組織培養(yǎng)技術(shù)(1)課件

組織培養(yǎng)技術(shù)

TissueCultureTechnique課程簡介：

本課程是為碩士研究生開設(shè)的、重點是實踐操作技術(shù)的一門課程。組織培養(yǎng)技術(shù)是目前醫(yī)學(xué)研究中較常用的一門技術(shù)。要學(xué)習(xí)技術(shù)方法，也要掌握其理論知識，“要知其然，也要知其所以然”。本課程36學(xué)時，理論與實驗近1：1；理論集中授課，實驗分班進(jìn)行（條件受限）；每次1個班，≤40人/班，5人/組，共分8組；理論課：一階梯教室；實驗課：實驗大樓701室。實驗結(jié)束進(jìn)行閉卷理論考試（包括實驗內(nèi)容）。第一章緒論和基本理論知識第一節(jié)緒論一、組織培養(yǎng)發(fā)展簡史早期發(fā)展1885~1906(20年)(一)現(xiàn)代組織培養(yǎng)的建立1、懸滴培養(yǎng)法（第一階段）1907年Harrison懸滴培養(yǎng)法滅菌淋巴液蛙胚神經(jīng)數(shù)周

1912年Carrel血漿包埋組織塊+胎汁更新培養(yǎng)基傳代雞胚心肌數(shù)年之久實驗表明：提示：

證明：2、單層培養(yǎng)法48年—70年代（第二階段）培養(yǎng)容器：凹玻片→試管→玻璃培養(yǎng)瓶

→塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板培養(yǎng)液：天然培養(yǎng)基→人工培養(yǎng)基

促生長物質(zhì)：胎汁→血清→生長因子

培養(yǎng)技術(shù)方法：48年KKSabfond分離細(xì)胞培養(yǎng)法

51年CMPomerat灌流小室57年Dulbecco單層細(xì)胞培養(yǎng)法單層培養(yǎng)優(yōu)點

項目

優(yōu)勢培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展已容易培養(yǎng)成功細(xì)胞細(xì)胞可用單細(xì)胞克隆法純化便于對細(xì)胞進(jìn)行遺傳性研究研究觀察直接觀察活細(xì)胞，可應(yīng)用各種包括分子生物學(xué)技術(shù)處理材料來源動物和人的各種組織和細(xì)胞傳代擴(kuò)增便于傳代，能提供大量細(xì)胞克隆培養(yǎng)清除其他細(xì)胞，純化細(xì)胞貯存冷凍長期保存應(yīng)用極為廣泛，三維培養(yǎng)的基礎(chǔ)3、三維培養(yǎng)（立體培養(yǎng)--第三階段）

單層培養(yǎng)：細(xì)胞失去立體形態(tài)原因：1）缺少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）2）血供代謝-營養(yǎng)3）缺少調(diào)控因子（生長和分化因子）90年代提出三維或三D培養(yǎng)：（二）中國組織培養(yǎng)的發(fā)展

二、對組織培養(yǎng)工作者的要求和工作方法

（一）觀念要求：1、掌握培養(yǎng)技術(shù)2、具有判定能力3、熟悉理論知識工作方法：1、良好的工作態(tài)度特點2、正確的工作方法目的（二）防止污染（三）實驗工作效率（影響因素）

三、組織培養(yǎng)基本概念

細(xì)胞培養(yǎng)(單層培養(yǎng))組織培養(yǎng)三維培養(yǎng)或立體培養(yǎng)(InVitro)(組織型培養(yǎng))器官培養(yǎng)(器官整體或局部)

體外培養(yǎng)(InVitroCulture)組織培養(yǎng)(TissueCulture)細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)器官培養(yǎng)(OrganCulture)

體內(nèi)培養(yǎng)(InVivoCulture)體外培養(yǎng)體內(nèi)培養(yǎng)

方面優(yōu)越性觀察技術(shù)便于使用不同的技術(shù)方法，如相差、熒光、電子顯微鏡、組織化學(xué)、同位素標(biāo)記等方法研究細(xì)胞分子層次培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞有同等的基因組，是分子生物學(xué)和遺傳工程學(xué)的研究對象研究手段易于施用物理、化學(xué)和生物因素等進(jìn)行實驗研究檢測藥物檢測新藥藥理效應(yīng)和機(jī)制分析實用性生物制品、單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程制品等的生產(chǎn)手段組織工程三維立體培養(yǎng)已接近于體內(nèi)組織，并成為了組織工程實施的基礎(chǔ)，也為人類損傷組織器官的修復(fù)，衰老組織器官的更新帶來福音

總結(jié)上述培養(yǎng)技術(shù)之優(yōu)點（一）簡化細(xì)胞生長環(huán)境（二）方便施加實驗因素（三）容易觀察實驗結(jié)果（四）便于獲得良好的實驗材料

細(xì)胞類型單一、細(xì)胞周期同步均勻、

生物學(xué)性狀基本相同、對實驗因素反應(yīng)一致

（五）能夠進(jìn)行大規(guī)模生物制品生產(chǎn)組織工程等五、組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用組織學(xué)與胚胎學(xué)細(xì)胞生物學(xué)1、形態(tài)學(xué)2、生理學(xué)3、遺傳學(xué)腫瘤學(xué)1、生物學(xué)特征2、發(fā)病機(jī)制3、異種移植微生物學(xué)病毒、細(xì)菌免疫學(xué)抗體、疫苗藥理學(xué)

50年代起，該技術(shù)已成為藥物篩選、細(xì)胞毒性和細(xì)胞活性檢測中極為重要的手段。優(yōu)點：1、提供遺傳性狀或相似的實驗細(xì)胞材料2、準(zhǔn)確控制藥物作用的對象

3、侍測藥物直接與效應(yīng)細(xì)胞接觸、作用

4、保護(hù)動物

不足：——體外細(xì)胞生長環(huán)境簡單而體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜——適用于單質(zhì)藥物研究（復(fù)方藥、中成藥）

——檢測水溶性藥物較易

——主要適用于研究藥物的急性毒性作用

動物細(xì)胞與微生物大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)實踐上的應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用試管嬰兒、克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物干細(xì)胞移植及其誘導(dǎo)分化、細(xì)胞工程、生物反應(yīng)器第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)

一、生存環(huán)境與細(xì)胞關(guān)系體內(nèi)外細(xì)胞的差異

不同環(huán)境中細(xì)胞的性狀

細(xì)胞性狀體內(nèi)一般單層培養(yǎng)中三維培養(yǎng)細(xì)胞表型細(xì)胞表型

空間結(jié)構(gòu)立體長寬(扁形)立體

細(xì)胞群異質(zhì)群同類型細(xì)胞增多分化群

形態(tài)固有改變與固有近似

增殖性受控旺盛(趨向自主)趨向正常增殖規(guī)律協(xié)調(diào)性周期性趨向協(xié)調(diào)(隨傳代而變)

固有功能有降低或喪失可誘導(dǎo)發(fā)生

分化現(xiàn)象有紊亂、趨向增加降低或喪失(或有限)

生命期有限有限(趨向無限)有限遺傳穩(wěn)定性穩(wěn)定較易轉(zhuǎn)化趨向穩(wěn)定

二、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)

(一)大體形態(tài)

貼附型、懸浮型兩大類

1、圓形細(xì)胞2、放射延展細(xì)胞(Radial