基因工程03課件

1、第3章 分子克隆載體 Molecular Cloning Vector質(zhì)粒載體噬菌體載體 單鏈絲狀噬菌體載體 載體的定義和作用定義: 將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞(host cell)的工具.通過體外DNA重組方式，可以把基因與載體相連，轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，進(jìn)行無性繁殖，從而獲得大量的基因片段或相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。細(xì)菌的質(zhì)粒、酵母的質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA的衍生物等，經(jīng)過改造都可以成為載體。3.1 質(zhì)粒（Plasmid）載體3.1.1 質(zhì)粒的基本特性質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外，能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒DNA具有3種不同的構(gòu)型 1) 閉合環(huán)狀DNA, ccDNA, SC構(gòu)型 2)

2、開環(huán)DNA, ocDNA, OC構(gòu)型 3) 線形DNA, lDNA, L構(gòu)型圖 3-1 帶 pMB1（或 ColE1） 復(fù)制起點的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的方向及其粗略大小。ori-550RNaseH400 600RNAIRopRNA*質(zhì)粒pSC101等，靠近區(qū)域有repA基因，其產(chǎn)物為順式作用蛋白，對復(fù)制的起始具有正向作用，對自身基因的轉(zhuǎn)錄具有負(fù)調(diào)控作用。性質(zhì)二:質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒不同，在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)也不同，椐此，將質(zhì)粒分為兩類。嚴(yán)緊型質(zhì)粒：其復(fù)制受宿主染色體DNA復(fù)制的嚴(yán)格控制，每個細(xì)胞的拷貝數(shù)為幾個。 pSC101松弛型質(zhì)粒：其復(fù)制是在松弛控制下進(jìn)行的；每個細(xì)胞的拷貝數(shù)10-2

3、00個。 pMB1（或 ColE1） pUC 系列質(zhì)粒的復(fù)制單位來自質(zhì)粒 pMB1，但其拷貝數(shù)較高。 pMB1 質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA 聚合酶 ，DNA聚合酶），依賴于DNA的RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、dnaD 和 danZ 的產(chǎn)物。因此，存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有 pMB1（或 ColE1） 復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個細(xì)胞中可積聚 20003000個質(zhì)粒。 性質(zhì)三:質(zhì)粒的不相容性兩種不同質(zhì)粒不能共存于同一宿主細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。彼此不相容的

4、質(zhì)粒屬于同一個不親和群(incompatibility group),而彼此能夠共存的親和的質(zhì)粒屬于不同的不親和群.由pSC101, F和RP4質(zhì)粒屬于不同的不親和群,它們的衍生質(zhì)粒,彼此可以在同1個細(xì)胞中穩(wěn)定存在.不相容性，它是指在第二個質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及 DNA 限制系統(tǒng)時出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質(zhì)粒在同一個細(xì)胞中復(fù)制時，在分配到子細(xì)胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。性質(zhì)四:質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性在自然條件下,很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi).質(zhì)粒需要攜帶控制細(xì)菌配對

5、和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因.如移動基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因 tra ，順式因子 bom 及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移切口位點 nic。 基因工程中使用的是非接合型質(zhì)粒,因缺乏轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,不能發(fā)生自我遷移.細(xì)菌的接合作用（conjugation） 通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程。雄性E.coli有性纖毛(也稱之為傘毛)性纖毛可使其與雌性E.coli接合，質(zhì)?？赏ㄟ^纖毛從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。3.1.2 標(biāo)記基因分為選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記: 用于鑒別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來篩選標(biāo)記: 用于將特殊表型的重組子挑選出來 選擇標(biāo)記-轉(zhuǎn)

6、化載體的宿主的篩選抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標(biāo)記。1氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）Ampr氨芐青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成、抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進(jìn)入細(xì)菌的周質(zhì)區(qū)，催化-內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。補充-內(nèi)酰胺類（-lactam）：化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。包括：青霉素（penicillin）類、頭孢菌素（cephalosporin）類、頭霉素等。-內(nèi)酰胺抗生素可與細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding protein, PBP）共價結(jié)合。該蛋白

7、質(zhì)是青霉素作用的主要靶位，當(dāng)PBPs與青霉素結(jié)合后，導(dǎo)致了肽聚糖合成受阻?？梢砸种妻D(zhuǎn)肽酶活性，使細(xì)菌的細(xì)胞壁形成受阻。 penicillins 基本結(jié)構(gòu)均含有母核-6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid,6-APA） 四環(huán)素可與核糖體 30S 亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位。四環(huán)素抗性基因編碼一個由 399 個氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 pBR322 質(zhì)粒：有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性基因。 2四環(huán)素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）Tetr氯霉素與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。

8、目前使用的氯霉素抗性基因來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性 P1 噬菌體（也攜帶 Tn9）。cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）在基因的編碼區(qū)中，若某個密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)轸魇蛔儯ㄍ蛔優(yōu)?UAA），或琥珀突變（突變?yōu)?UAG），或乳白突變（突變?yōu)?UGA）。supF 基因編碼細(xì)菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密碼子上編譯酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tet

9、r 基因和 ampr 基因，只有當(dāng)宿主含有 supF 基因時才會對 Amp 和 Tet 具有抗性。supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰胺。5琥珀突變抑制基因 supF篩選標(biāo)記-重組質(zhì)粒的篩選篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒當(dāng)一個外源 DNA 片段插入到一個質(zhì)粒載體上時，可通過篩選標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即重組質(zhì)粒。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶。lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶中第 11-41 個氨基酸的 lacZ 基因，無酶學(xué)活性。只編碼 N-端 140 個氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ) ，其產(chǎn)物也沒有

10、酶學(xué)活性。這兩個無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時，可恢復(fù) -半乳糖苷酶的活性，實現(xiàn)基因內(nèi)互補。：deletion lacZM15 和lacZ 圖3-2 lacZ和lacZ多肽的結(jié)構(gòu)關(guān)系（左） 和通過-互補產(chǎn)生的菌落顏色變化（右）lacZlacZFlacZM15lacZlacZlacZM15140個氨基酸140個氨基酸MCSlacZ編碼缺失第11-41位氨基酸IPTGX-galIPTGX-gallacZM15lacZDNAlacZM15lacZ藍(lán)色白色在 lacZ 編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個堿基對的多克隆位點），不影響 -半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補。若在該 DNA 小片段中再插入一

11、個大片段，導(dǎo)致產(chǎn)生無-互補能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質(zhì)，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質(zhì)粒。在相應(yīng)的載體系統(tǒng)中，lacZM15 放在F 質(zhì)粒上, 隨宿主傳代； lacZ 放在載體上, 作為篩選標(biāo)記 。乳糖既是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物.5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。底物 X-gal 還可充作生色劑，被-半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。重組質(zhì)粒，因互補作用遭到

12、破壞，將顯示白色菌落。IPTG 和 X-gal的作用 藍(lán)白斑圖示請記?。菏裁词?互補作用？ IPTG？ X-gal？2插入失活通過插入失活進(jìn)行篩選的質(zhì)粒主要有 pBR322 ，該質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，導(dǎo)致 tetr 基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。3.1.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型載體的分類3類(2,3安排在后面講解)1. 以擴增或保存DNA片段為目的的載體，通常稱為克隆載體。2. 第二類載體為穿梭載體，既能在真核細(xì)胞中繁殖

13、，又能在原核細(xì)胞中繁殖。這類載體有真核細(xì)胞和原核細(xì)胞兩種復(fù)制點。3. 第三類載體為表達(dá)載體。進(jìn)行DNA重組的目的是要獲得表達(dá)產(chǎn)物。天然質(zhì)粒用作克隆載體的局限性 天然質(zhì)粒,一般是指那些沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。鑒于于然質(zhì)粒用作基因克隆載體存在著不同程度的局限性，科學(xué)工作者便在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了修飾改造，首先發(fā)展出了一批低分子量、高拷貝、多選擇記號的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體必須具備的基本條件現(xiàn)行通用的基因克隆載體，絕大多數(shù)就是以質(zhì)粒為基礎(chǔ)改建而成的。一般說來，一種理想的用作克隆載體的質(zhì)粒必須滿足如下幾個方面的條件：(1) 具有復(fù)制起點 (2) 具有抗菌素抗生基因 （3）具若干限制酶單一識

14、別位點 （4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 質(zhì)粒載體的選擇記號在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇記號，包括有新陳代謝特性、對大腸桿菌素E1的免疫性，以及抗菌素抗性等多種。但絕大多靈敏的質(zhì)粒載體都是使用抗菌素抗性記號。 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 1.pBR322質(zhì)粒載體 pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建縮小基因組的體積，移去一些對基因克隆載體無關(guān)緊要的DNA片段，限制酶識別位點設(shè)法使質(zhì)粒任何易位子失去功能。易位子的轉(zhuǎn)移（即易位）有可能導(dǎo)致選擇記號的喪失，甚至也有可能使克隆的DNA片段喪失或重排。通過體內(nèi)易位或體外重組加入可選擇的抗藥性記號。 pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點pBR322質(zhì)粒是由3個不同來源的部

15、分組成的：來源于pBR322質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）；來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點（ori）。pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點：具有較小的分子量。pBR322質(zhì)粒DNA為4363bp。具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。pBR322 DNA分子內(nèi)具有多個限制酶識別位點，外源DNA的插入某些位點會導(dǎo)致抗菌素抗性基因失活，利用質(zhì)粒DNA編碼的抗菌素抗性基因的插入失活效應(yīng)，可以有效的檢測重組體質(zhì)粒。具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細(xì)胞中可累積1000-3000個拷貝。為重組DNA的制備提供

16、了極大的方便。結(jié)構(gòu)來源oriAmprTetrpBR322圖圖3-3 pBR322質(zhì)粒圖譜插入失活2pUC18和pUC19 pUC載體是在pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5-端帶有一段多克隆位點的lacZ基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。多克隆位點：MCS pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下組成部分：（i）來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）（ii）氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識別位點（iii）大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此

17、結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因（iv）位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。 pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 如pUC8為2 750bP，pUC18為2686bP。 pUC8質(zhì)粒平均每個細(xì)胞即可達(dá)500-700個拷貝。適用于組織化學(xué)方法檢測重組體 pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的:lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用。因此，在應(yīng)用pUC8質(zhì)粒為載體的重組實驗中，可用Xgal顯色.具有多克隆位點MCS區(qū)段 pUC8質(zhì)粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點MCS區(qū)段，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿

18、梭”。因此，克隆在MCS當(dāng)中的外源DN片段，可以方便地從pUC8質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到M13mp8載體上，進(jìn)行克隆序列的核著酸測序工作。 具有MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端（如Eco RI和Bam HI）的外源DNA片段，克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。圖3-4 pUC18/19 質(zhì)粒圖譜 pUC18/19 質(zhì)粒MCS圖譜3pUC118和pUC119由pUC18/19增加了一些功能片段改造而來，大小為3162bp。相當(dāng)于在pUC18/19 中增加了帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列。噬菌粒 phagemidepUC118/119 質(zhì)粒圖譜4pGEM-3Z/4Z

19、pGEM-3Z/4Z由pUC18/19增加了一些功能片段改造而來，大小為2.74kb。與pUC18/19相比，在多克隆位點的兩端添加了噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動子，如Sp6和T7噬菌體的啟動子。pGEM-3Z和pGEM-4Z的差別在于二者互換了兩個啟動子的位置。注意：RNA聚合酶具有宿主特異性，識別特異的啟動子序列。內(nèi)酰胺酶5多功能質(zhì)粒載體典型的這類質(zhì)粒有pBluescriptKS（），這類質(zhì)粒一般由4個質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點方向相反（根據(jù)多克隆位點兩端Kpn和Sac的順序，用KS或SK表示），或單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制啟始方向相反（或者說，引導(dǎo)DNA雙鏈中不同鏈合成單鏈DNA，用+或-表示）。

20、pBluescriptKS（）的多克隆位點與pUC18/19的不同，且使用f1噬菌體的復(fù)制與包裝信號序列，質(zhì)粒圖譜如圖3-5。4個質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)：pBluescriptKS（+）、 pBluescriptSK（+）、 pBluescriptKS（-）、 pBluescriptSK（-）、圖3-5 pBluescriptKS（）系列質(zhì)粒圖譜 3.2 噬菌體載體噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文 Bacteriophage（簡稱 phage）。DNA分子: 復(fù)制起點和編碼外殼蛋白質(zhì)的基因。如同質(zhì)粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴增特定的DNA。3.2.1 噬菌體的分子生物學(xué) 噬菌體，一種大腸桿菌

21、雙鏈DNA噬菌體。噬菌體是感染大腸桿菌的溶原性噬菌體，在感染宿主后可進(jìn)入溶原狀態(tài)，也可進(jìn)入裂解循環(huán)。噬菌體基因組為長度約為50kb的雙鏈DNA分子，實際大小為48 502bp。 噬菌體的結(jié)構(gòu)在噬菌體顆粒內(nèi)，基因組DNA呈線性，其兩端的5末端各帶有12個堿基的互補單鏈（粘性末端），12個堿基的序列為5GGGCGGCGACCT3。圖3-6 噬菌體的結(jié)構(gòu)示意圖噬菌體生活史當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其兩端互補單鏈通過堿基配對形成環(huán)狀DNA分子，而后在宿主細(xì)胞的DNA連接酶和旋促酶作用下，形成封閉的環(huán)狀DNA分子，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的模板。噬菌體可選擇進(jìn)入裂解生長狀態(tài)（lytic growth），大量復(fù)制并組

22、裝成子代噬菌體顆粒，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。經(jīng)過40-45min的生長循環(huán)，釋放出約100個感染性噬菌體顆粒（每個細(xì)胞）；或者進(jìn)入溶原狀態(tài)（lysogenic state），將噬菌體基因組DNA通過位點專一性重組整合到宿主的染色體DNA中，并隨宿主的繁殖傳給子代細(xì)胞（圖3-7）。圖3-7 噬菌體生活史簡圖看教材p47噬菌體基因組噬菌體基因組至少可編碼30個基因，它們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系（圖3-8，圖3-9）。根據(jù)執(zhí)行功能的不同可將基因組分為三個區(qū)。左邊區(qū)域:Nu1 到J，其產(chǎn)物用于噬菌體DNA的包裝和噬菌體顆粒的形成。中間區(qū)域:J 右邊至gam, 編碼基因調(diào)節(jié)、溶原狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳

23、重組所需要的基因。其中許多基因?qū)α呀馍L是非必須的，在構(gòu)建載體時可以去掉，用外源DNA片段替代。右邊區(qū)域: gam 右邊至Rz, 包含噬菌體復(fù)制和裂解宿主菌所必須的基因。 圖3-8 噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)示意圖Cro:control of repressor and other thing,抑制子和其他基因的控制c:抑制子基因c：轉(zhuǎn)錄激活子xis:切除酶int:整合酶N,Q:抗終止子c:抑制子基因。c蛋白（阻遏物）可阻止裂解生長必需基因的表達(dá)。維持溶原狀態(tài)。c： c蛋白是噬菌體基因轉(zhuǎn)錄的激活子。抑制裂解功能基因的表達(dá)，催化噬菌體DNA整合到宿主染色體上。激活c表達(dá)。1.噬菌體發(fā)育調(diào)節(jié)（1）吸附（a

24、dsorption）噬菌體對宿主的侵染是從吸附開始的。噬菌可吸附在大腸桿菌的外膜受體蛋白上，該蛋白由lam B基因編碼，受麥芽糖誘導(dǎo)。（2）立即早期轉(zhuǎn)錄（immediate early transcription）當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，線狀DNA轉(zhuǎn)變?yōu)槌菪Y(jié)構(gòu)的cccDNA。然后利用位于c基因兩側(cè)的PL和PR啟動子啟動立即早期轉(zhuǎn)錄，并終止于N 基因和cro 基因末端的終止子tL和tR1，其中向右側(cè)的轉(zhuǎn)錄有40%可終止于tR2，轉(zhuǎn)錄出涉及DNA復(fù)制的O 基因和P 基因?；騈 的產(chǎn)物具有抗轉(zhuǎn)錄終止的作用，且對裂解生長是必需的。cccDNA :covalently closed circ

25、ular DNA （3）延遲早期轉(zhuǎn)錄（delayed early transcription）在N蛋白的作用下，轉(zhuǎn)錄作用可穿越早期轉(zhuǎn)錄終止子tL和tR1，進(jìn)入延遲早期轉(zhuǎn)錄階段，轉(zhuǎn)錄出延遲早期基因c，以及基因c、DNA復(fù)制基因O 和P、晚期轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)基因Q 。基因N 的表達(dá)受抑制蛋白C和Cro負(fù)控制，同時也受自身翻譯負(fù)調(diào)節(jié)。如果tR2發(fā)生缺失突變，則容易進(jìn)入裂解循環(huán)，這樣的缺失稱為nin突變（nin指不依賴于N 基因）。在許多噬菌載體中帶有一個nin5突變，該突變?nèi)笔Я嘶騊 和Q 之間的tR2和一些與重組有關(guān)基因的2 800bp片段。在延遲早期轉(zhuǎn)錄期間，感染細(xì)胞朝著溶原化或裂解生長的傾向還

26、不能展現(xiàn)出來。（4）溶原和裂解的感染分化在延遲早期結(jié)束時，對于進(jìn)入下一步生長所需的蛋白才會表達(dá)出來，從而導(dǎo)致生長方式不可逆地朝著裂解循環(huán)或溶原循環(huán)方向發(fā)展。對野生型大腸桿菌來說，向溶原和裂解方向的轉(zhuǎn)變是由感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection）和細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)決定的。感染復(fù)數(shù)越高，營養(yǎng)狀態(tài)越差，溶原化（lysogenization）的頻率就越高。溶原現(xiàn)象的生化媒介可能是3,5-cAMP，它在細(xì)胞內(nèi)的濃度會隨營養(yǎng)條件的變化而改變。C:抑制裂解基因表達(dá)，催化噬菌體DNA整合到宿主染色體上。（5）進(jìn)入裂解生長基因O 和P 在立即早期轉(zhuǎn)錄過程中的轉(zhuǎn)錄是微弱的，但在蛋白N介導(dǎo)的抗終

27、止作用下轉(zhuǎn)錄活性變的更強。在感染早期，利用蛋白O和P激活的單一復(fù)制起點，在宿主的復(fù)制蛋白和應(yīng)激蛋白（stress proteins）的作用下，噬菌體DNA通過方式進(jìn)行復(fù)制。在野生型噬菌體感染的野生型大腸桿菌中，大約合成50個噬菌體基因組單體后進(jìn)入滾環(huán)復(fù)制。通過復(fù)制產(chǎn)生基因組DNA的多聯(lián)體（concatemer），最后被切割并被包裝到噬菌體顆粒中。圖3-10是包裝噬菌體的過程。（6）溶原化噬菌體感染野生型大腸桿菌后，只有一部分細(xì)胞進(jìn)入裂解循環(huán)。相反，在大多數(shù)感染的細(xì)胞群體中，裂解循環(huán)是受挫的，存活的細(xì)胞進(jìn)入溶原狀態(tài)。在噬菌體的整合酶Int（integrase）和宿主的整合宿主因子IHF作用下，噬

28、菌體DNA通過其上唯一整合位點attP與宿主染色體DNA上的唯一整合位點att B 發(fā)生重組，從而整合到染色體中。整合酶Int是型拓?fù)洚悩?gòu)酶，可同時切割和連接DNA，對含負(fù)超螺旋的閉合環(huán)狀DNA的作用效果更好。att P 位點是噬菌體DNA上一個約240bp的序列，其中含有一個與宿主染色體完全相同的15bp核心區(qū)。2.噬菌體的可取代區(qū)通過分析大量缺陷型噬菌體的DNA，發(fā)現(xiàn)J 基因與cro基因之間的DNA被ga1基因或bio基因替換后，不影響噬菌體裂解生長。這個區(qū)段約占噬菌體DNA的1/3，主要包含控制噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)的調(diào)節(jié)基因和功能基因。60%區(qū)域為裂解生長所必須的，其中在左臂約20 kb，

29、含有編碼噬菌體頭部和尾部蛋白的基因，即從基因A至基因J的區(qū)域；右臂約為8-10 kb，從PR啟動子到右側(cè)cos位點。 3.2.2 噬菌體的選擇標(biāo)記1基因組大小重組噬菌體的基因組DNA太大或太小會影響其存活能力。當(dāng)基因組DNA長度為野生型噬菌體基因組DNA的78%-105%時，不會明顯影響存活能力。野生型噬菌體基因組DNA為48 kb，若用外源DNA片段完全替換可取代區(qū)，外源DNA片段的大小將在9-23kb范圍內(nèi)。2.lacZ 基因lacZ 基因可用于噬菌體載體，通過插入或替換載體中的-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal平板上可通過噬菌斑的顏色，篩選重組噬菌體。3基因c失活基因c是噬菌體

30、的抑制基因，全面抑制并阻斷基因的表達(dá)，與操縱區(qū)oR和oL結(jié)合。c基因的表達(dá)促進(jìn)噬菌體進(jìn)入溶原狀態(tài)，基因c產(chǎn)物活性受到影響會促進(jìn)噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。在帶有hfl（高頻溶原化，high frequency of lysogenization）的E.coli中，噬菌體可高效率地進(jìn)入溶原狀態(tài)。在hfl突變E.coli中，基因c產(chǎn)物可以累積到較高水平?；騝產(chǎn)物為基因c的正調(diào)節(jié)物，hfl突變可增加基因c的產(chǎn)物，從而使裂解生長受到抑制，高效地進(jìn)入溶原狀態(tài)。如果外源DNA片段插入基因c中，將高頻率地使hfl突變E.coli進(jìn)入裂解生長狀態(tài)。4Spi篩選野生型噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶原性E.coli中的生

31、長會受到限制的表型，稱作Spi+，即對P2噬菌體的干擾敏感（sensitive to P2 interference）。如果噬菌體缺少兩個參與重組的基因red 和gam，同時帶有chi位點，并且宿主菌為rec+，則可以在P2溶原性E.coli中生長良好，噬菌體的這種表型稱作Spi-。因此，通過噬菌體載體DNA上的red 和（或）gam 基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶原性細(xì)菌中鑒別重組和非重組噬菌體。chi位點:交換熱點激活區(qū),crossover hot-spot instigator 2.2.3 代表性噬菌體載體通過特定的酶切位點允許外源DNA片段插入的載體稱為插入型載體（insertio

32、n vectors），允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體，稱為置換型載體（replacement vectors）。2.2.3.1 插入型載體通過特定的酶切位點允許外源DNA片段插入的載體稱為插入型載體（insertion vectors）。由于噬菌體對所包裝的DNA有大小的限制，因此一般插入型載體設(shè)計為可插入6 kb外源DNA片段，最大11 kb。1gt10載體（cI基因的插入失活）gt10載體（GenBank U02447）大小為43340 bp，是經(jīng)典的噬菌體載體，主要用作cDNA克?。▓D3-11），允許的插入片段大小為0-6kb。外源DNA量有限時較好，克隆效率高。在cI基因

33、中的EcoR I位點插入外源基因。（清晰菌落斑? Why?）根據(jù)菌落斑的混濁與明亮度判斷重組體。圖3-11 gt10載體的結(jié)構(gòu)示意圖2gt11（ lac5 基因,藍(lán)色噬菌斑)gt11載體大小為43.7 kb，是一個常用的載體。gt11載體允許插入的DNA片段大小為0-7.2 kb。它用于構(gòu)建cDNA文庫、基因組文庫和表達(dá)融合蛋白。特點:在最左側(cè)可替代區(qū)置換了一段lac5基因，可編碼-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上形成藍(lán)色噬菌斑。lac5基因編碼區(qū)終止密碼子之前有一個EcoR位點（53 bp上游），可用于外源DNA片段的插入。當(dāng)外源DNA片段與lacZ 的閱讀框相吻合時，可表達(dá)出融合蛋

34、白，可用免疫學(xué)方法篩選陽性重組子。 3GEM-2/4 （cI基因的插入失活,MCS）GEM-2和GEM-4: 由gt10改造，是cDNA克隆載體。GEM-2和GEM-4大小分別為43.8 kb和46.2 kb，可分別裝載0-7.1 kb和0-4.7 kb外源片段。GEM-2與gt10相比，在c基因內(nèi)的EcoR位點被來自pGEM-1質(zhì)粒的一小部分片段取代。該小片段含有多克隆位點，在其兩端分別有一個SP6和T7噬菌體的啟動子，啟動子之外各有一個Spe位點。在GEM-4中，則是將完整pGEM-1 質(zhì)粒替換EcoR位點。4ZAP (pBluescript SK質(zhì)粒片段)ZAP整體上與gt11相似，不同

35、的是在基因J和att位點之間用pBluescript SK質(zhì)粒片段取代了相應(yīng)的噬菌體片段，大小為41 kb，允許插入0-10 kb的外源片段。具備了pBluescript SK質(zhì)粒的一些特性，如-互補以及可通過啟動子合成RNA探針。pBluescript SK質(zhì)粒是在其f1噬菌體IG序列的起始信號(I)和終止信號(T)之間切割成線狀DNA后，裝載到噬菌體DNA中的（圖3-12）.圖3-12 ZAP載體釋放出質(zhì)粒的原理圖3.2.3.2 置換型載體組成示意圖見圖3-14。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是9-23 kb，主要用來構(gòu)建基因組文庫。保留了包裝蛋白（左臂）和裂解（右臂）有關(guān)的

36、基因。圖3-14 置換型載體的組成示意圖cos位點 左臂 填充片段 右臂 cos位點1EMBL3和EMBL4 (Spi篩選)這兩個載體大小為43 kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分別為20 kb、9 kb和14 kb?？寺NA片段的大小為9-23 kb。在填充片段中帶有red 和gam 基因，當(dāng)外源片段替換填充片段后，重組體將變成red-gam-，同時載體上含有chiC位點，因此可用P2噬菌體的溶原性大腸桿菌進(jìn)行Spi篩選重組體。在填充片段兩端帶有對稱的多克隆位點，這兩個載體的差別是多克隆位點的排列位置相反。22001、DASH和FIX載體結(jié)構(gòu)和大小與EMBL3載體相似，主要不同在于多克隆

37、位點的酶切位點數(shù)量、排列和種類不同。DASH和FIX載體的特點:多克隆位點中含有T7啟動子和T3啟動子。這些噬菌體的啟動子可在體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，用作染色體步查（chromosome walking）的探針。染色體步查：chromosome walking采用一段分離自某一重組體一端的非重復(fù)DNA片段作為探針，鑒定含有相鄰序列的重組克隆。 3GEM-11載體左右臂來自EMBL3載體，填充片段來自2001，是一個多功能置換載體（圖3-15）。其多克隆位點與上述置換載體稍有不同，但保留Xho位點，同時在填充片段的最末端各有一個識別8個核苷酸序列的稀有酶切位點Sfi。在獲得陽性克隆后，通過Sfi酶切

38、位點可將外源片段從載體中切割下來進(jìn)行亞克隆，而在相當(dāng)大程度上不會切割外源片段。在右邊的多克隆位點中有SP6啟動子，而不是T3啟動子。 圖3-15 GEM-11載體的結(jié)構(gòu)示意圖利用多克隆位點上的Xho，去除填充片段，提高載體與外源片段的連接效率,圖3-16 。上述處理后的載體左右臂和外源片段可進(jìn)行黏端連接。3.2.4 噬菌體載體的克隆原理及步驟噬菌體載體的克隆步驟包括：通過裂解過程增殖載體；載體與外源DNA的酶切；外源DNA 與載體的連接；重組噬菌體的體外包裝噬菌體顆粒的感染；篩選。 3.3 單鏈絲狀噬菌體載體3.3.1 M13噬菌體的生物學(xué)1M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)M13噬菌體顆粒是絲狀的，只

39、感染雄性大腸桿菌。基因組為單鏈DNA，由6 407的堿基組成?；蚪M共有11個編碼基因。較大的間隔位于基因和基因以及基因和基因之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和DNA合成的元件。M13噬菌體基因組可編碼3類蛋白質(zhì)，包括復(fù)制蛋白（基因，和），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因，和），結(jié)構(gòu)蛋白（基因、和）?；蚪MDNA為正鏈，按基因至基因方向合成。圖3-17 M13噬菌體的遺傳圖譜 圖3-18 M13噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)模型M13噬菌體顆粒為絲狀長管狀結(jié)構(gòu)，長880nm，直徑6-7nm。噬菌體顆粒的核心由2 700個基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成（圖3-18），成熟的基因的產(chǎn)物為由50個氨基酸殘基組成的螺旋蛋白。頂端由5個基

40、因和5個基因產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號。5個基因蛋白和5個基因蛋白位于絲桿的末端，參與對性纖毛的吸咐。2M13噬菌體的增殖（1） 吸附。M13噬菌體只感染具有性纖毛的菌株，攜帶F質(zhì)粒的菌株可產(chǎn)生性纖毛。（2）在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删wDNA（正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈復(fù)制型DNA（replicative form DNA），即RF DNA。（3）經(jīng)過數(shù)輪型復(fù)制。（4）RF DNA 的負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄成病毒mRNA。 （5）病毒基因II產(chǎn)物在RF DNA 的正鏈特殊部位產(chǎn)生切口（6）通過復(fù)制叉繞著負(fù)鏈模板的移動，不斷合成正鏈子代（滾環(huán)復(fù)制）。（7）完整的子代正鏈在病毒基因II產(chǎn)物

41、的作用下從滾環(huán)結(jié)構(gòu)切下，子代正鏈環(huán)化。（8）子代正鏈繼續(xù)合成。圖3-19 M13噬菌體在感染細(xì)胞中的復(fù)制 3.3.2 M13噬菌體載體單鏈DNA的酶切和連接是比較困難的，因此M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RF DNA。RF DNA很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。1載體的插入位點在M13噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源DNA（基因/和基因/之間）?；蚝突蛑g的508bp間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點。在基因和基因之間的小間隔區(qū)也可用來插入外源片段?；蛞部捎脕砜寺⊥庠雌?。intergenic reg

42、ion(IG region) 2M13噬菌體載體組成現(xiàn)在所使用的M13噬菌體載體：mp系列載體，以基因和基因之間的區(qū)域作為外源DNA插入?yún)^(qū). mp載體系列：從同一個重組M13噬菌體（M13mpl）改造。在M13mpl載體中，間隔區(qū)內(nèi)的Hae位點插入了一小段大腸桿菌DNA，引入互補篩選。 圖3-20 M13部分噬菌體載體和噬菌粒的多克隆位點3M13mpl8和M13mpl9M13mpl8和M13mpl9這兩個載體含有13個不同的酶切位點，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的DNA片段（圖3-21）。在lacZ 區(qū)內(nèi)不對稱的多克隆區(qū)的方向不同。 圖3-21 M13mpl8/l9載體的遺傳圖譜看教

43、材p65 3.3.3 M13噬菌體載體的宿主菌雄性細(xì)菌便于M13載體進(jìn)行基因操作的多種大腸桿菌菌株，最重要的遺傳標(biāo)志：（1）lacZMl5 lacZ基因缺失突變體。（2）(lac-proAB) 缺失突變體,不能利用乳糖，需要Pro。（3）lacIq lacI基因的突變體,合成10倍的阻遏蛋白。（4）proAB 細(xì)菌染色體上脯氨酸生物合成酶類的編碼區(qū)域。（5）traD36 抑制F因子接合轉(zhuǎn)移的突變。（6）hsdR l7與hsdR 4 大腸桿菌K株類限制-修飾系統(tǒng)失去 限制活性但仍保留修飾功能的突變體。（7）recA 1 大腸桿菌重組酶基因。（8）supE 琥珀突變抑制基因。在M13噬菌體載體中進(jìn)

44、行克隆時常用的宿主菌株JM101 supE （lac-proAB） FtraD36 proAB+lacIqlacZM15JM105 JM101/hsdR4JM107 JM101/hsdR17JM109 JM101/hsdR17 recA1TG1 JM101/hsd5（不修飾不限制）XL1-Blue supElac- hsdR17recA1 F proAB+lacIqlacZM15Tn10（tetr） 3.3.5 噬菌粒噬菌粒（phagemid）：帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一身的載體，具有ColE1復(fù)制起點及抗生素抗性選擇標(biāo)記的質(zhì)粒，以及絲狀體噬菌體的間隔區(qū)。間隔區(qū)含噬菌體DNA合成的起始與終止及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用序列。含噬菌粒的細(xì)菌被噬菌體感染后，基因蛋白可作用于噬菌粒的間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生ssDNA并進(jìn)行包裝。2種復(fù)制方式克隆于這些載體內(nèi)的外源DNA區(qū)段可以象質(zhì)粒一樣用常規(guī)方法進(jìn)行增殖。帶有這種質(zhì)粒的細(xì)菌被M13（或f1）絲狀噬菌體感染后，在病毒的基因蛋白影響下，質(zhì)粒的復(fù)制方式發(fā)生改變。基因產(chǎn)物與質(zhì)粒所攜帶的基因間隔區(qū)相互作用，啟動滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生質(zhì)粒DNA一條鏈的拷貝，最終包裝在子代噬菌體顆粒