實驗八 培養(yǎng)液及用液配制與消毒課件

實驗八培養(yǎng)液及用液配制與消毒1、培養(yǎng)液種類（medium）血清（FBS，F(xiàn)CS，CS，HS）合成培養(yǎng)基如:EagleMEM、DMEM、PRMI1640、HamF12等無血清培養(yǎng)基（serumfreemedium）一、培養(yǎng)液及用液的種類2、培養(yǎng)用液1）水與平衡鹽溶液培養(yǎng)用水緩沖溶液生理鹽水平衡鹽溶液（BSS）如：PBS、Hank’s、D-Hank’s液二、細胞培養(yǎng)用液的要求及成分水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml細胞生長條件培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1）天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染

細胞生長條件2）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。

細胞生長條件

人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；⑤各種生長因子；⑥轉(zhuǎn)移蛋白；⑦不明成分。細胞生長條件消化液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。

細胞生長條件基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升完全培養(yǎng)基的組成細胞生長條件1、濾器準備清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0．22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20min進行高壓滅菌處理。在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。過濾后要檢查濾膜是否完好無損。2、配制步驟1．準備超純水或三蒸水。2．加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時間(2—4h)使之充分溶解。3．配制RPMll640培養(yǎng)基時應(yīng)通入適量C02或加入6mol／L鹽酸調(diào)pH至6．0左右，這樣才能充分溶解。4．加入一定量NaHCO，調(diào)節(jié)pH至7．0左右。5．加水至最終體積。6．在超凈臺中對溶液進行濾過除菌，分裝入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。7．瓶口封好，4℃冰箱貯存。四注意事項1．過濾時壓力不要太大，以壓力數(shù)字2為宜，否則細菌易濾過達不到除菌效果，或使濾膜破裂。2.分裝時