抗生素發(fā)酵工程

關(guān)于抗生素發(fā)酵工程第1頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四第一節(jié)抗生素概論一、抗生素的定義傳統(tǒng)的定義：抗生素（antibiotic）是微生物細(xì)胞產(chǎn)生的能以低濃度抑制其他微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)?，F(xiàn)代定義：抗生素是生物細(xì)胞產(chǎn)生的能以低濃度抑制其他生物細(xì)胞生長(zhǎng)或功能的化學(xué)物質(zhì)抗生素與藥理活性物質(zhì)的區(qū)別：藥理活性物質(zhì)作用于動(dòng)植物體本身的生理功能（如免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、降血壓、抗炎、減肥、動(dòng)植物生長(zhǎng)促進(jìn)、植物生長(zhǎng)抑制等等）抗生素作用于動(dòng)植物體內(nèi)的寄生（或贅生）生物（細(xì)菌、真菌、病毒、癌細(xì)胞等）第2頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年統(tǒng)計(jì)，全世界每年有1400萬人死于感染病，占死亡人數(shù)的第一位，其次是心臟病、癌癥和腦疾病，分別為750萬人、700萬人和550萬人。一種新的抗生素研制的費(fèi)用大約需要十幾億美金和10到15年的過程，而使用不當(dāng)，3到5年病菌就會(huì)對(duì)這種藥物產(chǎn)生耐藥性。我國(guó)的金黃色葡萄球菌的耐青霉素比例已經(jīng)高達(dá)90%，造成肺炎的病菌在社區(qū)的標(biāo)本有20%可以耐藥，而在醫(yī)院內(nèi)這一比例可以達(dá)到60%。肺炎鏈球菌已有45%耐青霉素，70%耐紅霉素。第3頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四二、青霉素的發(fā)現(xiàn)者及1945年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者AlexanderFleming(1881-1955)B.

Chain(1906-1979)W.

Florey(1898-1968)返回第4頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四三、微生物產(chǎn)生抗生素1、放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉菌屬：放線菌素、鏈霉素等60％種類。小單抱菌屬：紅霉素（大環(huán)內(nèi)酯類）、新霉素（氨基環(huán)醇類）諾卡氏菌屬：肌霉素（氨基環(huán)醇類）、諾卡氏菌素第5頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四2、細(xì)菌產(chǎn)生抗生素芽孢桿菌屬：多粘芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌假單胞菌屬：銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）桿菌肽、粘桿菌素、多黏菌素等多肽類。3、真菌產(chǎn)生抗生素青霉屬：青霉素、灰黃霉素。頭孢菌屬：頭孢霉素第6頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四四、抗生素的分類（一）類亞類主要品種b-內(nèi)酰胺類(b-Lactams)青霉素類頭孢烯類氧頭孢烯類碳頭孢烯類青霉烯類碳青霉烯類單環(huán)內(nèi)酰胺類-內(nèi)酰胺酶抑制劑青霉素G，青霉素V，氨芐西林，阿莫西林，······頭孢噻吩，頭孢唑啉，頭孢氨芐，頭孢羥氨芐，······拉氧頭孢，氟氧頭孢氯碳頭孢瑞替配能，法羅配能亞胺配能，帕尼配能，美洛配能，比阿配能氨曲喃，卡魯莫喃棒酸，舒巴坦，三唑巴坦，舒他西林，三唑配能第7頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-內(nèi)酰胺環(huán)R第8頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四抗生素的分類（二）類亞類主要品種氨基糖苷類(Amino-glycosides)天然半合成鏈霉素，卡那霉素，慶大米星(慶大霉素)，小諾米星(小諾霉素)，核糖霉素，妥布霉素，紫蘇霉素，阿斯米星(福提霉素)，大觀霉素，新霉素，春日霉素，有效霉素半合成卡那霉素：阿貝卡星，阿米卡星，地貝卡星；半合成紫蘇霉素：奈替米星；半合成慶大霉素：衣替米星第9頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四抗生素的分類（三）類亞類主要品種大環(huán)內(nèi)酯類(Macro-lactones)14員環(huán)15員環(huán)16員環(huán)>20員紅霉素，竹桃霉素，半合成紅霉素克拉霉素、羅紅霉素、地紅霉素、氟紅霉素阿齊霉素(半合成紅霉素)柱晶白霉素(北里霉素)，交沙霉素，麥迪霉素，羅他霉素(丙酰柱晶白霉素)，乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素(半合成螺旋霉素)，三岡霉素(半合成麥迪霉素)，泰洛菌素，除蟲菌素，雙氫除蟲菌素(半合成除蟲菌素)，環(huán)氧噻酮藤霉素(他克莫司)，雷帕霉素(昔洛莫司)第10頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四

紅霉素A克拉霉素羅紅霉素氟紅霉素

R1H

CH3H

HR2

O

O

NOCH2O(CH2)2OCH3

OR3H

H

HF第11頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四抗生素的分類（四）類亞類主要品種四環(huán)素類(Tetra-cyclines)天然半合成四環(huán)素，土霉素，金霉素，去甲基金霉素脫氧土霉素(多西環(huán)素)，甲烯土霉素(米他環(huán)素)，二甲胺四環(huán)素(米諾環(huán)素)多肽類(peptides)桿菌肽，短桿菌肽S，多粘菌素B，粘桿菌素，卷曲霉素，結(jié)核放線菌素，絲裂霉素，環(huán)孢素(環(huán)孢菌素)，古斯莫司，烏苯美司，二丙膦第12頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四作用機(jī)制（一）作用機(jī)制抗生素主要作用靶位抑制細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖生物合成-內(nèi)酰胺類磷霉素糖肽類環(huán)絲氨酸桿菌肽抑制轉(zhuǎn)肽酶活性，破壞肽聚糖相互交聯(lián)和肽聚糖生物合成中的UDP-N-乙酰葡糖胺丙酮酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合，阻斷UDP-N-乙酰葡糖胺向UDP-N-乙酰胞壁酸的轉(zhuǎn)化與D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)抑制丙氨酸消旋酶和D-丙氨酰-D-丙氨酸合成酶抑制焦磷酸酶，阻斷肽聚糖跨膜載體十一聚異戊二烯醇再生第13頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四作用機(jī)制（二）作用機(jī)制抗生素主要作用靶位破壞微生物細(xì)胞質(zhì)膜功能多烯類唑類抗真菌藥物托萘酯(發(fā)癬退)多粘菌素B,粘桿菌素短桿菌肽S脂肽類(Daptomycin)與組成真菌細(xì)胞膜的麥角固醇結(jié)合而破壞膜功能抑制真菌羊毛固醇脫甲基酶(細(xì)胞色素P-450)，阻斷麥角固醇合成抑制真菌角鯊烯單加氧酶類似陽離子洗滌劑的作用，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)切斷細(xì)菌電子傳遞系統(tǒng)與氧化磷酸化的偶聯(lián)與G(+)細(xì)菌的脂磷壁酸結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)膜去極化，從而破壞膜的傳輸功能第14頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四作用機(jī)制（三）作用機(jī)制抗生素主要作用靶位抑制蛋白質(zhì)生物合成氨基糖苷類四環(huán)素類氯霉素、林肯霉素和大環(huán)內(nèi)酯類春日霉素卷曲霉素噁唑烷二酮類與核糖體30S亞基和50S亞基結(jié)合，抑制肽酰-tRNA轉(zhuǎn)位與30S亞基結(jié)合，抑制氨基脂?；?tRNA與mRNA密碼子依賴性核糖體A位結(jié)合作用于50S亞基中的23S核蛋白體RNA(rRNA)，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶抑制30S亞基與甲酰蛋氨酸-tRNA復(fù)合物的形成與30S及50S亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成的開始階段和延長(zhǎng)過程的轉(zhuǎn)位與50S亞基的23SrRNA結(jié)合，干擾70S功能起始復(fù)合物的形成第15頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四作用機(jī)制（四）作用機(jī)制抗生素主要作用靶位抑制DNA生物合成磺胺類甲氧芐啶,氨甲蝶呤,氨基蝶呤絲裂霉素C博來霉素萘啶酸，奎諾酮類，新生霉素抑制細(xì)菌二氫葉酸合成酶抑制細(xì)菌二氫葉酸還原酶抑制DNA復(fù)制時(shí)的雙鏈打開與DNA結(jié)合，切斷DNA的一條鏈抑制細(xì)菌DNA促旋酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶)抑制RNA生物合成桑吉霉素，豐加霉素放線菌素D蒽環(huán)類利福霉素類抑制轉(zhuǎn)錄反應(yīng)抑制DNA依賴性RNA聚合酶抑制DNA依賴性RNA和DNA聚合酶抑制細(xì)菌DNA依賴性RNA聚合酶第16頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四作用機(jī)制（五）作用機(jī)制抗生素主要作用靶位作用于細(xì)胞內(nèi)的陽離子離子載體類抗生素(莫能菌素、鹽霉素等聚醚類，二、三、四抗菌素等大環(huán)四內(nèi)酯類，纈氨霉素、白僵菌素等肽類抗生素)與細(xì)胞膜中的Na+、K+、Ag+、Ca2+等金屬離子形成穩(wěn)定的螯合物，影響細(xì)胞膜的離子透過性，打亂細(xì)胞內(nèi)的離子分布，使細(xì)胞失去正常功能抑制有絲分裂灰黃霉素，長(zhǎng)春花生物堿與微管蛋白結(jié)合，干擾有絲分裂紡錘體的形成。第17頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四作用機(jī)制（六）作用機(jī)制抗生素主要作用靶位抑制能量代謝抗霉素A，殺稻瘟菌素S，干蠕孢菌素阻礙呼吸鏈的電子傳遞，抑制ATP合成酶拮抗神經(jīng)傳遞物質(zhì)除蟲菌素，雙氫除蟲菌素拮抗線形動(dòng)物和節(jié)足動(dòng)物的神經(jīng)傳遞物質(zhì)-氨基丁酸，使細(xì)胞神經(jīng)麻痹，直至死亡第18頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四五、抗生素產(chǎn)生菌的選育1、抗生素產(chǎn)生菌的分離2、抗菌性試驗(yàn)3、抗生素產(chǎn)生菌的改良(1)人工誘變(2)原生質(zhì)體融合第19頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四(3)體外DNA重組

克隆第20頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四六、抗生素的提純

微生物在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括各種初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物以及培養(yǎng)基的固有成分，這些成分的存在影響抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成儲(chǔ)存困難，必須經(jīng)過精制。第21頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四⑴抗生素提純的基本步驟和原則3個(gè)基本步驟：發(fā)酵液過濾和預(yù)處理、粗純化、精制4個(gè)原則：時(shí)間盡量短；采用適當(dāng)較低濃度；條件適宜，pH適度，溫度適宜；防止雜菌污染。⑵提取方法：吸附、萃取、離子交換、沉淀⑶色譜分離、分子篩過濾、透析等等第22頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四第二節(jié)青霉素的發(fā)酵工藝第23頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四1、青霉素的產(chǎn)生菌作為第一個(gè)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗生素，1928年被發(fā)現(xiàn)，1943年在美國(guó)被首次實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。點(diǎn)青霉的發(fā)酵單位很低2U/mL，目前國(guó)際上青霉素生產(chǎn)最高發(fā)酵單位80000-90000U/mL.生產(chǎn)菌種按其在深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)分為：絲狀菌和球狀菌。黃孢子絲狀菌綠孢子絲狀菌第24頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四2、青霉素的作用機(jī)制、抗菌譜及穩(wěn)定性(1)作用機(jī)制：抑制細(xì)菌的轉(zhuǎn)肽酶，阻止細(xì)胞壁合成中的交叉連接步驟，使處于繁殖分裂期的細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)生障礙，導(dǎo)致菌體細(xì)胞壁損壞，使細(xì)胞內(nèi)因滲透壓等原因發(fā)生溶解而死亡。(2)抗菌譜：作用于大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌及部分革蘭氏陰性細(xì)菌。(3)穩(wěn)定性：弱酸性的有機(jī)化合物，干燥純凈的青霉素鹽很穩(wěn)定，pH5-7，6最穩(wěn)定。第25頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四5、青霉素發(fā)酵工藝流程及發(fā)酵控制青霉素發(fā)酵培養(yǎng)流程第26頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四(1)培養(yǎng)基的成分組成和配比對(duì)菌體生長(zhǎng)發(fā)育、發(fā)酵單位及質(zhì)量C源：碳水化合物，葡萄糖、乳糖N源：玉米漿、黃豆粉；硝酸銨、氯化銨無機(jī)鹽：各種離子前體物質(zhì)：苯乙胺、苯乙酸(2)發(fā)酵工藝控制：二級(jí)發(fā)酵，菌齡、特性、生長(zhǎng)環(huán)境(3)補(bǔ)料及控制：糖、硫酸銨、苯乙酸、氨水、玉米油(4)發(fā)酵溫度、pH及通氣攪拌的控制：溫度：26-27℃，pH:6.6-6.9，通氣攪拌：1：0.95第27頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四(5)青霉素的提取發(fā)酵液預(yù)處理→萃取→脫色→反萃取→過濾洗滌→干燥①發(fā)酵液預(yù)處理：A加熱使蛋白質(zhì)變性沉淀；B加絮凝劑使蛋白質(zhì)沉淀C固液分離離心②萃取工藝過程：二級(jí)逆流萃取第28頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四A、萃取目的：雜質(zhì)多，含量少。原理：分配定律，青霉素G在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有機(jī)溶劑中，青霉素鹽易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。青霉素在濾液中以鹽存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有機(jī)相中，在醋酸丁酯中加入碳酸鉀，6.2-7.2，形成鹽轉(zhuǎn)入水相中，實(shí)現(xiàn)反萃取。第29頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四B、影響萃取因素a、pH：反復(fù)調(diào)節(jié)pH，青霉素不穩(wěn)定，易發(fā)生降解、異構(gòu)化、重排，β-內(nèi)酰胺環(huán)是功能性。b、溫度：加熱會(huì)加快其降解反應(yīng)c、工藝過程及濃縮倍數(shù)，級(jí)數(shù)越高、純度越高但收率越低。d、微生物污染：雜菌：β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶e、萃取時(shí)間：青霉素在水中的半衰期18.5min。第30頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四6、青霉素的精制制成堿金屬鹽：堿金屬鹽穩(wěn)定性大；青霉素在水中的穩(wěn)定性差，水解快。(1)結(jié)晶工藝：A、醋酸丁酯中直接結(jié)晶：加入醋酸鉀-乙醇----碳酸鉀、丁醇-水真空共沸蒸餾。B、丁醇-水共沸結(jié)晶：青霉素的堿金屬鹽溶于水，在丁醇中不溶解，穩(wěn)定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇帶出水分，不斷加入丁醇，可使水分不斷減少，結(jié)晶析出。第31頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四(2)過濾、洗滌、干燥結(jié)晶后用真空抽濾來處理母液，并用丁醇洗滌。干燥采用真空雙錐旋轉(zhuǎn)干燥器，7、溶媒回收采用立式傳質(zhì)塔蒸餾回收。第32頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四一、斜面培養(yǎng)：淀粉1％，硫酸銨0.3％、玉米粉0.6～1.0％、氯化鈉0.3％、蛋白胨0.2％、瓊脂2％、pH7.0～7.237℃培養(yǎng)7～10d，成熟的孢子灰色略帶微紅色。一級(jí)種子培養(yǎng)：豆餅粉2.5％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸銨0.5％、％、玉米粉0.2％、氯化鈉0.3％、磷酸氫二鉀0.06％、硫酸鎂0.025％、豆油0.3％35℃培養(yǎng)72h，菌絲密集紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)第33頁，共39頁，2022年，5月20日，21點(diǎn)54分，星期四二級(jí)種子：豆餅粉2.2％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸銨0.1％、玉米粉0.8％、氯化鈉0.3％、碳酸鈣0.6％、豆油0.3％35℃，24h，接種量10％二、發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉2.4％、葡萄糖3％、3.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸銨0.1％、玉米粉0.8％、氯化鈉0.3％、碳酸鈣0.6％、豆油0.15％，丙酸0.6％（分次加入）60h前35℃，60h后33℃第3