總RNA的提取、定量與RT-PCR

1、總RNA的提取、定量與RT-PCR 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心1完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA 方面的研究工作如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。掌握從細(xì)胞中提取總RNA的方法熟悉紫外吸收法檢測(cè)RNA濃度與純度的原理及測(cè)定方法掌握RT-PCR基因擴(kuò)增的原理和過(guò)程目 的2實(shí) 驗(yàn) 流 程提取原理操作步驟逆轉(zhuǎn)錄原理操作步驟提 取總RNA定 量合成cDNA第一鏈原理體系引物選擇PCR電泳原理電泳步驟電 泳計(jì)算方法操作步驟3第一部分 細(xì)胞總RNA的提取及定量4原 理10-5mg RNA/細(xì)胞 mRNA 3端存在20-250個(gè)多聚腺苷酸

2、(polyA) 結(jié)構(gòu)，可用oligo(dT)親和層析柱分離mRNA。RNA分離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法，鹽酸胍-有機(jī)溶劑法，氯化鋰-尿素法，蛋白酶K-細(xì)胞質(zhì)RNA提取法等、異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。rRNA 80-85%：28S 18S 5StRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%5Trizol的主要成分Trizol 是一種新型總 RNA 抽提試劑主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白/核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RN

3、A酶活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase。6在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在上層水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。原 理7所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。 關(guān) 鍵 點(diǎn)8RNA酶污染來(lái)源RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操

4、作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染。 最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶：而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。9防止RNA酶污染的措施 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。 配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理

5、過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌。 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。 10加樣槍的使用11操作步驟 樣品處理提取組織RNA時(shí)，每50100mg組織用1ml Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解；懸浮細(xì)胞先離心沉淀，每5-10 106個(gè)細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。培養(yǎng)貼壁細(xì)胞不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。 (注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量RNA的前提；細(xì)胞數(shù)量與Trizol的比例，細(xì)胞的數(shù)量不能過(guò)多。)實(shí)驗(yàn)材料：HEK293人

6、胚腎細(xì)胞 12操作步驟細(xì)胞中加入1 ml Trizol（RNAisoPlus）用移液槍反復(fù)吹吸直無(wú)明顯沉淀后，室溫放置5min，使其充分裂解。 （注意：此時(shí)可放入-70長(zhǎng)期保持。 ）按200 ul 氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置2-3 min。 (注意：此步一定要振蕩混勻，使氯仿和Trizol不分層。)4 12,000g離心15min。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠）有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60。（此步開(kāi)始組長(zhǎng)負(fù)責(zé)組織各組同步進(jìn)行離心）吸取上層水相，至另一新的離心管中。一般400-450 ul 就足夠了，

7、千萬(wàn)不要貪多！ （注：千萬(wàn)不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4冰箱，若只提RNA，則棄下層酚相。） 13操作步驟加入等體積異丙醇后，上下顛倒混勻，4放置5 min。 4 12,000g離心10 min，棄上清，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。加入1 ml 75%乙醇，（切勿觸及沉淀?。睾驼袷庪x心管，懸浮沉淀。 4 12,000g離心5 min，盡量棄上清。 室溫晾干或真空干燥5 min。（注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。）加入10 ul無(wú)RNase的水，充分震蕩混勻。14原 理：物質(zhì)在光的照射下會(huì)產(chǎn)生對(duì)光的吸收效應(yīng) 而且物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的各種不

8、同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜 因此不同波長(zhǎng)的單色光通過(guò)溶液時(shí)其光的能量就會(huì)被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.紫外光吸收法15紫外吸收檢測(cè)RNA的濃度RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約 40g/ml 的單鏈RNA。用雙蒸水稀釋RNA樣品n倍并以雙蒸水為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260 值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度: RNA (mg/ml) = 40OD260 讀數(shù)稀釋倍數(shù)(n)/1000dsDNA(雙鏈DNA)1OD260 = 50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1OD260 = 33u

9、g/mlRNA1OD260 = 40ug/ml16RNA純品的OD260 /OD280 的比值為2.0，故根據(jù)OD260 /OD280 的比值可以估計(jì)RNA的純度。若OD260/OD280小于2，說(shuō)明可能有DNA片段污染，可以考慮用無(wú)RNase的DNase處理樣品，若小于1.8，說(shuō)明樣品中還可能含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化RNA。若比值太高（大于2.2），則提示RNA有降解。紫外吸收檢測(cè)RNA的純度1718RNA完整性檢測(cè)完整的RNA的甲醛電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，并且28S大約是18S的兩倍寬。若兩條帶不明顯, 則說(shuō)明RNA部分降解,可能的原因是污染了RN

10、ase。 19常見(jiàn)問(wèn)題分析RNA得率低： A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。 B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65 ： A.RNA應(yīng)使用TE Buffer稀釋后再進(jìn)行吸光度值的測(cè)定。 低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。 B.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。 C.勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘。 D.吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相。 E.RNA沉淀未完全溶解。20RNA降解 A.組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。 C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度。 D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。 E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5

11、 。DNA污染 A.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少 B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇，DMSO等)，強(qiáng)緩沖液或堿性溶液常見(jiàn)問(wèn)題分析21第二部分逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)22提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDN

12、A探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。原 理23鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37。在長(zhǎng)時(shí)間的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，不會(huì)造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長(zhǎng)的cDNA鏈的合成。 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42。Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScript。此種

13、酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。（一）反轉(zhuǎn)錄酶的選擇 24隨機(jī)六聚體引物：用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。特異性引物：是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷

14、酸作為引物，用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。 （二）引物的選擇 25 （三）內(nèi)參的設(shè)定為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對(duì)內(nèi)參照基因的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對(duì)照。常用的內(nèi)參有GAPDH （3-磷酸甘油醛脫氫酶）、-Actin（-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一、各孔間的溫度差等所造成的誤差。26儀器和主要試劑基因擴(kuò)增儀、微量加樣槍、滅菌超薄PCR反應(yīng)管總RNA第一鏈cDNA合成試劑盒 （含有逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液）dNTP mix：含dATP、dCTP、dGT

15、P、dTTP各2 mmol/L27操作步驟采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 合成cDNA第一鏈按下列組分配制RT反應(yīng)液5X PrimeScrip Buffer 2 mlPrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 mlOligo dT Primer (50mM) 0.5 mlRandom 6mers (100mM) 0.5 mlTotal RNA 6.5 ml反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下37 60min （反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85 5sec （反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）注：反轉(zhuǎn)錄步驟在PCR儀中進(jìn)行28第一鏈cDNA2lPerfectShot Taq(綠色) 10l上

16、游引物 (10M)1l下游引物 (10M)1lRNase free H2O 6l總體積20l取0.2 ml PCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入各試劑(注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭)： 如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCR反應(yīng)管置臺(tái)式離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液集中于管底，然后將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR儀)上 .PCR反應(yīng)體系29 94預(yù)變性5分鐘后開(kāi)始以下循環(huán) 94 30 秒 60 30 秒 30 循環(huán) 72 40 秒 72 5 分鐘 4 保溫實(shí)驗(yàn)過(guò)程約1小時(shí)30分鐘PCR參數(shù)設(shè)置30瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度D

17、NA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng).DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).瓊脂糖凝膠電泳原理31影響遷移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象 4、 電源電壓 5、 嵌入染料的存在 6、 離子強(qiáng)度影響 瓊脂糖凝膠電泳原理32實(shí)驗(yàn)材料電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 染料：Gelview、EB電泳緩沖液：TBE瓊脂糖DNA Marker 500033含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來(lái)檢測(cè)目的基因片段大小。應(yīng)選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的marker，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)較準(zhǔn)確。DNA Marker 實(shí)驗(yàn)材料34凝膠