感染性病原真菌檢驗(yàn)技術(shù)

1、感染性病原真菌檢驗(yàn)技術(shù)1、組織胞漿菌屬本屬為典型的雙相型真菌，37呈酵母樣細(xì)胞，25培養(yǎng)形成菌絲體。重要的致病菌有莢膜組織胞漿菌及假皮疽組織胞漿菌，分別致犬、貓肉芽腫及馬的淋巴管炎。莢膜組織胞漿菌引起人獸共患病是致犬、貓和人常發(fā)的高度接觸性傳染性組織胞漿菌病。嚴(yán)重者，可損傷全身器官。 淋巴瘤、白血病、霍奇金病、AIDS或用腎上腺皮質(zhì)激素治療者?？筛腥颈揪Ｖ饕址妇W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，寄生在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，使感染組織形成肉芽腫。奶牛、馬、羊、豬及嚙齒類動(dòng)物也可自然感染，小鼠易感染。微生物特性在巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)寄生時(shí)呈細(xì)小的、包有莢膜的圓球樣細(xì)胞，直徑l3m。在陳舊的病灶內(nèi)，菌體較大，胞漿濃縮

2、于菌體中央，與細(xì)胞壁之間出現(xiàn)一條空白帶。 2225培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基上緩慢形成絲狀菌落，開始為白色，逐漸變?yōu)樽攸S色。菌絲分支分隔，寬2.5m。產(chǎn)生橢圓形光滑或多刺小分生孢子，直徑2.53m，隨后可產(chǎn)生圓形或橢圓形大分生孢子，稱棘狀厚壁大孢子，直徑815m，表面光滑、均勻間隔的，像手指一樣凸起，是本菌的特征性形態(tài).在高濕、高濃度的二氧化碳中37培養(yǎng)時(shí)，在營養(yǎng)豐富的血培養(yǎng)基上，可形成濕潤、有光澤、表面有皺褶的細(xì)小酵母樣菌落；在肉湯中呈絮團(tuán)狀生長，鏡檢可見分支分隔的菌絲和少量孢子。鏡檢如發(fā)現(xiàn)特征性的棘厚壁大孢子，可做出診斷。活體病變組織末梢血及骨髓觸片或涂片瑞氏染色，在單核細(xì)胞或多形核細(xì)胞中如有小的、

3、呈洋蔥切面樣卵圓形孢子，亦可做出診斷。病料接種小鼠可引起發(fā)病死亡，并可檢出本菌。補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)一般在發(fā)病后23周呈陽性反應(yīng)。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)可用于犬感染的流行病學(xué)調(diào)查。亦可采用PCR和核酸探針技術(shù)鑒定,微生物檢驗(yàn)(1)標(biāo)本直接顯微鏡檢查痰液標(biāo)本涂片后先用甲醇固定10 min，再用姬姆薩染色鏡檢，如巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)卵圓形孢子，直徑24m的較小，一端有出芽，可疑為莢膜組織胞漿菌。(2)抗原檢測(cè)取患者痰液作免疫熒光法染色后鏡檢，可快速檢測(cè)其抗原，但特異性差，僅作組織胞漿菌初篩試驗(yàn)。(3)分離培養(yǎng)兩相型將臨床標(biāo)本接種于含抗生素的沙氏培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)，生長緩慢，46周才開始生長，逐漸形成白色至棕色絨毛狀菌落

4、。當(dāng)轉(zhuǎn)種于血瓊脂培養(yǎng)基上，37 很快形成酵母型菌落。(4)鑒定生化反應(yīng)取可疑菌落涂片染色鏡檢，并作脲酶試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)。莢膜組織胞漿菌分解尿素；不能液化明膠。(5)藥物敏感試驗(yàn) 組織胞漿菌對(duì)兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑敏感。(6)抗體檢測(cè)檢測(cè)血清中組織胞漿菌抗體，以補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的敏感性和特異性最高，發(fā)病2-3周陽性率可達(dá)90，有判定價(jià)值。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的抗體效價(jià)在：32以上為陽性，抗體效價(jià)4倍增長，可有助于確診。乳膠凝集試驗(yàn)時(shí)，抗體效價(jià)為1：32時(shí)可確診。 假皮疽組織胞漿菌馬屬動(dòng)物流行性淋巴管炎的病原，特征為皮下淋巴管和淋巴結(jié)發(fā)炎、腫脹和皮膚潰瘍。在自然情況下，馬、騾最易感，驢次之；人、犬、駱

5、駝、牛、豬很少感染；家兔、豚鼠人工感染可引起局部膿腫。微生物特性在膿汁中該菌呈卵圓形或瓜子形，是具有雙層膜的酵母樣細(xì)胞。大小為23m35m，一端或兩端較尖，多單在或23個(gè)排列，菌體胞漿均勻，可見24個(gè)圓形、呈回旋運(yùn)動(dòng)的小顆粒。在培養(yǎng)物中呈菌絲狀，分支分隔、粗細(xì)不勻，菌絲末端形成瓶狀假分生孢子。本菌為需氧菌，最適生長溫度2530，最適生長pH59，常用培養(yǎng)基有1%葡萄糖甘露醇甘油瓊脂、2%葡萄糖甘油瓊脂等。不發(fā)酵多種糖類，不產(chǎn)生靛基質(zhì)和H2S，VP試驗(yàn)陰性，能凝固石蕊牛乳，液化明膠。取膿汁或分泌物，適當(dāng)稀釋、鏡檢，或取痂皮，加10%KOH處理透明后，制片鏡檢。必要時(shí)可進(jìn)行分離培養(yǎng)，病料應(yīng)先用青、

6、鏈霉素處理12h后再接種。長出典型菌落時(shí)，用生理鹽水制成懸液，接種家兔或豚鼠，觀察有否膿腫，作為診斷參考?？筛鶕?jù)是否產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)做出診斷。方法是用該菌的培養(yǎng)物頸部皮內(nèi)注射，4872h后測(cè)定皮膚增厚及腫脹性質(zhì)，如注射局部發(fā)生硬固的熱痛腫脹，皮膚增厚超過5mm即為陽性。此法特異性強(qiáng)，檢出率高達(dá)80%以上。應(yīng)用經(jīng)高壓后酒精或乙醚提取的抗原進(jìn)行沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)檢查馬血清中的抗體，也是有效的診斷方法。2、念珠菌屬該菌屬半知菌綱的酵母菌念珠菌屬有150多個(gè)種，僅白色念珠菌是常見的病原，致人和動(dòng)物的念珠菌病。白色念珠菌存在于人和動(dòng)物消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜，是機(jī)會(huì)致病菌，患念珠菌病的動(dòng)物多在消

7、化道黏膜形成乳白色偽膜斑壞死物，主要侵害家禽，特別是雛雞。牛、豬、犬和嚙齒動(dòng)物也可能感染。白色念珠菌致病性條件致病皮膚粘膜感染 鵝口瘡，陰道炎內(nèi)臟感染：肺炎、關(guān)節(jié)炎、膀胱炎，腎盂腎炎中樞神經(jīng)感染：腦膜（腦）炎、腦膿腫過敏微生物特性假絲酵母菌呈圓形或卵圓形，直徑3-6m。革蘭陽性，著色不均勻。出芽方式繁殖。在組織內(nèi)可見芽生孢子、假菌絲；在玉米粉培養(yǎng)基中可產(chǎn)生假菌絲和厚膜孢子。微生物檢驗(yàn)(1)直接顯微鏡檢查：取膿汁、痰和局部炎癥性分泌物直接涂片，革蘭染色后鏡檢，顯微鏡見到革蘭陽性(著色不均勻)、圓形或卵圓形菌體或孢子及假菌絲，可確認(rèn)為假絲酵母菌感染。(2)抗原檢測(cè)：取病人血清作ELISA、免疫印跡

8、法等檢測(cè)白色念珠菌抗原。(3)核酸檢測(cè)：用PCR法將白色念珠菌DNA分子擴(kuò)增后以分子探針檢測(cè)，具有較好的敏感性和特異性。 (4)分離培養(yǎng) 將標(biāo)本接種在沙氏培養(yǎng)基上，25或37培養(yǎng)1d后，可出現(xiàn)奶油色類酵母型菌落。鏡檢可見假菌絲和芽生孢子。(5)鑒定:1)芽管形成試驗(yàn)：將假絲酵母菌接種于0.20.5m|血清中，37孵育1.5h觀察有無芽管形成。白色念珠菌可形成芽管，其他假絲酵母菌不形成芽管。2)厚膜孢子形成試驗(yàn)：將假絲酵母菌接種于玉米粉培養(yǎng)基25孵育1-2d后，白色念珠菌在菌絲頂端、側(cè)緣或中間形成厚膜孢子。 3)糖同化或發(fā)酵試驗(yàn)凡發(fā)酵某種糖一定能同化該糖，故只需做那些不發(fā)酵糖的同化試驗(yàn)。將假絲酵

9、母菌接種糖發(fā)酵管，25孵育，一般觀察23d，對(duì)不發(fā)酵或弱發(fā)酵管可延長至10d或2-4周。觀察有無酵母生長或液體培養(yǎng)基是否變混濁?，F(xiàn)在商品化的產(chǎn)色培養(yǎng)基可快速鑒定白色念珠菌和其他假絲酵母菌。(6)藥物敏感試驗(yàn)：對(duì)二性霉素B、5-FC等藥物敏感，但對(duì)5-FC極易產(chǎn)生耐藥性。(7)抗體檢測(cè)：早期診斷可用ELlSA夾心法、免疫酶斑點(diǎn)試驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便。也可用乳膠凝集試驗(yàn)和對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)等檢測(cè)血清中抗白色念珠菌抗體。(8)動(dòng)物試驗(yàn)：將假絲酵母菌懸液注射1ml于家兔耳靜脈或注射0.2ml于小白鼠尾靜脈，假絲酵母菌對(duì)動(dòng)物無致病性。3、隱球菌屬包括17個(gè)種和7個(gè)變種，廣泛分布于自然界，人體體表、口腔和腸道中。外

10、源性感染, 經(jīng)呼吸道侵入，由肺經(jīng)血行播散,可侵犯肺、腦及腦膜、皮膚、骨和關(guān)節(jié)。好發(fā)于細(xì)胞免疫功能低下者，如AIDS、惡性腫瘤、糖尿病、器官移植及大劑量使用糖皮質(zhì)激素者?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)新生隱球菌、淺白隱球菌和羅倫隱球菌有致病性。新型隱球菌引起的人獸共患病新型隱球菌在自然界廣泛存在，可從土壤、空氣、水果、牛乳，以及人的皮膚、腸道中分離到。易感新型隱球酵母病的動(dòng)物有犬、貓，豬、馬、牛和禽類，特別是鴿子，可作為其自然寄主和主要傳染體。其主要傳染途徑是：孢子隨塵埃被人吸入后停留于肺部，繼而血行播散；通過體表外傷侵入人體；食用被污染，特別是被鴿糞污染的食品，發(fā)生腸道感染，繼而血行播散。進(jìn)入人體的病菌可到達(dá)很多部

11、位并發(fā)病，其中以中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為最常見，如腦膜炎，其次有肺炎、腎炎、敗血癥以及皮膚、骨骼等癥狀。 微生物特性在組織中呈圓形或卵圓形，直徑一般在46m，外周有寬厚莢膜，莢膜較菌大13倍，折光性強(qiáng)，一般染色法不易著色而難以發(fā)現(xiàn)而得名。常采用墨汁負(fù)染色法，在黑色景下可鏡檢到透亮菌體和寬厚莢膜。非致病性隱球菌無莢膜。微生物檢驗(yàn)(1) 標(biāo)本直接鏡檢：用病人腦脊液作墨汁負(fù)染色檢查是診斷隱球菌腦膜炎最簡(jiǎn)便、快速方法。常規(guī)細(xì)胞染色可發(fā)現(xiàn)隱球菌，但易誤診和漏診。如用PAS染色后新生隱球菌呈紅色。(2) 抗原檢測(cè)用乳膠凝集試驗(yàn)、ELISA、和單克隆抗體法等免疫學(xué)方法檢測(cè)隱球菌莢膜多糖特異性抗原，已成為臨床上的常

12、規(guī)診斷方法。其中以乳膠凝集試驗(yàn)最為常用，此法簡(jiǎn)便、快速。特別對(duì)直接鏡檢和分離鑒定陰性者更有診斷價(jià)值。ELISA敏感性和特異性都較高。單克隆抗體法除有較高敏感性和特異性外，標(biāo)本無須稀釋和預(yù)先處理的優(yōu)點(diǎn)。(3) 核酸檢測(cè)可用痰液、支氣管吸出物等標(biāo)本核酸檢測(cè)方法有DNA探針法、PCR探針法等，用于檢測(cè)的探針、引物主要選自保守區(qū)的重復(fù)序列。可檢出新生隱球菌，并可區(qū)別類型，是新生變種還是格特變種。非致病性隱球菌不被檢出。此方法不受藥物治療的影響，還能正確評(píng)價(jià)臨床療效和愈后等。 (4) 分離培養(yǎng)將標(biāo)本接種在沙氏培養(yǎng)基上，病原性隱球菌在25和37生長，而非病原性隱球菌在37時(shí)不生長。培養(yǎng)25d后觀察菌落形態(tài)

13、特點(diǎn)，并取菌落作印度墨汁負(fù)染色鏡檢。() 鑒定1）酚氧化酶試驗(yàn)：接種L-多巴枸櫞酸鐵和咖啡酸培養(yǎng)基中，經(jīng)25d培養(yǎng)，呈棕黑色菌落。2）脲酶試驗(yàn)：能產(chǎn)生脲酶分解尿素瓊脂培養(yǎng) 基中的尿素形成NH4+和CO2，使pH升高，培養(yǎng)基可由黃色變粉紅色，而白假絲酵 母菌為陰性。3）糖同化及發(fā)酵試驗(yàn)：能同化葡萄糖、 半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能發(fā)酵多糖 類，不能同化硝酸鹽。非致病性隱球菌不能同化肌醇。絲囊霉菌微生物特性外形與真正的真菌相似，由纖細(xì)的分支的絲狀菌絲組成。但細(xì)胞壁由纖維素構(gòu)成，而大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁成分是幾丁質(zhì)。絲囊霉菌還有管狀的線粒體嵴，也有別于真正的真菌。菌絲的一系列片段均可發(fā)育成孢子囊。孢子囊的

14、形成和發(fā)射孢子的適宜溫度為1624，但完成從初級(jí)孢子到次級(jí)游走孢子形成過程的適宜溫度是24。次級(jí)游走孢子運(yùn)動(dòng)綴慢而不協(xié)調(diào)。不同基因型的螯蝦絲囊霉菌在生活過程中均會(huì)產(chǎn)生高水平的幾丁酶，有一定鑒別意義。微生物檢驗(yàn)通過病原分離和形態(tài)學(xué)鑒別迸行診斷。無菌切取感染組織12mm2的小片置分離培養(yǎng)基表面，室溫下培養(yǎng)，將出現(xiàn)的菌絲轉(zhuǎn)移到新鮮的瓊脂平板上，直到平板無其他污染菌為止。鑒定絲囊霉菌屬必需誘導(dǎo)并觀察孢子形成。取帶有生長活力菌絲的一小塊瓊脂（直徑34cm），置于GPY肉湯中20孵育4d，用滅菌的池塘水洗5次，然后于其中20過夜。大約12h后形成原代孢囊群落，在顯微鏡下可見出現(xiàn)能游動(dòng)的次級(jí)游走孢子。再結(jié)合

15、典型的絲囊霉菌無性繁殖特征可鑒定到種。近年來發(fā)展的PCR、原位雜交等技術(shù)可檢測(cè)種特異性rRNA基因，簡(jiǎn)便快捷，適用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)。5、肺孢菌屬肺孢菌是一種機(jī)會(huì)病原微生物，可感染馬、牛、羊、豬、犬、貓、鼠等多種動(dòng)物，有宿主特異性。在正常健康的宿主體內(nèi)通常不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，而在免疫功能低下的動(dòng)物體內(nèi)可引起嚴(yán)重的肺炎。特征為明顯的呼吸道癥狀，普遍性或局灶性肺炎，肺泡內(nèi)充滿孢子。卡氏肺孢菌為感染動(dòng)物的肺孢菌曾稱為卡氏肺孢子蟲。分類還存在一些爭(zhēng)議。已往大多數(shù)學(xué)者依據(jù)抗原蟲藥有效和具有孢囊、滋養(yǎng)體兩種形態(tài)，認(rèn)為應(yīng)屬于原蟲。近來分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，卡氏肺孢子蟲線粒體的16s和5s核糖體RNA的核苷酸

16、序列與真菌有更多的同源性，染色特性也類似真菌，應(yīng)歸屬于真菌?？ㄊ戏捂呔鷱V泛分布于自然界，主要是空氣傳播，在健康人體內(nèi)，多為無癥狀的隱性感染。當(dāng)宿主免疫力下降，潛伏的卡氏肺孢菌在病人肺內(nèi)大量繁殖擴(kuò)散，使肺泡上皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致間質(zhì)性漿細(xì)胞肺炎，又稱卡氏肺孢菌性肺炎, 是AIDS最常見、最嚴(yán)重的機(jī)會(huì)感染性疾病，病死率高達(dá)70100。微生物特性生活史有包囊和滋養(yǎng)體兩種形態(tài)。滋養(yǎng)體壁較薄，單個(gè)核，形態(tài)不規(guī)則，直徑25m，姬氏染色后胞質(zhì)呈藍(lán)色，核呈紫紅色。包囊為感染型，滋養(yǎng)體為繁殖型，呈二分裂法繁殖。包囊分為成熟包囊和未成熟包囊，前者壁較厚，直徑68m，呈球形，內(nèi)含8個(gè)囊內(nèi)小體，大小11.5m，呈球形排列規(guī)則或不規(guī)則單個(gè)核；后者一般呈橢圓形，35