1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的相對分子量報告

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質的相對分子量實驗目的1、了解電泳技術的主要內容2、掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理與實驗操作技術3、學會用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法測定蛋白質的相對分子量實驗原理聚丙烯酰胺凝膠是一種多孔凝膠可用來檢測蛋白質混合樣品，主要是根據蛋白組分的分子大小和形狀以及所帶靜電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差異。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS),與SDS結合的蛋白質帶有一致的負電荷，電泳時蛋白質分子的遷移率主要取決于其相對分子質量,而與蛋白質自身形狀及所帶電荷無關。蛋白質的分子量與電泳遷被率間的關系，可用下式表示：MW=K(10-bm)(1)IgMW=lgk-bmR=Kl-bmR(2)式中MW為蛋白質分子量,K、K1為常數,b為斜率,mR為相對遷移率。將相對分子量的標準蛋白的遷移率對其分子量的對數作圖，可得到一條標準曲線，根據未知蛋白質樣品相對遷移率直接在標準曲線上查出其分子量。實驗材料與用品1、材料:牛血清白蛋白、低分子量標準蛋白(14.4~94.0kD)、吸水紙、浮漂2、試劑：丙稀酰胺、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、IMpH6.8的Tris-HCI緩沖液、1.5MPH8.8的Tris-HCI緩沖液、10%過硫酸鏤、TEMED(N,N,N,N'-四甲基乙二胺)、Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mMTris.250inM甘氨酸(pH8.3)、0.1%SDS).染色液(0.1%考馬斯亮藍R-250、40%甲醇、10%冰醋酸)、脫色液(10%甲醇、10%冰醋酸)、3、儀器：電泳儀，電泳槽裝置、脫色搖床、移液器、恒溫水浴、15cm培養(yǎng)皿、槍頭、1.5ml離心管。實驗步驟組裝玻璃板玻璃洗凈,最后用雙蒸水沖洗、吹干安裝在制膠架上2、SDS聚丙稀酰氨凝膠的灌制(1)依順序加入各組分配制別離膠溶液。注意一旦加入TEMED,馬上開始聚合，故應快速操作。3%別離膠溶液的配制：溶液成分總體積10mL、雙蒸水2.97mL、30%g丙稀酰胺4.33mL>1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5mL、10%SDS0.1mL、10%過硫酸胺0.1mL、TEMED0.004mL(2)在玻璃板的間隙中灌注配制好的別離膠液,留出灌注濃縮膠所需的空間，即在膠面上小心注入一層雙蒸水(約2?3mm)高，以阻止氧氣進入凝膠溶液。⑶待別離膠聚合完全后，傾出覆蓋水層,再用濾紙吸凈殘留水。(4)依順序加入制備濃縮膠。4%濃縮膠溶液的配制：溶液成分總體積5mL、雙蒸水3.56mL、30%g丙稀酰胺0.67mL、1.5Mtris-HCl(pH6.8)0.63mL、10%SDS0.05mL、10%過硫酸胺0.05mL、TEMED0.005mL(5)在聚合的別離膠上直接灌注濃縮膠，至短玻璃板上緣l~2mm處，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心防止混入氣泡,再加入濃縮溶液以充滿梳子之間的空隙,將凝膠垂直放置于室溫下。(6)等待濃縮膠聚合時，可同時對樣品進行處理。以使蛋白質變性。在樣品中按1:1體積比加入樣品處理液,在100℃沸水浴中保溫3min,取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時不用，可放入-20℃冰箱長時間保存，使用前需在100℃沸水中重新加熱3min,以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3、裝槽:濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，注意膠板上短玻璃一面口朝向負極(黑色)，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖、液。設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。4、上樣電泳在制備濃縮膠后,不能進行預電泳，因預電泳會破壞pH環(huán)境,如需要電泳只能在別離膠聚合后,并用別離膠緩沖液進行。預電泳后將別離膠面沖洗干凈,然后才能制備濃縮膠。(1)按預定順序用微量進樣器加樣,加樣量通常為10?20LiLo(2)將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為60V/cmo當染料前沿進入別離膠后，把電壓調到120V/cm,繼續(xù)電泳直至濱酚藍到達別離膠底部上方約1cm然后關閉電源。(3)從電泳裝置上卸下玻璃板,用刮刀勺撬開玻璃。在面對短玻璃板緊靠最左邊一孔凝膠下部切去一角以標注凝膠的方位。5、染色和脫色染色時間:60min(視情況而定)，時間到后倒掉染色液，用去離子水沖洗2次終止染色，將膠塊置于脫色液中。脫色需1?2小時，期間應屢次更換脫色液直至蛋白質帶與背景清晰。脫色后，可將凝膠浸于水中,長期封裝在塑料袋內而不降低染色強度。6、結果與分析(1)繪制標準曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標紙上,量出加樣端距前沿染料中心的距離(cm)以及各蛋白質樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離(cm),計算相對遷移率并繪制標準曲線，以標準蛋白質的相對遷移率為橫坐標，標準蛋白質分子量為縱坐標在半對數坐標紙上作圖,可得到一條標準曲線。根據未知蛋白質樣品相對遷移率直接在標準曲線上查出其分子量?？记绊氈?、在不連續(xù)電泳體系中，預電泳只能在別離膠聚合后進行。洗凈膠面后才制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進行預電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應。2、電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或過低無可影響電泳效果。3、SDS純度:在SDS中，需高純度的SDS,市售化學純SDS需重結晶一次或兩次方可使用。4、用SDS處理蛋白質樣品時,每次都會在沸水溶中保溫3?5min,以免有57亞穩(wěn)聚合物存在。5、標準蛋白質的相對遷移率最好在0.2?0.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測定未知物分子量時,都應同時用標準蛋白制備標準曲線,而不是利用過去的標準曲線。用此法測定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量,而不是完整的分子量。為測得精確的分子量范圍,最好用其他測定蛋白分子量的方法加以校正。此法對球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測定較好,對糖蛋白,膠原蛋白等分子量測定差異較大。6、對樣品的要求:應采納低離子強度的樣品。如樣品中離子強度高，那么應透析或經離子交換除鹽。加樣時，應保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以10?1511L為宜,如樣品系較稀的液體狀,為保證區(qū)帶清晰,加樣量可增加，同時應將樣品溶解液濃