實驗四培養(yǎng)基的配制與滅菌

1、)、分裝。6套做一包，待滅菌。實驗四 )、分裝。6套做一包，待滅菌。一、實驗教學(xué)目標基本與要求1、明確培養(yǎng)基的配制原理。2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。3、熟悉準備微生物培養(yǎng)準備器械的方法二、實驗內(nèi)容1.無菌移液管、無菌平皿，準備無菌水、棉塞（試管和在三角瓶） ；2.配制五類菌培養(yǎng)基 (細菌、放線菌、霉菌、酵母培養(yǎng)基，雙歧桿菌厭氧培養(yǎng)基(每人參與配制一種，但要求四種都會配 )3.高壓蒸汽滅菌，滅菌后擺放斜面；4.實驗室常用消毒滅菌方法 (示范)。三、實驗操作（一）吸管的包扎與滅菌：? 在距其粗頭頂端約 0.5cm 處，塞一小段 1.5cm 長的棉花。? 棉花要塞得松緊恰當（過緊，吹吸液體太

2、費勁；過松，吹氣時棉花會下滑） ；? 然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙條的的近左端，與報紙約呈 60o角，并將右端多余的報紙打一小結(jié)。（二）培養(yǎng)皿的滅菌：以舊報紙密密包緊，一般以（三）無菌水的制備無菌水為下一次微生物分離實驗中所需要的材料。1.無菌分離試管水的準備試管中裝入 4.5ml 自來水，每組共準備 12支，蓋上塑料蓋，包扎；2.三角瓶無菌水的準備三角瓶裝入 99ml 水，共裝 3瓶，封口膜包扎，外包牛皮紙或報紙。3.無菌玻璃珠的準備三角瓶中裝入玻璃珠，封口膜包扎，外包牛皮紙或報紙。（四）培養(yǎng)基的配制：1、標識同學(xué)們先將試管和三角瓶貼好標簽。注明培養(yǎng)基名稱，組別，日期。標簽粘貼位置在離

3、管口 1/3 管身處。注意：標簽用記號筆書寫，以防高溫滅菌時蒸汽模糊字跡。2、培養(yǎng)基的配制程序稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量自來水，玻棒攪勻，加熱溶解。調(diào) pH值：用 1N NaOH 或 1N HCl 調(diào) pH，用 pH試紙對照。定容：將溶化的培養(yǎng)基倒入量筒中，補充水量至所需體積；加瓊脂溶化：加所需量的瓊脂，加熱融化并不斷攪拌。3、培養(yǎng)基配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (常用的細菌培養(yǎng)基 )（1組）（p275）牛肉膏 0.5克，蛋白胨 1克， NaCl 0.5克，水 100mL，瓊脂 2g ，pH7.27.4高氏一號培養(yǎng)基 (常用的放線菌培養(yǎng)基 )（2組）（p

4、275）可溶性淀粉 2.0g， KNO300.1g ，K2HPO40.05g，MgSO40.05g，NaCl 0.05g，F(xiàn)eSO40.001g，水 100mL，瓊脂 2g ， pH7.27.4馬鈴薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）瓊脂培養(yǎng)基（ 3組）（p276） （用于分離和培養(yǎng)真菌之用，是一種半合成培養(yǎng)基） ，其配方如下：去皮馬鈴薯 20g （或鮮豆芽 10g），葡萄糖 5g，自來水 100mL ， 瓊脂 2g ，pH 自然 。察氏培養(yǎng)基 (常用的霉菌培養(yǎng)基 )（4組）（p276）蔗糖 3g，NaNO3 0.3g, KH2PO4 0.1g ，KCl 0.05g ，MgSO4 0.05g，F(xiàn)eS

5、O4 0.001g，瓊脂 2g，自來水 100mL ，pH 自然 。兩歧雙坡桿菌 1.1852 培養(yǎng)基（ 5組）（p281）大豆蛋白胨 0.5g，胰胨 0.5g，酵母提取物 1.0 g，葡萄糖 1g，CaCl2 0.02g，MGSO4 0.04g，K2HPO4 0.1 g，半胱氨酸鹽酸鹽 0.05 g，蒸餾水100mL，pH7.2培養(yǎng)基配制注意事項（1）若培養(yǎng)基中含有牛肉膏、酵母膏等非固體培養(yǎng)基，將基置于另一小燒杯中去皮稱量后，加入少量蒸餾水中加熱溶化，再倒入搪瓷杯溶液中。（2）如果配方中含有淀粉，先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其他藥品，待完全熔化后補足所失水分。（

6、3）豆芽汁的制作：稱取鮮黃豆芽，置于搪瓷杯中，加入配制水量，小火煮 20-30min，紗布過濾，補足水分。（4）調(diào) pH。要緩慢少量且多加攪拌。培養(yǎng)基配方為自然 pH 時，不用調(diào)節(jié)。（5）配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化時，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。五、培養(yǎng)基的分裝將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。固體培養(yǎng)基要趁熱裝。分裝時要避免培養(yǎng)基粘染管（瓶）口，引起污染。分裝量可分為下面幾方面：（1）斜面：裝量為管長的 1/4-1/5。（2）液體培養(yǎng)基、高層培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基：裝載量不超過管長的 1/3。1/5。注。1210C 滅菌

7、20 1/5。注。1210C 滅菌 20 分鐘。(最好用開水 )，水面與底架0時 滅菌(Autoclave) 滅菌 殺菌鍋的使用? 每組同學(xué)為全班每位同學(xué)制備 1支斜面（約 4ml，按 30人計，共 120ml）? 配制本班同學(xué)每人兩塊平板（每板約 10ml，按 30人計，共 600ml ）? 每組同學(xué)共需配制的培養(yǎng)基量為 800ml? 分裝試管 30 支? 余下培養(yǎng)基裝入三角瓶中，分 4瓶分裝。1、斜面的分裝與包扎斜面培養(yǎng)基的分裝按右圖所示，將培養(yǎng)基趁熱分裝到潔凈的試管中，培養(yǎng)基的高度約為試管高度的意：分裝時不要將培養(yǎng)基沾在管口和試管上段，以免引起污染。2.試管的捆扎包扎 每 7-10支試管

8、用線繩捆成一捆，并且在管口外面包上一層牛皮紙或報紙，然后，用線繩扎好。在每捆試管外掛上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、配制日期和制作者姓名3、三角燒瓶的包裝平板培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基的制作只能用裝在容器內(nèi)進行滅菌后在使用時倒入平板。六、滅菌：高壓蒸汽滅菌，1打開高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水平齊為宜。高壓蒸汽滅菌鍋的構(gòu)造如右下圖所示。2將扎好的試管管口向上豎放在滅菌桶內(nèi)，再將滅菌桶放回滅菌鍋。注意：滅菌桶內(nèi)的物品不能放得太擠，否則會影響滅菌效果。3加蓋，并將排氣軟管插入滅菌桶的排氣槽內(nèi)。以兩兩對稱的方式，同時旋緊相對的兩個緊固螺栓，以防漏氣。4.接通電源，進行加熱。排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排

9、氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到 0.5kg/cm2 時再打開排氣閥，待壓力回復(fù)到再關(guān)閉排氣閥。5.當壓力達 1.05kg/cm2 時，此時滅菌器內(nèi)的溫度為 1210C，維持 20min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應(yīng)適當降低壓力，延長時間。6.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。培養(yǎng)基配制放入殺菌鍋注意事項滅菌結(jié)束後，等壓力降回零時才可打開門進入殺菌釜 之物品，蓋子不可關(guān)太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套七、擱置斜面當培養(yǎng)基冷卻至 50左右時，將試管帶棉塞的一端擱在一根木棒上。擱置的長度要合適，

10、使培養(yǎng)基形成的斜面的長度不超過試管總長的 2/3。八、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試（）如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終 pH。（）將全部培養(yǎng)基放入 361C 恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。（）用有關(guān)的標準菌株接種 12 管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng) 2448 小時，如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。九、培養(yǎng)基的保存（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基不能超過兩周（2）生化試驗培養(yǎng)基不宜超過一周（3）選擇性或鑒別性培養(yǎng)最好當天使用（4）傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過 3天。實驗報告1.記錄你所配制的培養(yǎng)基的名稱、成分及稱取量。2

11、.記錄培養(yǎng)基的配制及分裝過程。培養(yǎng)基配制的實驗原理在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基 (Media)。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標準，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。據(jù)組成成分可分為 : 1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。2.半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為 ：1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)0.2 0.5%凝固劑而成的半

12、固體狀培養(yǎng)基。、化學(xué)滅菌（各種主要用于保持干燥的物料、器具1次，每次煮2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)0.2 0.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。、化學(xué)滅菌（各種主要用于保持干燥的物料、器具1次，每次煮沸 1h，連續(xù) 3d370C 恒溫條件下，一般可用細菌過濾器進行除2m 每次打開紫外線照射0.5h，就使室內(nèi)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入實驗原理 2：實驗室常用消毒滅菌方法滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）化學(xué)藥品）；1、干熱滅菌法灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱等實驗程序 15 （培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法）1.間歇滅菌法：待滅菌的物品放在滅

13、菌器或蒸籠里，每天蒸煮重復(fù)進行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。2.過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清）菌。（教師示范）3.紫外線滅菌法：一般 30W 燈管， 9m3空間，距地面空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學(xué)消毒劑，可增強滅菌效果。紫外線雖有較強的殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。4.化學(xué)藥劑消毒滅菌：微生物實驗室中常用的化學(xué)殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的

14、是殺菌劑，有的是抑菌劑。濾過除菌（ filter ）主要用于一些不耐熱的血清、毒素、抗生素、藥液以及空氣等除菌。不能除去病毒、支原體和型細菌常用的除菌濾器蔡氏（ Seitz）濾器玻璃濾器X 射線X 射線和 Y 射線思考題固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題？培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么？干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有何不同？如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？2、濕熱滅菌法借助蒸汽釋放的熱使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。優(yōu)點： 1）蒸汽來源容易，操作費用低廉，本身無毒2)蒸汽具有很強的穿透力，滅菌易于徹底3）蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后