真菌及真菌毒素檢驗技術基礎

1、真菌及真菌毒素檢驗技術基礎 一、真菌的生物學特征真菌的基本特性真菌(fungus)是一類細胞結構完整，具有細胞壁，具有典型的細胞核和完整細胞器，不含葉綠素，無根、莖、葉分化的真核細胞型微生物；大多數(shù)為多細胞，由絲狀體和孢子組成，少數(shù)為單細胞。組成： 完整的細胞核(核膜和核仁) 完整的細胞器(胞漿)： 多細胞（多數(shù)） or單細胞（少數(shù)）生存方式：腐生 or 寄生 繁殖方式：有性 or 無性 生長速度：緩慢種類繁多、數(shù)量大、分布廣泛 多數(shù)有益：如釀酒、發(fā)酵、生產(chǎn)抗生素等少數(shù)有害：人類及動、植物疾病。醫(yī)學（病原）真菌300多種常見的有50-100種。 真菌癥明顯上升趨勢： 1.濫用抗生素引起菌群失調(diào)

2、 2.用激素、免疫抑制劑、抗癌藥物 和HIV感染引起的免疫功能下降 等原因 對人類致病的真菌分為：淺部真菌：侵犯皮膚、毛發(fā)、指甲，為慢性，對治療有頑固性，但影響身體較??； 深部真菌：可侵犯全身內(nèi)臟，嚴重的可引起死亡。此外有些真菌寄生于糧食、飼料、食品中，能產(chǎn)生毒素引起中毒性真菌病。1、 單細胞真菌：又稱酵母菌（yeast），圓形或卵圓形,外形與細菌相似但較大，出芽方式繁殖。2、多細胞真菌：又稱絲狀菌（filamentous fungus）、霉菌（mold），該菌能長出菌絲，菌絲延長分支，有的菌絲上長出孢子，孢子再出芽形成菌絲。部分真菌在不同的環(huán)境條件下（營養(yǎng)、溫度等）可發(fā)生單細胞真菌與多細胞真

3、菌兩種形態(tài)的可逆轉換，稱為真菌的雙相性或二相性(dimorphic)。與某些真菌的感染性與致病性有關環(huán)境條件（營養(yǎng)、溫度等）普通培養(yǎng)基， 25 營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基， 37組織胞漿菌和球孢子菌真核細胞的基本結構：細胞膜細胞質(zhì)細胞核 特殊結構：由特殊成分和結構組成的細胞壁 特殊的隔膜細胞壁外的成分：莢膜部分酵母菌細胞壁外的一層低密度粘液，如新生隱球菌化學組成：甘露糖、木糖及尿苷酸 與真菌的毒力和致病性密切相關真菌培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基：沙保培養(yǎng)基（Sabourauds glucose agar）4% malt extract agar溫度：多數(shù)都在22 28oC，但深部感染真菌最適溫度為37oC，pH4

4、.0 6.0病原真菌通常生長緩慢，14周培養(yǎng)：沙保培養(yǎng)基沙保培養(yǎng)基（Sabouraud medium）營養(yǎng)不高（主要含葡萄糖、蛋白胨和瓊脂）鑒定真菌以沙保培養(yǎng)基形成的菌落形態(tài)為準最適酸堿度為 pH 46 最適的溫度為 2228 但深部感染真菌在37下生長良好 需較高的濕度和氧氣大多數(shù)致病性真菌在沙保培養(yǎng)基上生長較慢，需14周，但腐生性真菌生長快。 為防止污染，需加入放線菌酮抑制污染真菌的生長及加入氯霉素抑制細菌的生長。沙保培養(yǎng)基成分： 葡萄糖 20g 蛋白胨 5g 瓊脂 10g 蒸餾水 500ml滅菌前沙保培養(yǎng)基的pH要調(diào)到5.6，從而抑制細菌的生長。真菌菌落：酵母型菌落（yeast colo

5、ny）為單細胞真菌的菌落，形態(tài)與一般細菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如新型隱球菌。 類酵母型菌落（yeast-like colony）外觀似酵母菌落，但可見伸入培養(yǎng)基中的假菌絲，它是由伸長的芽生孢子形成，如白色念珠菌。絲狀型菌落（filamentous colony）為多細胞真菌的菌落，由許多菌絲體組成。絲狀菌落呈棉絮狀、絨球狀、粉末狀或石膏粉樣，在下面和背面可顯示不同顏色，這些以及菌絲、孢子的形狀都是真菌的鑒別依據(jù)。真菌菌落類型類型定義特征顏色舉例酵母型菌落為單細胞真菌的菌落，形態(tài)與一般細菌菌落相似，以出芽形式繁殖光滑、濕潤一般為乳白色新型隱珠菌類酵母型菌落外觀似酵母菌落，但可見伸入培養(yǎng)基中的

6、假菌絲，由伸長的芽生孢子形成光滑、濕潤一般為乳白色白色念珠菌絲狀菌落為多細胞真菌的菌落，由許多管狀、分枝菌絲體組成絨毛狀、絮狀、粉末狀、顆粒狀、石膏狀 可產(chǎn)生各種色素。毛癬菌變異性易變異：經(jīng)多次傳代或培養(yǎng)時間過久，其形態(tài)、菌落性狀、色素及毒力等都可以發(fā)生改變。用不同的培養(yǎng)基和不同溫度培養(yǎng)，其性狀也可不同。抵抗力對干燥、陽光、紫外線及常用消毒劑有強抵抗力。不耐熱，菌絲與孢子60 1小時均可殺死。2石炭酸、10%甲醛、0.1%升汞、2.5%碘酊敏感?？拐婢幬?：灰黃霉素、制霉菌素B、二性霉素B、氟康唑和酮康唑?qū)股夭幻舾卸?、霉菌的分離與鑒定方法霉菌的分離在于選用合適的培養(yǎng)基,篩選出純菌種,并培

7、養(yǎng)成熟。霉菌的鑒定在于確定一種菌的分類地位和種屬名稱,鑒定是通過霉菌的形態(tài)觀察和生理實驗實現(xiàn)的。霉菌通常以形態(tài)鑒定為主。（一）霉菌形態(tài)特征的鑒定1、培養(yǎng)特征在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征包括菌落生長速度、大小、形態(tài)構造、顏色、質(zhì)地、表面特征、背面特征、邊緣特征以及培養(yǎng)基的顏色變化等。固體培養(yǎng)基在做霉菌培養(yǎng)特性鑒定時,常選用固定培養(yǎng)基進行培養(yǎng)觀察。如：曲霉、青霉等選用察氏培養(yǎng)基;根霉、毛霉和半知菌類可采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。有些霉菌要求特殊培養(yǎng)時,也可采用特殊的選擇性培養(yǎng)基。2、顯微特征顯微觀察個體形態(tài)特征：霉菌顯微特征因種類不同而各異。霉菌的形體較大,營養(yǎng)體和繁殖體的特征比較明顯,?？勺鳛槊咕b

8、定的主要依據(jù)。(1) 營養(yǎng)體類型：菌絲體有、無橫隔的菌絲組織構成等。顏色：呈現(xiàn)何種顏色(有黃色、黃褐色、綠色、藍綠色、白色等)。分化：有無菌絲分化成的假根或足細胞等。(2)無性或有性繁殖體子實體類型：形狀、大小、構造(如分枝、囊軸、頂囊等),表面特征(如光滑、粗糙)、顏色、著生狀態(tài)(單生、集生、囊生、叢生)。孢子類型：形態(tài)、大小、構造(單細胞、多細胞)、表面特征、顏色、著生狀態(tài)(單生、鏈生、簇生等)。（二）霉菌的鑒定步驟1、分離、純化菌種： 應用分離培養(yǎng)基和純種移植法,在相應的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出單純菌株。2、培養(yǎng)特性的觀察：按照培養(yǎng)時間、生長速度、菌落質(zhì)地、顏色、形態(tài)、氣味、培養(yǎng)基表面變化、孢子及

9、菌絲的顏色、結構、大小進行觀察并記錄。3、顯微特征的觀察 (1)制片鏡檢:在潔凈的載玻片上加一滴乳酸-苯酚液,用經(jīng)過火焰滅菌的接種鉤從菌落的邊緣挑取少許幼嫩的菌體,置于乳酸-苯酚溶液中,然后加蓋玻片,注意不要產(chǎn)生氣泡,此為臨時性的載片標本;若需保存較長時間,可在蓋玻片周圍用加拿大樹膠封牢,貼上標簽,做成半永久性標本。(2)活體觀察活體觀察有小培養(yǎng)、大培養(yǎng)和霉變糧粒的顯微觀察3種方法。小培養(yǎng)(載玻片培養(yǎng))：在無菌條件下,滴一滴無菌的培養(yǎng)基于干凈的載玻片上,接種后蓋上蓋玻片,放人已滅菌的培養(yǎng)皿中,用滅菌的濕棉球或紗布保持濕度,蓋好皿蓋置培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),可以隨時用顯微鏡觀察其生長和發(fā)育情況。大培養(yǎng)

10、(培養(yǎng)皿培養(yǎng))：即將培養(yǎng)有霉菌菌落的培養(yǎng)皿除去皿蓋置于顯微鏡的載物臺上,用低倍鏡觀察霉菌的生長情況,可以看到其營養(yǎng)菌絲、子實體及孢子等。觀察時必須注意:勿讓鏡頭接觸霉菌而污染;觀察人員不能面對標本,防止孢子飛散吸人體內(nèi),影響健康;觀察完畢立即加蓋,防止污染標本。霉變糧粒觀察：取發(fā)霉的糧食顆粒,放在載玻片上,然后用低倍鏡觀察發(fā)霉糧粒上的霉菌生長狀態(tài)和個體形態(tài)。進行活體觀察時,如果倒置顯微鏡就更方便、更便于觀察;如果遇到比較好的菌種標準或視野,也可以用照相機拍下來,苡便長期保存。4、查對資料、鑒定菌種：根據(jù)培養(yǎng)特征、顯微特征觀察和記錄的結果,查對菌屬檢索表和有關的技術資料,依據(jù)菌種的培養(yǎng)性狀和個體

11、形態(tài),即可鑒定出霉菌的屬、群、系或種。三、毒素及其測定方法毒素的檢驗方法(一) 化學檢驗法主要檢驗黃曲霉毒素6大檢驗步驟：采樣和樣品制備提取脫脂和凈化分離鑒定定量1. 采樣和樣品制備應選霉變部分。如無可見霉變,樣品少時,可混合采樣;樣品多時、多點采樣后混合。采樣量一般為20100g,以50g為宜。樣品采回后應盡量磨細,以利提取。2. 提取根據(jù)水溶劑能滲透到親水性植物組織的原理,提取黃曲霉毒素,可用甲醇-水、丙酮-水或氯仿-水。氯仿-水、二氯甲烷-水等可用于其他真菌毒素的提取。3. 脫脂和凈化除去脂類的方法取決于提取溶劑的親脂性。最常用的一種方法是采用兩相系統(tǒng)。例如,為除去提取黃曲霉毒素時氯仿所

12、溶解的脂類,可用甲醇-水/己烷兩相系統(tǒng)。一種常用的方法是采用硅膠柱選擇性洗滌法,用石油醚或己烷可除掉氯仿所溶解的脂類。酸性氧化鋁具有高度的凈化作用,目前使用者較多。4. 分離技術根據(jù)毒素的溶解力、不同相間的分配力、吸附性能、解離性、分子大小、蒸汽壓等加以考慮。目前最常用的分離真菌毒素的技術有薄層層析(TLC)、柱層層析、離心薄層和制備型液相色譜等。5. 鑒定和定量(二) 免疫學檢驗法1. 放射免疫分析法RIA，簡稱放免法：此法可直接測定牛奶中550ng水平的黃曲霉毒素M1,若提取后,其敏感度可達0.5ng/mL。此法也可用于樣品中玉米赤霉烯酮、T-2毒素的測定。由于此法需要放射性同位素,一般地

13、區(qū)不易推廣。2. 酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA，簡稱酶標法：是應用酶標記的抗體(或抗原)在固相支持物表面檢測未知抗原(或抗體)的方法。ELISA方法的基本原理：是酶分子與抗體或抗原共價結合,此種結合不會改變抗體的免疫學特性以及酶的生物學活性,酶與抗體(或抗原)交聯(lián)后,形成酶標記抗體-抗原復合物,加入酶底物和顯色劑,在酶催化底物液體后呈現(xiàn)顯色反應,液體顯色的強弱和酶標記抗體-抗原復合物的量成正比,進而得知待檢測的抗原或抗體量。(三) 生物學檢驗法主要是利用各種生物來測定毒素的毒性和 “三致” (致癌、致畸、致突變)性。1. 動物毒性試驗動物毒性試驗包括急性毒性試驗、亞急性毒佳試驗、慢性毒性試驗以及

14、致癌、致畸、致突變試驗等。由于動物對霉菌毒素的反應存在較大的種間差異,所以,進行動物試驗時,最好選用多種動物,以便發(fā)現(xiàn)最敏感的測毒動物,全面的評價該毒素的毒性。攻毒的途徑主要是消化道?？刹捎米杂蓴z食,比如把被檢物拌于飼料之中飼喂。也可采用人工灌胃的方法2. 雞胚試驗黃曲霉毒素的生物鑒定方法常用雞胚進行試驗。優(yōu)點：敏感性高,操作簡便,不需要特殊儀器,而且重復性強。缺點：特異性較差,雞胚沒有特異性病變。操作步驟:受精卵于孵化前在氣室位置上將蛋殼小心開孔,從該孔處注入一定劑量的試驗樣品,使其附著于卵膜上,用玻璃紙貼于洞口封固,并保持氣室向上的直立位置約1h,使樣品滲入。從孵育的第四天開始,應每日觀察胚胎存活情況,一般最早出現(xiàn)死亡的是在第四天以后。試驗中應作空白對照及注射用的溶劑(不含AFB1)對照。3. 植物毒性試驗黃曲霉毒素有抑制某些植物種子發(fā)芽的作用,而且能使葉片失去葉綠素,變?yōu)辄S色甚至白色,對幼苗葉片的色素影響更為明顯。其他霉菌毒素也具有這些作用,但抑制發(fā)芽及引起變色作用的含量比AFB1大。4. 組織培養(yǎng)法遺傳性的影