衛(wèi)生微生物衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法

衛(wèi)生微生物學(xué)第三章衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法第一節(jié)衛(wèi)生微生物檢測的特點及基本原則第三節(jié)衛(wèi)生指示微生物第二節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法第四節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測方法的前景第一節(jié)衛(wèi)生微生物檢測的特點及基本原則

一、衛(wèi)生微生物檢測的特點1．檢測的對象多病原微生物+非致病和條件致病微生物特別是能反映環(huán)境、食品、健康相關(guān)產(chǎn)品等樣品衛(wèi)生質(zhì)量的衛(wèi)生指示微生物。2．檢測的范圍廣標(biāo)本的來源不僅局限于人體，也來源于空氣、水、食品等環(huán)境。3．檢測的方法必須更敏感以檢測環(huán)境標(biāo)本中數(shù)量很低的致病微生物。4．定量測定和分型檢測以探明感染性疾病的傳染源、傳播途徑、流行情況等。二、衛(wèi)生微生物檢測基本原則（一）樣品的采樣原則代表性/針對性與及時性（常規(guī)的監(jiān)測與評價/突發(fā)事件探因）防污染（不能引入新污染）防殺菌/保護目的微生物（抑菌物質(zhì)的存在降低檢出率）細標(biāo)記1.采樣的代表性與針對性（1）影響采樣代表性的因素包括:采樣量采樣部位采樣時間采樣的隨機性和均勻性以及按批號抽樣注意樣品種類

5eg:

GB4789.1－2010中食品安全標(biāo)準(zhǔn)采樣方案（2）二級采樣方案&三級采樣方案關(guān)鍵詞:n,同一批產(chǎn)品應(yīng)采的樣品件數(shù)m,可接受的微生物指標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)c,最大容許超過m值的樣品數(shù)M，微生物指標(biāo)的最高安全限量值。67

2.采樣的其他原則避免采樣時外界微生物對樣品的新污染：所有采樣用具、容器需嚴(yán)格滅菌，并以無菌操作采樣。避免采樣時對微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質(zhì)：如容器是否有消毒劑的殘留，或使用剛燒灼未冷卻的采樣工具。保護目的微生物：使用正確的采樣液或加入中和物質(zhì)。注意對樣品的詳細標(biāo)記：樣品名稱、編號、采樣時間、采樣者、檢測項目。（二）樣品的運送原則

1.盡快送檢采集的樣品，應(yīng)在規(guī)定的時間內(nèi)（一般不超過3~4小時）送到實驗室，盡快送檢。一方面可減少待測微生物的死亡。另一方面可防止微生物的繁殖對計數(shù)結(jié)果的影響溫度調(diào)節(jié)淋病奈瑟球菌防凍死加入保護劑

用于分離病毒的樣品50%甘油緩沖液或由0.5%的水解蛋白+2%小牛血

清+2(或3）抗；

鼠疫桿菌及其他G-可用卡-布半固體（0.067M磷緩處理過的棉箋）；

厭氧菌專用的運用培養(yǎng)基去除其他不利于待測微生物生存的因素

血清檢測注意防溶血2.保護待檢微生物3.生物安全防人員感染：個人防護（？）防標(biāo)本和環(huán)境的污染：無菌操作、恰當(dāng)處理污染廢棄物4.遵循完善的樣品交接制度送往實驗室的樣品，必須附有樣品送檢單，實驗室收到樣品應(yīng)按送檢單逐項核對，檢查樣品是否符合檢驗要求，確證無誤方可簽收待檢。（三）實驗室檢驗原則相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備具有合格的檢驗人員和采用標(biāo)準(zhǔn)或公認(rèn)的方法實驗室質(zhì)量控制根據(jù)衛(wèi)生檢驗的特點采取特殊措施1.實驗環(huán)境要求的一般原則實驗室環(huán)境不應(yīng)影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性工作區(qū)與辦公區(qū)分開工作面積應(yīng)滿足檢驗工作的需要溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應(yīng)符合工作要求整體布局應(yīng)采用單方向工作流程，避免交叉污染一般樣品檢驗：潔凈區(qū)（超凈工作臺或潔凈實驗室）病原微生物分離鑒定：BSL-2

應(yīng)有檢測不同病原菌相應(yīng)的條件和設(shè)備微生物按其是否致病、致病力強弱、危害人體的嚴(yán)重性、傳染性的大小、當(dāng)?shù)厝巳旱拿庖咚健⒂袩o免疫制劑和特效治療藥物等可分成不同的危害等級。在不同生物安全級別實驗室進行

2.具有合格的檢驗人員和采用標(biāo)準(zhǔn)或公認(rèn)的方法

（1）必須經(jīng)常接受專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，掌握檢驗項目的基本原理及技術(shù)方法

技術(shù)質(zhì)量考核：可用幾種基本技術(shù)作考核評價的指標(biāo)。①細菌計數(shù)：可使用分散性和穩(wěn)定性好的枯草菌CMCC（B）63501株制作芽孢懸液。請幾名被試人員用直徑9cm~10cm的普通營養(yǎng)瓊脂平板，作表面涂沫接種計數(shù)，重復(fù)作5次，求平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，以標(biāo)準(zhǔn)差小，和顯微鏡直接計數(shù)折算值接近的為佳。②生化試驗重現(xiàn)性：用銅綠色假單胞菌CMCC（B）1012株，注意結(jié)果的重現(xiàn)性。③模擬樣品檢出考核：選合適的基質(zhì)如奶粉，加入指標(biāo)菌，如普通變形桿菌CMCC（B）49001株?？己饲跋茸黝A(yù)備試驗。指定檢驗方法，確定檢出最小菌數(shù)。然后用最小菌數(shù)的5倍量、10倍量加入模擬基質(zhì)中，進行檢出試驗，從盲檢結(jié)果的正誤進行評定。

（2）采用標(biāo)準(zhǔn)/公認(rèn)的檢驗方法進行檢測凡有國家標(biāo)準(zhǔn)、部頒標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)檢查方法的均按標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗。沒有國家或部頒標(biāo)準(zhǔn)，按上級疾病預(yù)防控制中心的要求，參照共同協(xié)定的方法檢驗。3.加強實驗室質(zhì)量控制儀器設(shè)備的質(zhì)控：

培養(yǎng)基、試劑的質(zhì)量控制：消毒滅菌效果的控制：建立良好的實驗記錄制度：

建立良好的核查、校對制度報告與核查制度

報告結(jié)果的層次、時限；突發(fā)公共衛(wèi)生事件可分初步報告和確診報告兩個層次。4.根據(jù)衛(wèi)生檢驗的特點采取特殊措施做好應(yīng)對突發(fā)事件的準(zhǔn)備如果一個樣品需做多種分析，檢測微生物優(yōu)先樣品處理：均質(zhì)化、乳化后再行稀釋；抑菌物質(zhì)去除；目的菌濃縮

(樣品的處理策略（目的）與方法)微生物的復(fù)蘇

第二節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測的方法

衛(wèi)生微生物樣品特點：

目的菌數(shù)量低

細菌受損

雜菌多數(shù)量低——濃縮細菌受損——復(fù)蘇雜菌多——選擇性增菌和分離

一、樣品處理（一）樣品混勻：液體樣品常通過電動、手搖或敲打震蕩，使之混勻；固體樣品需通過置滅菌乳缽內(nèi)研磨均勻，或于高速組織搗碎機或勻漿器中在少量液體存在下，搗碎混勻后再取樣，或使用商品化的均質(zhì)器混合待檢樣品。

（二）樣品濃縮常用的樣品濃縮方式有沉淀法過濾法吸附法免疫磁珠法1.沉淀法：細菌可通過普通離心機離心沉淀而濃縮，或者通過差速離心，去除雜質(zhì)，收集菌體，達到濃縮的目的。病毒濃縮需采用高速或超速離心機。2.過濾法：是將樣品在負壓或正壓作用下，通過孔徑為0.45μm的濾膜，細菌被阻留在膜上，而達到濃縮的目的。樣品中的病毒可通過膜的靜電吸附濃縮。過濾法不但可濃縮微生物，還可消除樣品中的抑制劑對后續(xù)培養(yǎng)的影響。2022/10/25裴曉方xxpei@253.吸附沉淀法：可分為特異性和非特異性吸附兩類。非特異性吸附如利用加入化學(xué)制劑，形成沉淀，細菌被共沉淀的方法；而特異性吸附則是利用配體與受體的親和力，吸附待檢微生物，如為濃縮檢樣中的流感病毒，利用該病毒具有血凝素，可與紅細胞結(jié)合的特點，將檢品中加入紅細胞吸附病毒，低速離心收集紅細胞，而達到濃縮病毒的目的。4.免疫磁珠法免疫磁珠法(MACS)：免疫磁珠法是2O世紀(jì)80年代出現(xiàn)的技術(shù)方法。1983年Ugelstad提出將免疫磁珠用于細胞分選，1990年，Mihenyi建立了MACS。這一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進行抗原抗體反應(yīng)特異性結(jié)合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細胞吸附于分離柱/試管上，實現(xiàn)陽性細胞分離或陰性細胞的分離。二、損傷菌的復(fù)蘇環(huán)境樣品中的微生物，因經(jīng)受冷、熱、脫水干燥、輻照、高滲透壓或消毒劑的作用，可能引起亞致死性損傷，受損傷的微生物用一般的培養(yǎng)方法不易培養(yǎng)，需預(yù)先進行復(fù)蘇（resuscitation）或修復(fù)（repair）后，才能進行常規(guī)的檢測。修復(fù)的基本方法是在細菌繁殖之前，將其置于無選擇性壓力的培養(yǎng)環(huán)境中，一般降低培養(yǎng)溫度培養(yǎng)一定時間后，再進行常規(guī)檢驗。三、選擇性增菌與分離（一）物理方法：主要通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)的溫度、氣體條件和光照，進行選擇性增菌與分離的方法。（二）化學(xué)方法：利用目的微生物的特定生理功能在分離培養(yǎng)基中加入抑制其他微生物生長和顯示目的微生物的化學(xué)制劑，配制成選擇性鑒別培養(yǎng)基，達到對目的微生物增菌分離的目的。

四、定量計數(shù)方法（一）傾注平板計數(shù)法（二）表面涂布計數(shù)法（三）MPN法：即最可能數(shù)法(mostprobablenumber,MPN)（四）其它方法：包括顯微鏡直接計數(shù)法、比濁計數(shù)法、微菌落快速計數(shù)法、生化方法間接推算微生物量，以及半定量法（semi-quantitativemethod）等。標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法表面涂布法不透明培養(yǎng)基-+菌落生長處瓊脂表面+瓊脂內(nèi)瓊脂表面加樣量1ml0.1ml樣分散方式混勻涂布

（一）&（二）平板計數(shù)法35表面涂布法（SpatulaMethod）傾注平板計數(shù)法表面涂布法做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。典型菌落：紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）上的生長情況（三）最可能數(shù)法（most

probable

number,

MPN）當(dāng)需要對樣品中的某種細菌進行選擇性計數(shù)時，由于樣品中混有其他雜菌，無法采用平板菌落計數(shù)的方法進行計數(shù)，在這種情況下可用MPN法計數(shù)菌落，特別是對菌落數(shù)少的樣品進行選擇性計數(shù)有好處，因為傾注平板法和表面涂布法的樣品量偏少。最常用的MPN法是用多管法對水和食品中的大腸菌群進行計數(shù)，也可用于糞大腸菌群和產(chǎn)氣莢膜梭菌等的計數(shù)。MPN法的精髓表述是“多次稀釋直至無菌”（multiple

dilution

to

extinction）。（四）其他計數(shù)方法舉例顯微計數(shù)法比濁計數(shù)法微菌落快速計數(shù)法準(zhǔn)備PetrifilmTM測試片接種1ml樣本液緩慢蓋上上層膜用壓板輕壓培養(yǎng)基樣本接種結(jié)果紅色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸菌群（四）其他計數(shù)方法舉例GB/T4789.3-2008新增大腸菌群PetrifilmTM測試片法大腸桿菌PetrifilmTM測試片計數(shù)法與大腸菌群PetrifilmTM測試片計數(shù)法方法一致結(jié)果判讀大腸桿菌大腸菌群藍色帶氣泡的菌落紅色帶氣泡的菌落五、分型鑒定的方法噬菌體分型細菌素分型耐藥譜分型血清學(xué)分型質(zhì)粒圖譜分型毒素分型脈沖腸凝膠電泳分型（PulseNet）其他方法微生物鑒定系統(tǒng)免疫核酸雜交PCRG+C含量基因芯片蛋白質(zhì)芯片第三節(jié)指示微生物

indicatormicroorganism是在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測中，用以指示樣品衛(wèi)生狀況及安全性的（非致病）微生物（或細菌）。為什么常常通過檢測指示微生物反映樣品衛(wèi)生安全性？

①致病微生物種類多，檢測方法各異，對樣品的衛(wèi)生安全性作出評價時，不可能分別檢測各種微生物；②致病微生物的數(shù)量少，而檢測方法的靈敏度不高；或者受到檢測量的限制，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果③分離、鑒定致病微生物需時長，不能滿足實際工作的需要④分離、鑒定致病微生物費用高，而且對人員的技術(shù)要求也相對較高選擇指示微生物的總原則數(shù)量大易于檢出檢驗方法簡單、經(jīng)濟、方便有一定的代表性，其數(shù)量變化能反映樣品衛(wèi)生狀況及安全性

四種類型

①菌落總數(shù)（細菌、霉菌和酵母菌數(shù)）②糞便污染指示菌（大腸菌群、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌）③其它指示菌：特定菌、某些致病菌

與人類健康密切的樣品，如直接進口的食品、飲用水，除檢測衛(wèi)生指示微生物外，還要求直接檢測某些致病菌如：沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌④病毒（包括噬菌體）

一、常用的指示微生物

（一）菌落總數(shù)AerobicPlateCount概念：菌落總數(shù)是指被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)、表面積(cm2)或體積(m3)內(nèi)，所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件、一定時間培養(yǎng)后長出的菌落數(shù)量。以菌落形成單位數(shù)（colonyformingunit，cfu）表示。種類：菌落總數(shù)包括細菌菌落總數(shù)、霉菌菌落總數(shù)和酵母菌菌落總數(shù)。

細菌菌落總數(shù)：平板計數(shù)瓊脂（而非原來的營養(yǎng)瓊脂）

霉菌和酵母：傳統(tǒng)的孟加拉紅瓊脂（可用馬玲薯瓊脂）衛(wèi)生學(xué)意義：用于判定檢樣被微生物污染的程度或動態(tài)觀察，也是某些樣品的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)。測定方法：常用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法(standardplate-countingmethod)和表面涂布法（SpatulaMethod

）

（二）糞便污染指示菌①大量存在于人及溫血動物腸道，未被糞便污染的樣品中無此種菌存在；②在外環(huán)境中的抵抗力，包括對消毒劑的抵抗力與腸道致病菌大致相似或稍強；③在外環(huán)境中不繁殖，存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長；④樣品有無受糞便污染，檢出結(jié)果差異顯著；⑤用于水衛(wèi)生指標(biāo)時，對水處理劑的抵抗力不低或略強于腸道致病菌；⑥檢驗方法簡便，易于定量計數(shù)。1.大腸菌群（coliformgroup）：是一群能在35~37C、24小時內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧或兼性厭氧的、革蘭陰性的無芽胞桿菌。是存在于人和溫血動物腸道中的一大群菌。衛(wèi)生微生物檢驗中最重要的指示微生物大腸菌群指示糞便污染主要包括：四個屬的菌埃希氏菌屬(Escherichae)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）根據(jù)生長溫度的差異，將能在35～37C生長的稱為總大腸菌群，而在44～45C仍能生長的大腸菌群稱為耐熱大腸菌群(thermo-tolerantcoliformgroup)或糞大腸菌群（faecalcoliformFc），耐熱大腸菌群的主要成員是埃希氏菌屬（總組成基本同于總大腸菌群，但其他3屬所占比例甚少）。2.大腸埃希菌（Escherichae

coli）普遍存在于人和動物的腸道內(nèi)（新鮮糞便中每克可達109CFU），近年來隨著測定新方法的發(fā)現(xiàn)和建立，大腸埃希菌作為糞便污染的指示菌的應(yīng)用越來越多。利用大腸埃希菌產(chǎn)生的葡萄糖苷酸酶，分解吲哚葡萄糖苷酸，產(chǎn)生有色物質(zhì)，而使菌落顯色，對大腸埃希菌數(shù)進行測定?？偞竽c菌群&大腸埃希菌的衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群在糞便污染檢出中的意義及缺陷；作為糞便污染的指示菌，大腸埃希菌檢出的意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些。大腸菌群的測定方法類型最可能數(shù)法（泊松分布，概率）三步法（初發(fā)酵-假定陽性實驗、分離培養(yǎng)-G染色、證實實驗）

兩步法，2008年食品衛(wèi)生微生物及2010年食品安全GB（假定實驗=初發(fā)酵-月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯LST；證實實驗=復(fù)發(fā)酵實驗-煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB）。平板計數(shù)法濾膜法測試片法（紙片法）大腸菌群的可能數(shù)指100g(或100ml)檢樣內(nèi)所含大腸菌群的最可能數(shù)(MPN)。有時為了更確切地反映糞便污染，用糞大腸菌群作指標(biāo)。是指在44土0.5℃培養(yǎng)24h能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、在蛋白陳水中生長產(chǎn)生靛基質(zhì)的、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌（主要是指大腸桿菌）。大腸桿菌MPN計數(shù)初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵伊紅美藍平板分離培養(yǎng)營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)生化試驗GB/T4789.3-2010大腸菌群MPN計數(shù)初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵3.糞鏈球菌（fecalStreptococcus，F(xiàn)s）

（1）腸球菌屬（Enterococcus），人畜腸道中的正常菌群，數(shù)量較高，但低于大腸桿菌一個數(shù)量級；

（2）糞鏈球菌在動物糞便中所占比例較高，比值大于4.1，人，小于4.1，動物；對酸堿冷熱及含氯消毒劑的抵抗力大于大腸菌群，但在適宜條件水體中的繁殖力卻又低于后者；

（3）測定方法可