以及INSIGHT等模擬分子動力學的軟件 進行蛋白結構的精修。三、冷凍電鏡技術冷凍電鏡技術，即冷凍電子顯微鏡技術網(wǎng),通過 將樣品迅速冷凍固定于玻璃態(tài)不定型溶液里，用透 射電鏡在低溫條件下顯像，再通過圖形處理及后期 計算解析樣品空間結構。此法具有樣品無須結晶、可 研究的生物分子跨度達到12個量級、所需樣品量 少、樣品分辨率已至（近）原子

8、水平等優(yōu)點，突破了研 究生物大分子的各類難題&近幾年，冷凍電鏡技術的 長足發(fā)展一是來自硬件的更新DDD （Direct electron detector，自接電子檢測相機）的出現(xiàn)，DDD 具備高分辨的成像裝備，能直接檢測電子二是來 源于圖形圖像處理軟件的進步， 可分辨較低分子量 的小分子蛋白和細胞器，并可對于樣品漂浮而產(chǎn)生 的偏差進行糾正&冷凍電鏡技術包括了樣品分離純化、 電鏡樣品 的制備、蛋白數(shù)據(jù)搜集及處理等步驟。冷凍電鏡中所 需樣品純度需為90%至95%以上，對于純化較困難 的蛋白樣品，后期可進行軟件數(shù)據(jù)模擬純化以區(qū)別 不同狀態(tài)樣品。制備電鏡樣品時，通過液氮冷卻的（ 烷將含水樣品速凍，將

9、水分子轉為玻璃態(tài)非晶體冰, 樣品懸浮于其中，用于減少電子輻射，保持其天然構 像閩。然后通過電鏡進行數(shù)據(jù)的收集，數(shù)據(jù)的收集量 來源于被測蛋白樣品的均一性、分辨率、對稱性及成 像質量等，對于均一性差、分辨率差以及不對稱分子 通常需要采集大量粒子數(shù)據(jù)，約收集5到15萬個數(shù) 據(jù)才可達到近原子分辨率&粒子數(shù)據(jù)收集后需要進 行進一步的處理，首先要先確定粒子的參數(shù)，每個粒 子圖需確定5類參數(shù)，分別為平移的自由度X和Y （兩個平面中）、旋轉的自由度及?。▋蓚€離開平面 中）和#（一個平面中）$切，其中從旋轉的自由度獲得 了粒子空間三維數(shù)據(jù)，利用對位可消除一個平面中 的自由度,可通過重構軟件SPIDER、XMIP

10、P及E- MAN2等的計算用以確認每個粒子相關參數(shù)&然后， 根據(jù)K均值聚類等算法進行二維分類，用以估算粒 子分布及取向、粒子數(shù)據(jù)質量等，二維分類后通過中 心截面原理利用共價線、RCT等方法重構樣品的空 間三維結構，而后進行三維分類和模型的精修&三維 分類可確認不同粒子的空間取向、空間構像及組成 和結構等，而獲取高分辨率空間結構，常用FRE- ALIGN和RELION軟件閩。對模型進行精修時，可利 用投影匹配的方法進行比對，最終大幅度提高物質 空間結構的分辨率&最后通過FSC曲線對分子結構 的分辨率進行評估，通常分辨率在15A以上，可分辨 蛋白亞基的分界線；分辨率在10A以上可辨認二級 結構密度

11、;分辨率在4A以上可分辨蛋白主鏈；當分 辨率在3A左右，即可辨別氨基酸殘基側鏈基團等四。四、未來方向發(fā)展蛋白結構解析技術對于蛋白分子的結構、生物學 功能及其生理特性的了解和應用具有重要的意義& 近年來，多種蛋白結構解析技術的并行發(fā)展，同樣對 結構生物學的發(fā)展發(fā)揮了重要的作用&X射線晶體衍射法較為主流和經(jīng)典，2009年世 界上第一臺X射線自由電子激光裝置建成刖，自由電 子激光形成的射線是具備短時間高強度的脈沖，對不 能結晶的蛋白結構、超小晶體以及受損晶體可獲得衍 射成像，使人們對生物大分子結構通過X射線衍射 法的解析方式有了另一種不同且全新的理解，在 RCSB Protein Data Bank

12、中通過X射線晶體衍射法解 析的蛋白結構占比約88%。但依賴于大分子晶體的 制備，對于許多無法結晶的物質存在著結構的難度。 利用同步輻射光源解析的主要是靜態(tài)或者微動態(tài)蛋 白晶體結構，利用X射線自由電子激光解析的則是 ps甚至fs量級的蛋白動態(tài)空間構型四，被認為有可能 為生物大分子解構方式帶來大跨步的躍進。核磁共振技術可獲得蛋白的靜態(tài)和動態(tài)結構， 在20世紀末期，只有相對分子質量較小(25k)的蛋 白空間結構可通過核磁共振技術解構。后因核磁共 振設備的不斷更新，以及新的核磁脈沖和蛋白標定 技術的發(fā)現(xiàn)，核磁共振技術以及可以解構的蛋白已 遠大于25k,甚至可解構超大蛋白，如分子量大小為 幾十萬的蛋白空

13、間結構。不光如此，液體核磁共振技 術更大的優(yōu)越性表現(xiàn)在可解構蛋白分子在溶液環(huán)境 中的動態(tài)結構，它可利用核磁弛豫現(xiàn)象研究原子水 平下的多位點的蛋白動力學性質。在生物體中，蛋白 大多具備功能性，故靜態(tài)空間結構的解構往往不能 完全反映蛋白功能性，故蛋白動態(tài)結構的解析是對 于蛋白生物學活性研究的關鍵一環(huán)$近些年核磁共 振技術發(fā)展到可研究更高分子量的蛋白大分子的動 態(tài)結構，如選擇性標記或C代樣品制備24，可獲得更 多長程約束,提高解構質量,如TROSY(Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy，橫弛豫優(yōu)化脈沖) 的出現(xiàn)，可指認化學位移及解析解構四。但多測定

14、的 為分子量較小的大分子類物質，可解析的蛋白結構 有限。故核磁共振技術，特別是液相技術可研究蛋白 動態(tài)結構、功能及其動力學特性，有其獨到之處，雖 然如此，但由很多實驗技術還不夠成熟，不具備普適 性，還需要繼續(xù)分析和改進$最近發(fā)展迅猛的冷凍電鏡技術，可測定非晶體 生物大分子類物資，通過冷凍電鏡技術可利用其高 分辨率能觀察到小分子物質、解析小分子蛋白以及 不對稱樣品等。冷凍電鏡對蛋白質結構解析技術的 發(fā)展在醫(yī)學領域做出重要貢獻。20世紀末，因冷凍電 鏡對生物對稱性樣品特有的高度解析性，張景強得 到了分辨率僅為0.8nm的家蠶質多角體病毒，在病 毒蛋白結構研究及針對病毒致病機制對應藥物研制 方面功不可沒四;清華大學研究團隊在2016年第一 次利用冷凍電鏡獲取了線粒體中呼吸鏈超級復合蛋 白空間結構，指明了以其為靶向物質藥物的研究方 向；中國科學院生物物理研究所李國紅和朱平研究 組合作獲得了 30nm染色質左手雙螺旋高分辨率三 維結構，有助人類對癌癥等病癥分子機制研究，并 為人類基因組計劃做出了重要貢獻$同時冷凍電鏡 技術伴隨著人類社會對生命科學領域研究的重視而 逐漸發(fā)展起來，清華大學王宏偉研究組于2017年首 次提出且利用冷凍電鏡成像理論新方法過焦成像技 術得到高分辨蛋白質空間結構(30)$ 2018年浙江大學 冷凍電鏡中心首次解析了蛋白質原