產(chǎn)α-淀粉酶菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗(yàn)課件

產(chǎn)α-淀粉酶菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成正交優(yōu)化試驗(yàn)?zāi)康囊罅私庹辉囼?yàn)的基本原理、意義及在生物學(xué)研究領(lǐng)域的適用范圍和作用。掌握正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)一般基本方法和步驟，涉及因素、水平的選擇確定，正交表的選擇及因素水平在其中的合理安排。掌握正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析方法，同時(shí)了解相關(guān)方差分析方法。基本原理利用正交試驗(yàn)所選試驗(yàn)的“均勻分散，齊整可比”特點(diǎn)，通過其中對(duì)部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，從而達(dá)到了解全面試驗(yàn)的情況，最終完成用部分試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn)的目的和結(jié)果。正交試驗(yàn)知識(shí)介紹正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的定義和特征定義：用正交表安排多因素試驗(yàn)與分析試驗(yàn)結(jié)果的方法，簡(jiǎn)稱正交試驗(yàn)法；是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)。是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本特點(diǎn)是：用部分試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn)，通過對(duì)部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，了解全面試驗(yàn)的情況。正交表日本著名的統(tǒng)計(jì)學(xué)家田口玄一將正交試驗(yàn)選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。

圖10-13因素3水平的全面試驗(yàn)水平組合數(shù)為33=27，4因素3水平的全面試驗(yàn)水平組合數(shù)為34=81，5因素3水平的全面試驗(yàn)水平組合數(shù)為35=243，這在科學(xué)試驗(yàn)中是有可能做不到的。

正交設(shè)計(jì)就是從選優(yōu)區(qū)全面試驗(yàn)點(diǎn)（水平組合）中挑選出有代表性的部分試驗(yàn)點(diǎn)（水平組合）來進(jìn)行試驗(yàn)。上圖中標(biāo)有試驗(yàn)號(hào)的九個(gè)“(·)”，就是利用正交表L9(33)從27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中挑選出來的9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。即：（1）A1B1C1（2）A2B1C2（3）A3B1C3（4）A1B2C2（5）A2B2C3（6）A3B2C1（7）A1B3C3（8）A2B3C1（9）A3B3C2正交表的基本性質(zhì)

1、正交性（1）任一列中，各水平都出現(xiàn)，且出現(xiàn)的次數(shù)相等（2）任兩列之間各種不同水平的所有可能組合都出現(xiàn)，且出現(xiàn)的次數(shù)相等

2、代表性一方面：（1）任一列的各水平都出現(xiàn)，使得部分試驗(yàn)中包括了所有因素的所有水平；（2）任兩列的所有水平組合都出現(xiàn)，使任意兩因素間的試驗(yàn)組合為全面試驗(yàn)。另一方面：由于正交表的正交性，正交試驗(yàn)的試驗(yàn)點(diǎn)必然均衡地分布在全面試驗(yàn)點(diǎn)中，具有很強(qiáng)的代表性。因此，部分試驗(yàn)尋找的最優(yōu)條件與全面試驗(yàn)所找的最優(yōu)條件，應(yīng)有一致的趨勢(shì)。3、整齊可比性（1）任一列的各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等；（2）任兩列間所有水平組合出現(xiàn)次數(shù)相等；這樣就使得任一因素各水平的試驗(yàn)條件相同（整齊）。進(jìn)一步保證了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干擾。從而可以綜合比較該因素不同水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響情況（可比）。正交表的表示

以Ln（tq）代表正交表格式，則L代表正交表，n代表實(shí)驗(yàn)次數(shù)，t代表因素水平數(shù)，q代表因素?cái)?shù)。如L4（23）表示用此正交表可設(shè)計(jì)3個(gè)觀察因素，每個(gè)因素有2個(gè)水平，須進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)（完全試驗(yàn)需要進(jìn)行23=8個(gè)水平組合試驗(yàn)）。又如L9(34)，完全試驗(yàn)需要進(jìn)行34=81個(gè)水平組合試驗(yàn)。在分析測(cè)試中，常用的幾種正交表是L4(23)、L8(27)、L9(34)、L16(45)、L25(56)、L27(313)等。正交表的選擇依據(jù)在能容納所研究的因素?cái)?shù)和因素水平數(shù)的前提下選用試驗(yàn)次數(shù)最少的正交表來安排試驗(yàn)。實(shí)際應(yīng)用中所選擇的正交表的試驗(yàn)次數(shù)不易太多，因素和因素水平不一定通過一次試驗(yàn)全面考慮，可以通過多次試驗(yàn)完成，否則會(huì)造成計(jì)算量的增大及分析工作的復(fù)雜性。試驗(yàn)?zāi)康呐c要求試驗(yàn)指標(biāo)選因素、定水平因素、水平確定選擇合適正交表表頭設(shè)計(jì)列試驗(yàn)方案試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)流程試驗(yàn)結(jié)果分析進(jìn)行試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果極差分析計(jì)算T值計(jì)算X值計(jì)算極差R繪制因素指標(biāo)趨勢(shì)圖優(yōu)水平因素主次順序優(yōu)組合結(jié)論試驗(yàn)結(jié)果分析：試驗(yàn)結(jié)果方差分析列方差分析表，進(jìn)行F檢驗(yàn)計(jì)算各列偏差平方和、自由度分析檢驗(yàn)結(jié)果，寫出結(jié)論正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)所包括的內(nèi)容正交設(shè)計(jì)的因素水平表正交試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)選用正交表及試驗(yàn)方案試驗(yàn)方案及其結(jié)果（包括直觀分析）因素各水平與試驗(yàn)指標(biāo)關(guān)系圖方差分析表重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果的分析直觀分析——極差分析計(jì)算各因素各水平下試驗(yàn)指標(biāo)值的總和、平均值及因素水平平均值最大和最小之差值——極差，從而反映了各試驗(yàn)因素的主次；優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、計(jì)算工作量小；缺點(diǎn)是判斷因素效應(yīng)的精度不夠，也不能給出誤差的大小，即不能很好的判斷試驗(yàn)結(jié)果存在的差異是因試驗(yàn)誤差造成的，還是試驗(yàn)真實(shí)的結(jié)果表現(xiàn)。方差分析建立在多因素方差分析基礎(chǔ)上，考慮了試驗(yàn)誤差，從而反映了各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性——試驗(yàn)差異是否是因素的真實(shí)表現(xiàn)。因計(jì)算量較大及較復(fù)雜，可以通過相應(yīng)的分析軟件（如SPSS、SAS、EXCEL等）進(jìn)行計(jì)算及輔助分析完成。

表1正交設(shè)計(jì)的因素水平表

此表的目的：列表確定需要考察的因素和水平表2正交試驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)

此表的目的：所選正交表的各列和考察因素一一對(duì)應(yīng)。表4試驗(yàn)方案及其結(jié)果

因素各水平與測(cè)定指標(biāo)關(guān)系圖表6方差分析表

（空D列，無重復(fù)）

注：F0.05（2，8）=4.46；F0.01（2，8）=8.65變異來源平方和自由度均方FA286216.9582143108.4790.783B1446223.1842723111.5923.955C279613.4592139806.7300.765誤差365675.9252182837.963

總變異2377729.5278

表7重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)此次正交試驗(yàn)的說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素問題可變因素——需要進(jìn)行考察的因素；不變因素——不需要考察的因素，在試驗(yàn)起始或過程中固定不變（相對(duì)而言）?；緱l件的確定及操控——需要綜合設(shè)定，統(tǒng)籌準(zhǔn)備，嚴(yán)格控制，試驗(yàn)組之間保持不變。pH值在搖瓶發(fā)酵中的作用一般情況下（實(shí)驗(yàn)室），只能做到起始pH的調(diào)整；試驗(yàn)過程中的pH控制很難進(jìn)行或精確控制；培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌后，有時(shí)會(huì)有一定變化（一般會(huì)變低）；所以試驗(yàn)設(shè)置pH作為因素，可能在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中達(dá)不到相應(yīng)的目的。初次進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)的要求設(shè)計(jì)可以先粗放一些，后面的工作可以越來越細(xì)；先找出影響大的因素，再進(jìn)行細(xì)致研究；影響不大在后續(xù)試驗(yàn)中不再考慮（需要注意因素之間的交互作用）；水平設(shè)置可以把梯度拉大（生物的適應(yīng)是有一定容度的），這樣可以使結(jié)果更加明顯（直接可以把相關(guān)因素的水平設(shè)置為“0”）。裝液量作為因素時(shí)的要求裝液量的多少可以改變培養(yǎng)基溶解氧的多少（非定量的間接反映）；一般請(qǐng)用500ml三角瓶，這樣可以很好的進(jìn)行設(shè)置；需要考慮培養(yǎng)過程中的蒸發(fā)量損耗。溫度設(shè)定及搖瓶轉(zhuǎn)速設(shè)定的問題搖瓶機(jī)及搖床的控制精度不夠和臺(tái)套數(shù)不足，溫度、轉(zhuǎn)速設(shè)定不夠精確（儀器之間相差較大），可能會(huì)帶來一些不清楚的影響，建議不要采用。盡量圍繞著培養(yǎng)基的組成來進(jìn)行開展試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的準(zhǔn)備工作計(jì)算所需菌種量（種子培養(yǎng)基的準(zhǔn)備）；正交試驗(yàn)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備；配制過程中要細(xì)致，不要出錯(cuò)，每組試驗(yàn)一瓶一瓶配制，認(rèn)真仔細(xì)檢查，共同的非可變因素可以統(tǒng)一配制后，分別加入；不要急于實(shí)施試驗(yàn)，仔細(xì)推敲試驗(yàn)方案；試驗(yàn)時(shí)間，用倒推計(jì)算；試驗(yàn)的基本安排確定因素、水平，選定L9（34）正交表。根據(jù)正交表安排，配制表中9個(gè)試驗(yàn)號(hào)的培養(yǎng)基、1個(gè)初篩和復(fù)篩中使用的培養(yǎng)基（作為對(duì)照），共計(jì)10種培養(yǎng)基，滅菌后備用。準(zhǔn)備接種用的液體活化菌,提前12-24小時(shí)接種培養(yǎng)；接種：9個(gè)試驗(yàn)號(hào)培養(yǎng)基、1個(gè)對(duì)照培養(yǎng)基，共計(jì)10瓶，接種量2mL/瓶。37℃搖瓶培養(yǎng)3天（往復(fù)式振蕩培養(yǎng)100~120轉(zhuǎn)/分）。分別測(cè)定10組酶活力，結(jié)果采用極差分析和方差分析，得出結(jié)論?；玖鞒虦缇_定因素及水平選擇合適正交表結(jié)果分析配制培養(yǎng)基37℃搖瓶培養(yǎng)3天測(cè)定酶活力極差分析方差分析因素的主次關(guān)系、理論最優(yōu)組合液體菌種活化12~14小時(shí)接種2mL/瓶滅菌備用培養(yǎng)基保藏斜面菌種接種1環(huán)于活化培養(yǎng)基方差分析表各因素水平差異的顯著性完成后結(jié)合試驗(yàn)及分析結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)重復(fù)試驗(yàn)

——結(jié)合2種情況安排相關(guān)試驗(yàn)極差分析后得到的理論最優(yōu)化組合；理論最優(yōu)化組合是否出現(xiàn)在所用正交表組合中（實(shí)際試驗(yàn)組合中）；①出現(xiàn)（說明理論和試驗(yàn)有一定吻合），再找出正交表組合中出現(xiàn)的次優(yōu)組合，2種組合的培養(yǎng)基各配制2~3瓶；②未出現(xiàn)，找出正交表組合中出現(xiàn)的最優(yōu)組合（試驗(yàn)），和理論最優(yōu)組合的培養(yǎng)基各配制2~3瓶。相關(guān)培養(yǎng)基滅菌后，冷卻后接種液體活化菌種，搖瓶培養(yǎng)3天，測(cè)酶活力，結(jié)合測(cè)定結(jié)果進(jìn)行綜合分析判斷。重復(fù)試驗(yàn)后發(fā)酵液的處理合并測(cè)定酶活力后的發(fā)酵液于1個(gè)500mL三角瓶（選酶活力高的）；裝入6只100mL帶蓋離心管中，兩兩天平稱重配平（連蓋）；10000~12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，收集上清液，放入密封容器中（500mL飲料瓶），蓋好蓋子密封；放入-20℃冰箱（柜），凍存?zhèn)溆?；用時(shí)提前冷水浴溶化。重復(fù)試驗(yàn)后發(fā)酵液的處理及酶的粗提?。ù置阜鄣闹苽洌┝鞒堂富盍Ω叩陌l(fā)酵液合并離心（12000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘測(cè)定發(fā)酵液酶活力-20℃冷凍保存收集上清液用時(shí)提前水浴溶化量取250mL放入1000mL離心瓶中離心瓶精確稱重加入2倍體積的-20℃預(yù)冷無水乙醇（500mL）混勻后冷凍離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘）去上清乙醇混合液（統(tǒng)一收集）冷凍離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘）再加入100mL-20℃預(yù)冷無水乙醇脫水處理輕搖后去上清乙醇液（統(tǒng)一收集）沉淀室溫真空干燥（備用）留樣凍存?zhèn)湟院蟊容^分析試驗(yàn)的基本安排一、下周停課，進(jìn)行必要準(zhǔn)備工作：1、分組自行設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案；2、完成以前實(shí)驗(yàn)報(bào)告；3、下周星期一上交正交試驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)報(bào)告。二、試驗(yàn)過程的安排：1、上課時(shí)間準(zhǔn)備正交試驗(yàn)用培養(yǎng)基，接種；2、菌種的活化自己安排好（保證菌種正常）；3、具體測(cè)定時(shí)間的安排根據(jù)各組的試驗(yàn)方案再定。SPSS用于正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)的輸入及分析準(zhǔn)備啟動(dòng)SPSS，進(jìn)入變量視