學(xué)年創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)總結(jié)報告

2002學(xué)年創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)總結(jié)報告手性藥物去甲腎上腺素對映體的高效毛細(xì)管電泳-電化學(xué)分離檢測報告人：許迪明

指導(dǎo)教師:謝天堯

1精選PPT手性藥物去甲腎上腺素對映體的毛細(xì)管電泳-電化學(xué)分離檢測

摘要：本文報道了以未涂層融硅石英毛細(xì)管（50cm×75μm）為分離柱，5mmol/LNaOH+8mmol/LCitricacid+8mmol/Lb-CD為電泳介質(zhì)，分離電壓12.5KV，檢測電壓0.80V，建立的去甲腎上腺素對映體高效毛細(xì)管電泳-方波安培分離檢測方法。對分離過程中使用的緩沖溶液種類、濃度、pH、分離電壓對拆分效果的影響進(jìn)行了討論，并對拆分機(jī)理進(jìn)行了探討。2精選PPT

手性藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的作用越來越被人們重視。在含有對映異構(gòu)體的藥物中，一種異構(gòu)體是藥物的有效組分，而另一種則可能低效，無效乃至有毒，所以美國食品與藥物管理局出臺了手性藥物的管理法規(guī)，并引起國際上對手性藥物分離分析的重視（1）。手性化合物分離檢測的常用方法有高效液相色譜（HPLC），氣相色譜（GC），超臨界流體（SFC）和毛細(xì)管電泳（CE）。近年來，毛細(xì)管電泳手性分離技術(shù)引起了人們的重視，并得到了快速發(fā)展。概述部分3精選PPT

目前，有關(guān)采用毛細(xì)管電泳分離手性藥物報道中以光學(xué)檢測為多，電化學(xué)檢測的應(yīng)用很少。毛細(xì)管電泳—電化學(xué)檢測，尤其是安培檢測，可使用極細(xì)孔徑的毛細(xì)管而不會造成靈敏度的損失，具有靈敏度高、線性范圍寬、設(shè)備簡單價廉、易于微機(jī)化和微型化，而被認(rèn)為是CE的極具潛力的檢測方法。近年來隨著制約其應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)的突破，其應(yīng)用潛能正在得到發(fā)揮，與其它類型的檢測器相比，具有自身的特點(diǎn)和優(yōu)勢，已發(fā)展成為一種重要的分離分析方法，將在手性藥物拆分方面有較大的應(yīng)用前景。概述部分4精選PPT

去甲腎上腺素(Noradrenaline)是一種急救藥，具有很強(qiáng)的血管收縮作用，使全身小動脈與小靜脈都收縮(但冠狀血管擴(kuò)張)，外周阻力增高，血壓上升。臨床上主要利用它的升壓作用，靜滴用于各種休克(但出血性休克禁用)，以提高血壓，保證對重要器官(如腦)的血液供應(yīng)。，結(jié)構(gòu)式見圖1。去甲腎上腺素是手性分子，含R型和S型。本文首次采用高效毛細(xì)管電泳—方波安培檢測法，以5mmol/LNaOH+8mmol/LCitricacid+8mmol/Lb-CD為電泳介質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了去甲腎上腺素對映體的分離檢測，取得了滿意的結(jié)果。概述部分5精選PPT去甲腎上腺素分子結(jié)構(gòu)圖圖1去甲腎上腺素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1StructureofNoradrenaline6精選PPT1.主要儀器和試劑CES2000毛細(xì)管電泳儀（高壓電源，安培檢測器，毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)工作站，中山大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院研制）；PHS-3C型酸度計（上海偉業(yè)儀器廠）；石英毛細(xì)管（50cm×75μmi.d.,河北永年光導(dǎo)纖維廠）。CQ-2B型超聲波清洗器（明珠電器有限公司）。

去甲腎上腺素（上海禾豐制藥公司產(chǎn)品）；b-CD（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品）；氫氧化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）；檸檬酸（Citricacid,廣州化學(xué)試劑廠）；所用試劑均為分析純，水為二次石英重蒸水。實(shí)驗(yàn)部分7精選PPT

2.緩沖液和樣品溶液

分別配制100mmol/L檸檬酸、氫氧化鈉；25mmol/Lb-CD儲備液。實(shí)驗(yàn)時，按要求量取適量儲備液制得不同濃度和不同pH的電泳運(yùn)行緩沖液。去甲腎上腺素對映體配成2mg/mL的儲備液，進(jìn)樣時用緩沖溶液稀釋到所需濃度。實(shí)驗(yàn)部分8精選PPT

3.實(shí)驗(yàn)方法

連接好毛細(xì)管電泳儀和檢測裝置，毛細(xì)管柱在使用前依次用0.1mol/LNaOH，蒸餾水和運(yùn)行液各沖洗約5min。檢測電極用超聲波進(jìn)行沖洗。當(dāng)更換運(yùn)行液或進(jìn)樣4次以后，也需按上述步驟清洗毛細(xì)管和電極。進(jìn)樣方式采用重力進(jìn)樣，要求進(jìn)樣端與檢測端的高度差為20cm，進(jìn)樣時間為10s。方波安培檢測器的輸出信號經(jīng)數(shù)據(jù)工作站采集到微機(jī)中，進(jìn)行實(shí)時數(shù)據(jù)處理、圖形顯示和數(shù)據(jù)文件存儲。實(shí)驗(yàn)在恒溫（25?C），恒濕（70%）的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)部分9精選PPT

3.1

b-CD濃度的影響

b-CD是手性選擇劑，是對映體分離的主要因素，它的濃度直接決定了分離效果，不同濃度的b-CD對兩個對映體分離的分離效果不同。高濃度和低濃度的b-CD對手性分離的機(jī)理也有變化。高濃度的b-CD由于非特異性疏水作用和b-CD的二聚作用導(dǎo)致手性識別能力。低濃度的b-CD與兩對映體的作用互相競爭。b-CD的濃度也影響了底液的性質(zhì)，使毛細(xì)管電泳的推動力電滲流產(chǎn)生變化，改變了對映體的分離性。3.結(jié)果與討論10精選PPT1b-CD濃度的影響

實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，圖2－A是b-CD的時濃度為4mmol/L時的分離效果圖，可以看出兩個對映體還沒有明顯分開；圖2－B是b-CD的時濃度為8mmol/L時的分離效果圖，此時的分離效果比較滿意；圖2－C是b-CD的時濃度為12mmol/L時的分離的效果圖，此時的分離效果基本滿意。當(dāng)b-CD濃度大于8mmol/L小于12mmol/L時，去甲腎上腺素對映體分別得到完全分離。最佳b-CD濃度為8mmol/L。結(jié)果與討論11精選PPT圖2不同濃度的b-CD分離效果電泳條件：檸檬酸8mmol/L，NaOH5mmol/L，分離電壓12.5KV，進(jìn)樣時間10Sβ-CD濃度的影響4mmol/L8mmol/L12mmol/LABC12精選PPT2檸檬酸濃度及pH值的影響在分離過程中，通過選擇pH值可以調(diào)整電遷移和電滲流的平衡，增加分離度。pH值不僅可以影響毛細(xì)管中的電滲流來改變出峰時間來改善分離效果，同時還會使手性對映體與β-CD的相互作用變化，改變分析物的遷移行為和分離選擇性。緩沖液pH值得選擇還應(yīng)兼顧遷移時間。在低pH情況下，電滲流很小，對于質(zhì)子化程度較低的手性藥物來說分析時間較長，提高pH值分析時間縮短[3]。所以在分辨率允許的范圍內(nèi)，常采用高的pH值。檸檬酸體系在方波安培檢測中有良好的背景。

結(jié)果與討論13精選PPT2檸檬酸濃度及pH值的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)檸檬酸濃度在4－8mmol/L時，去甲腎上腺素對映體得不到分離，如圖3－A所示，L型和R型在檸檬酸濃度為4mmol/L時得不到較好的分離效果。檸檬酸濃度大于8mmol/L后，對映體到達(dá)基線分離，但出峰時間較長，如圖3－B所示，在檸檬酸濃度為8mmol/L時，去甲腎上腺素兩對映體的分離效果較好，且出峰時間大約在14分鐘左右；如圖3－C所示檸檬酸濃度為12mmol/L時，分離效果很好，只是出峰的時間在15分鐘左右。本實(shí)驗(yàn)選擇檸檬酸濃度為8mmol/L。

結(jié)果與討論14精選PPT檸檬酸濃度的影響圖3不同濃度的檸檬酸分離效果圖電泳條件：b-CD8mmol/L，NaOH5mmol/L，分離電壓12.5KV，進(jìn)樣時間10S4mmol/L8mmol/L12mmol/L

ABC15精選PPT3.分離電壓和檢測電壓的影響電壓在分離過程中有一最佳值。樣品的出峰時間對電壓的響應(yīng)很敏感，高電壓使溶液的電滲流值增加，從而加快了樣品出峰時間。但是加大分離電壓會產(chǎn)生較多的焦耳熱而使溫度升高，溫度的升高又使溶液粘度變化，使毛細(xì)管壁上的溶液和毛細(xì)管中央的溶液的遷移速度不通，而造成峰形拖尾的現(xiàn)象。兩對映體和b-CD的包合是一個快速可逆的平衡過程，從熱力學(xué)角度來講，高溫不利于包合，降低了b-CD的分離效率。結(jié)果與討論16精選PPT3.分離電壓和檢測電壓的影響

圖4－A是電壓為12.5KV時的分離效果，圖4－B是電壓為10.5KV時的分離效果。由圖可知，隨著分離電壓的增加，對映體的出峰時間迅速提前（由14.5min提前到13min),同時未出現(xiàn)因熱效應(yīng)引起的區(qū)帶展寬和分離效果變差。綜合考慮分離度和分析時間，本實(shí)驗(yàn)選擇分離電壓為12.5KV。結(jié)果與討論17精選PPT分離電壓的影響圖4不同分離的電壓分離效果圖電泳條件：b-CD8mmol/L+檸檬酸8mmol/L+NaOH5mmol/L，進(jìn)樣時間10S

＋12.5KV＋10.5KV

AB18精選PPT

4.旋光性測定

對于外消旋體，由于左、右旋體的量相等結(jié)果其旋光度為零，在電泳圖譜上表現(xiàn)為兩個面積幾近相同的電泳峰。本實(shí)驗(yàn)中去甲腎上腺素針劑樣品的兩個對映體的峰面積大小相差較大（見圖5），表明其以非外消旋體形式存在，應(yīng)具旋光性。將甲腎上腺素加水稀釋成1mL含2mg的溶液，在鈉光譜(539.3nm)，20℃條件下，測得的旋光度為-0.565°。表明出峰較早的電泳峰對應(yīng)的是左旋(－)對映體，隨后的右旋體(+)。

結(jié)果與討論19精選PPT圖5

去甲腎上腺素針劑樣品的CE圖譜電泳條件：b-CD8mmol/L+檸檬酸8mmol/L+NaOH5mmol/L，分離電壓12KV，進(jìn)樣時間15S

（－）（＋）旋光性測定20精選PPT5重現(xiàn)性測定

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別將20mg/L去甲腎上腺素各連續(xù)6次測定，峰面積，如表1所示。

結(jié)果與討論21精選PPT表1重現(xiàn)性測定

12

3456（-）峰面積279242791027887278032802327822（+）峰面積108310661046102511011041（+）/（（-）+（+））右旋體含量百分比（℅）3.733.683.623.563.783.61

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)2.2℅22精選PPTb-CD是由7個D-吡喃型葡萄糖基通過α-（1→4）糖苷鍵連接而成的錐筒狀分子，其2-，3-位仲羥基及6-位伯羥基分別位于錐筒空腔的大小口，b-CD的空腔內(nèi)表面只有氫原子和帶孤對電子的糖苷氧原子，所以b-CD腔內(nèi)疏水，腔外親水的兩性分子，因此可以與一些有機(jī)化合物形成主-客體包和物，b-CD的結(jié)構(gòu)見圖6。Dalgliesh認(rèn)為b-CD分離對映體應(yīng)該符合“三點(diǎn)原理”：第一，被拆分的對映體必須有一部分進(jìn)入b-CD的空腔內(nèi)；第二，被拆分的對映體必須帶有能和b-CD上的羥基形成作用力的羥基或氨基；第三，兩對映體與b-CD的包合作用力不同，即包和常數(shù)有差別。機(jī)理討論23精選PPT圖6.b-CD的分子結(jié)構(gòu)MW=1135Fig.3Chemicalstructureandschematicmodelofb-CD：MW=1135(molecularmass)β-CD的分子結(jié)構(gòu)24精選PPT

在拆分去甲腎上腺素對映體時，苯環(huán)進(jìn)入b-CD疏水腔，氨基上的氮原子與環(huán)糊精空腔外的羥基發(fā)生作用。R型和S型的氮原子與b-CD上的羥基形成不同的分子間作用力，使R型和S型對映體與β-CD形成的包合絡(luò)合物在溶液中的淌度不一樣，而實(shí)現(xiàn)分離，如圖7所示。機(jī)理討論25精選PPT

機(jī)理討論圖7b-CD包合去甲腎上腺素示意圖

26精選PPT

1苑可

戴立信

，關(guān)注“手性藥物”，科技術(shù)語研究，2002，4（2）：2-42朱曉峰

薛俊

林炳承，手性藥物的毛細(xì)管電泳拆分環(huán)糊精