酶活性濃度的測定技術(shù)課件

第五章診斷酶學(xué)DiagnosticEnzymology第四節(jié)酶活性濃度的測定技術(shù)

體液中酶的測定是臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)的一項重要內(nèi)容。二十世紀(jì)50年代人們用分光光度法建立了連續(xù)監(jiān)測酶活性濃度方法，到60年代特別是80年代以后，由于各種工具酶和酶分析試劑盒的生產(chǎn)與普及，自動和半自動生物化學(xué)分析儀的引進(jìn)和應(yīng)用，使得各種體液酶的測定在方法學(xué)與臨床應(yīng)用方面有了長足的進(jìn)步與發(fā)展。一、概述正常人血中大部分酶一般在pg（10-12克）到ng（10-9克）水平，要直接測定這種微量酶蛋白是十分困難的。常用的酶學(xué)測定方法則利用酶有加速化學(xué)反應(yīng)（催化）的特性，通過測定被加速化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率，根據(jù)酶促反應(yīng)中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來計算酶活性濃度的高低。這種濃度的確切名稱是“酶的催化活性濃度”或簡稱為“酶活性濃度”。按監(jiān)測方法分類可分為量氣法、分光光度法、熒光法和放射性核素法、電極法和其他方法。以分光光度法最為常用。2．分光光度法從50年代起采用分光光度法取代比色法，其最大優(yōu)點(diǎn)在于擴(kuò)大了測定范圍，波長范圍更寬。酶促反應(yīng)的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍測定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長范圍測定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無色物質(zhì)。結(jié)合各種工具酶的偶聯(lián)反應(yīng)，如應(yīng)用NAD(P)H和NAD(P)＋吸收光譜差異建立的測定各種脫氫酶活性濃度的方法，使分光光度法得到了進(jìn)一步發(fā)展，幾乎可應(yīng)用于各種血清酶活性的測定。隨著各種自動生物化學(xué)儀和配套用試劑盒的普及應(yīng)用，這一方法在臨床酶學(xué)測定中起著十分重要的作用。熒光法取決于酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比，并通過熒光光度計進(jìn)行測定，根據(jù)熒光強(qiáng)弱的變化換算出酶的活性。例如，還原型的NAD(P)H有強(qiáng)烈的熒光，故所有以NAD(P)＋為輔酶的氧化還原酶類均可用熒光法進(jìn)行測定。核素法因有污染且操作煩雜，目前應(yīng)用較少。4．其他方法當(dāng)酶促反應(yīng)涉及酸堿變化時，可用pH儀或電位滴定儀測定酸堿度變化來計算酶濃度。這類方法需要一定儀器，操作麻煩。此外，各種電極法、旋光法、極譜法、高效液相色譜法或生物發(fā)光法等也可用于測定特定的酶或進(jìn)行酶學(xué)研究。Note極譜法（polarography）通過測定電解過程中所得到的極化電極的電流-電位（或電位-時間）曲線來確定溶液中被測物質(zhì)濃度的一類電化學(xué)分析方法。（一）酶促反應(yīng)進(jìn)程如將酶促反應(yīng)過程中測得的產(chǎn)物[P]或底物[S]變化量對時間作圖，可得酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線（圖6-2）。圖中產(chǎn)物[P]或底物[S]變化曲線的斜率就代表酶促反應(yīng)的速率。隨后在過量的底物存在下，反應(yīng)速率加快并達(dá)到一個反應(yīng)速率穩(wěn)定的階段，即酶促反應(yīng)以恒定的速率進(jìn)行，不受底物濃度的影響，這段反應(yīng)稱為線性反應(yīng)期（1inearphase）或零級反應(yīng)期（zeroorder）。產(chǎn)物[P]和底物[S]與時間t成線性關(guān)系。隨著時間的延長，由于種種因素，如底物因酶反應(yīng)消耗而濃度下降，產(chǎn)物濃度上升出現(xiàn)逆反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可能有抑制酶反應(yīng)作用或酶的熱失活等，使酶促反應(yīng)變慢，即反應(yīng)速率下降，偏離線性，這段時間稱為一級反應(yīng)期（firstorder）。反應(yīng)速率與底物[S]成正比，產(chǎn)物[P]與時間t不成線性關(guān)系。如果反應(yīng)速率受兩種或兩種以上物質(zhì)濃度的影響，則反應(yīng)可為一級、二級或多級反應(yīng)，一般將這段反應(yīng)時間統(tǒng)稱為非線性反應(yīng)期。圖6-3顯示單試劑速率法酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線。為了計算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應(yīng)期的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計算出酶活性濃度，否則將導(dǎo)致誤差。在延滯期、非線性反應(yīng)期所測得的結(jié)果不準(zhǔn)確，一般結(jié)果偏低。（二）酶活性濃度測定方法酶活性濃度測定就是要使酶促反應(yīng)的初速度（v）達(dá)到最大速度Vmax，即在過量底物存在下的零級反應(yīng)期的速度，此時反應(yīng)速度與酶濃度[E]之間有線性關(guān)系。1．定時法這是早期測定酶活性濃度的方法。大多是使酶作用一段時間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測定這段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計算酶促反應(yīng)平均速度。這類方法有多種命名，如“取樣法”、“終點(diǎn)法”或“兩點(diǎn)法”。用此類方法測定酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要很精確，否則會引起較大誤差。圖6-4顯示定時法中酶促反應(yīng)的三種可能過程。雖然從t1到t2三種反應(yīng)所生成的產(chǎn)物量相同，但實(shí)際反應(yīng)過程有很大差別。曲線1說明酶促反應(yīng)速率接近終點(diǎn)時已經(jīng)減慢，曲線2說明在反應(yīng)早期存在延滯期。只有曲線3時，用定時法可以準(zhǔn)確測定代表酶活性濃度的反應(yīng)速率。因此，用定時法準(zhǔn)確測定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應(yīng)速率和時間的關(guān)系，應(yīng)先做預(yù)試驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時期，確定線性時間，然后在這段時間進(jìn)行測定，避開延滯期和一級反應(yīng)。2．連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)測定酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計算酶活性濃度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法。與定時法不同的是，這類方法勿需停止酶促反應(yīng)，不需添加其他呈色試劑，就可測定反應(yīng)物的變化，很容易觀察到反應(yīng)的整個過程。在以往的一段時期里，常把這類方法稱為“動力學(xué)法”或“速率法”。這類測定方法簡單，優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測定結(jié)果連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，以觀察到是否偏離零級反應(yīng)，因而可選擇線性反應(yīng)期來計算酶活性，不需終止反應(yīng)。通常截取反應(yīng)開始后較短的時間，就能近似地建立這種反應(yīng)量與反應(yīng)時間的線性關(guān)系，不過這種時間范圍因酶種類和反應(yīng)條件而異，必須用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行確定。連續(xù)監(jiān)測法測定結(jié)果常較定時法高，且因在酶促反應(yīng)初始階段底物最充裕，而產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應(yīng)、酶變性等均很小，因而測定結(jié)果也較取樣法準(zhǔn)確。三、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，各種自動生物化學(xué)分析儀的廣泛使用，連續(xù)監(jiān)測法已逐步取代定時法而成為臨床實(shí)驗(yàn)室測定酶活性濃度最常用的方法。（一）連續(xù)監(jiān)測法的種類1．直接法這類方法是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過測定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導(dǎo)率、粘度等，從而計算出酶活性濃度。其中以分光光度法應(yīng)用最為廣泛，也是方法學(xué)上最成熟的一種。利用NAD(P)H在340nm處的吸光度的變化測定各種脫氫酶的方法是應(yīng)用最廣的一類方法。NAD(P)H在260nm波長和340nm波長處有吸收峰，而氧化型NAD＋／NADP＋只在260nm波長處有吸收峰，這是因?yàn)榉肿又杏邢汆堰实木壒省?40nm波長處吸光度的變化可以反映反應(yīng)體系中NAD(P)H量的增減。A+NAD(P)＋B+NAD(P)H脫氫酶還可利用一類人工合成的所謂“色素原”底物，其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物，如目前應(yīng)用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物進(jìn)行水解酶和一些還原酶的測定。ABC酶促反應(yīng)顯色反應(yīng)2．間接法直接法雖然簡單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)等方面有顯著差異時，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法進(jìn)行測定。目前可采用兩類間接法進(jìn)行酶學(xué)測定。一類方法是在原來反應(yīng)體系中加入一些試劑，這些試劑只和酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可被儀器檢出的物質(zhì)變化，但同時又不和酶作用也不影響酶活性。典型的例子是血清ChE（膽堿酯酶）的丁酰硫代膽堿測定法。另一類是目前應(yīng)用最多，最為廣泛的酶偶聯(lián)法，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測酶反應(yīng)偶聯(lián)起來。（二）酶偶聯(lián)反應(yīng)最簡單的酶偶聯(lián)反應(yīng)（單底物反應(yīng)且只有一個工具酶）模式為：ABC被測定酶（Ex）催化的反應(yīng)稱為始發(fā)反應(yīng)；產(chǎn)生被檢測物質(zhì)產(chǎn)物C（如NADH）的反應(yīng)稱為指示反應(yīng)，相應(yīng)的偶聯(lián)酶（第二個酶）酶稱指示酶（Ei）。ExEi如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時往往還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連接起來，此反應(yīng)稱為輔助反應(yīng)。模式為：ABCD一般習(xí)慣將最后一個酶稱指示酶（Ei），其他外加的酶稱為輔助酶（Ea）。個別情況還可能使用兩種或以上的輔助酶。將這一連串酶促反應(yīng)稱為酶偶聯(lián)體系。ExEiEa臨床常規(guī)酶學(xué)分析所用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶。通過監(jiān)測其反應(yīng)物NADH或NADPH于340nm處吸光度的變化速率，可以很容易地監(jiān)測指示酶反應(yīng)。用酶偶聯(lián)法測定酶活性濃度時，并不是一開始反應(yīng)就全部反映了測定酶活性。這是因?yàn)樵谂悸?lián)反應(yīng)中存在幾個時相：一是預(yù)孵育期，反應(yīng)一開始只存在底物A，不存在指示酶的反應(yīng)，在此時相中使存在于樣品中的干擾物質(zhì)充分進(jìn)行反應(yīng)，將試劑中的NADH變?yōu)镹AD＋。二是延滯期，加入底物啟動反應(yīng)，在啟動后的一段短時間內(nèi)，產(chǎn)物B開始出現(xiàn)并逐漸增加，處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表測定酶的反應(yīng)速率Vx，這一時期稱為延滯期。隨著產(chǎn)物B增加到一定程度時，Ex和Ei反應(yīng)速率相同，達(dá)到了穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm波長處吸光度才會有明顯的線性變化。最后由于底物消耗，反應(yīng)速度又復(fù)減慢。圖6-5顯示酶偶聯(lián)法測定ALT時吸光度變化的掃描圖譜。設(shè)計或選擇酶測定方法時，如用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測定時間一定要避開此期。當(dāng)然也不是所有酶都適合用酶偶聯(lián)法進(jìn)行測定。為了保證準(zhǔn)確測定酶活性，酶偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)速率應(yīng)超過或等于測定酶的反應(yīng)速率，指示酶反應(yīng)必須是一級反應(yīng)，即指示酶反應(yīng)速率應(yīng)和測定酶的產(chǎn)物B濃度成正比。只有當(dāng)使用大量的指示酶，以及指示酶的Km很小時，才能做到這一點(diǎn)。一般說來酶偶聯(lián)法中所用的指示酶Km值都很小，酶促反應(yīng)最適pH應(yīng)與工具酶的反應(yīng)最適pH相接近。當(dāng)然在選用指示酶時還應(yīng)從經(jīng)濟(jì)方面考慮選用一些來源容易且價格便宜的酶制劑。（三）干擾因素臨床測定酶活性濃度標(biāo)本都是體液，其中除測定酶外，還存在著其他各種酶和其他物質(zhì)，因此在實(shí)測反應(yīng)中可能出現(xiàn)一些副反應(yīng)或旁路反應(yīng)，這些都會對測定反應(yīng)產(chǎn)生干擾。1．其他酶和物質(zhì)的干擾反應(yīng)體系各成分除可能引起測定酶反應(yīng)外，還有可能引起其他酶的反應(yīng)而干擾測定。例如酶偶聯(lián)法測ALT時，由于反應(yīng)體系中含有大量NADH和LD(H)，可與血液標(biāo)本中所含丙酮酸反應(yīng)，引起340nm波長處吸光度下降，從而引起ALT活性測定誤差。又如紅細(xì)胞中腺苷酸激酶（AK）對CK測定的干擾，在CK測定的酶偶聯(lián)體系中ADP是CK的底物，但它又同時是AK的底物，二個酶反應(yīng)都產(chǎn)生ATP。ATP在試劑中與己糖激酶（HK）和G6PD作用會形成NADH引起340nm波長處吸光度的上升，出現(xiàn)CK酶活性結(jié)果偏高。為避免此干擾，一般在反應(yīng)體系中加入AK的抑制劑腺苷酸（AMP）和二腺苷五磷酸（AP5A）。2．酶的污染因試劑用酶多從動物組織或細(xì)菌中提取，易污染其他酶，如不設(shè)法除去將引起測定誤差。如組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。使用的酶制劑（如工具酶）必須提純。例如測AST時，被蘋果酸脫氫酶所污染的AST不應(yīng)超過相對量的5×10-5（0．005％）。3．非酶反應(yīng)有些底物不穩(wěn)定，沒有酶的作用就會自行反應(yīng)。例如很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時間可自行水解釋放出硝基酚。類似情況還可見于一些內(nèi)部因素如pH變化而引起的空白對照的變化。又如測定ALD（醛縮酶）時，其底物醛類化合物可以和NAD＋起非酶反應(yīng)產(chǎn)生一種具有類似NADH的吸收光譜的衍生物，給測定帶來困難。4．分析容器的污染如分析容器或管道污染而混雜有其他一些物質(zhì)，可能影響酶的活性。如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。5．沉淀形成使用分光光度法測定酶活性時，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會引起吸光度變化。常加入表面活性劑以防止顆粒從勻漿中析出。有些酶反應(yīng)需鎂離子作為輔因子，如反應(yīng)液中含有多余磷酸根時將有沉淀出現(xiàn)。解決上述干擾問題的方法之一可通過試劑空白管檢出并加以校正。即有時不僅要作標(biāo)本對照管，還要作試劑空白管。另一個有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測定酶活性。四、工具酶通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為工具酶。常使用酶偶聯(lián)體系進(jìn)行測定，指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。（一）常用工具酶及其質(zhì)量要求常用工具酶多為氧化還原酶類，這是因?yàn)槠洚a(chǎn)物最易被直接監(jiān)測而成為指示酶。在一系列利用工具酶的反應(yīng)中，主要限速因子應(yīng)該是待測化合物和待測酶，工具酶和其輔助底物應(yīng)過量。工具酶純度不必要求過高，這樣才能降低其作為試劑的成本。但對工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑制劑等）的含量要有一定的限制，以保證工具酶一定的比活性和純度，減少或避免一些干擾測定的不必要的副反應(yīng)。（二）工具酶參與的指示反應(yīng)近年來，在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多項目的測定往往使用有工具酶的參與的類似的反應(yīng)原理，即所謂共通（或通用）反應(yīng)途徑。最常用的有兩類分光光度法，一類是利用較高特異性的氧化酶產(chǎn)生過氧化氫（H2O2），再加氧化發(fā)色劑比色；另一類是利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)＋-NAD(P)H的正／逆反應(yīng)后，直接通過分光光度法或其他方法測定NAD(P)H的變化量。表6-4顯示臨床常用的共通性呈色反應(yīng)。1．偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應(yīng)臨床化學(xué)測定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇氧化酶、甘油氧化酶、丙酮酸氧化酶等工具酶分別用于葡萄糖、尿酸、膽固醇、甘油、丙酮酸的測定，可使相應(yīng)底物被氧化生成H2O2。H2O2主要通過以氫（或電子）為受體的指示酶反應(yīng)進(jìn)行檢測。有兩類工具酶參與反應(yīng)：過氧化氫酶或稱觸酶（catalase）及過氧化物酶（peroxidase，POD），兩者均為含三價鐵的指示酶，以指示酶POD最為常用。血糖測定（葡萄糖氧化酶法）葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+苯酚醌亞胺+4H2O過氧化物酶（紅色）葡萄糖氧化酶血清總膽固醇測定（膽固醇氧化酶法）膽固醇酯+H2O膽固醇+脂肪酸膽固醇+O24-膽甾氧化烯酮+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+苯酚醌亞胺+4H2O膽固醇酯酶膽固醇氧化酶過氧化物酶（紅色）2．NAD(P)＋或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng)許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶的脫氫酶如LD(H)、GLD（谷氨酸脫氫酶）

、G6PD等參與時，常將底物的氫原子去除后傳遞給NAD(P)＋而形成NAD(P)H。LD主要以NAD＋／NADH為輔酶，而GLD則不論來自肝或細(xì)菌，均可以NAD＋／NADP＋或其還原型為輔酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法進(jìn)行檢測。目前利用此類反應(yīng)的測定項目至少有葡萄糖、尿素、β-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD(H)、GLD（谷氨酸脫氫酶）、CK、ALD（醛縮酶）、G6PD和ICD（異檸檬酸脫氫酶）此外，酶循環(huán)法（enzymaticcyclingmethods）采用兩類工具酶進(jìn)行循環(huán)催化反應(yīng)，使被測物放大擴(kuò)增，從而使檢測靈敏度提高。目前已應(yīng)用于臨床常規(guī)總膽汁酸的測定。為了簡化操作過程，并使酶試劑得以方便或反復(fù)使用，已有許多研究將水溶性的酶通過吸附、包埋、載體共價結(jié)合或通過酶分子間共價交聯(lián)等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，這樣制備的酶稱為固相酶（或固定酶）（immobilizedenzyme）。近些年來，固相酶技術(shù)發(fā)展迅速，特別是固相酶膜