植物組培的培養(yǎng)基

關于植物組培的培養(yǎng)基第1頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五目的要求：一、掌握培養(yǎng)基的種類及其特點三、掌握培養(yǎng)基的組成和其適宜劑量二、掌握MS培養(yǎng)基配制四、理解培養(yǎng)基篩選方法第2頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

第一節(jié)培養(yǎng)基的種類和成分

一、培養(yǎng)基種類▼二、培養(yǎng)基成分▼第二節(jié)培養(yǎng)基制備▼一、母液配制和保存二、培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌▼第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇▼一、單因子試驗二、多因子試驗三、逐步增減法四、廣譜實驗法第3頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五一、培養(yǎng)基的種類

1、根據其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)容器中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基。

第4頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

培養(yǎng)基種類

固體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基▲營養(yǎng)分布均勻，生長整齊一致，但通氣性差。通氣性較好，便于操作，但營養(yǎng)分布不均，生長發(fā)育不整齊。二者比較第5頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五2、根據培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程培養(yǎng)基分為：

初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基

外植體：從植物體上取出的用于無菌培養(yǎng)的植物材料。

植物材料：莖尖、莖段、花瓣、葉子、花藥等

第6頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五初代培養(yǎng)：指用來第一次接種從植物體上分離下來的外植體過程。繼代培養(yǎng)：對培養(yǎng)物(包括細胞、組織或其切段)通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進行連續(xù)多代的培養(yǎng)，就稱為繼代培養(yǎng)。第7頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

3、根據其作用不同，培養(yǎng)基分為：

誘導培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基

生根培養(yǎng)基

4、根據其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。

基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎上，根據試驗的不同需要，附加一些物質，如生長調節(jié)物質和其他復雜有機物質等。第8頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

常用培養(yǎng)基種類

MS培養(yǎng)基

B5培養(yǎng)基White培養(yǎng)基

N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基第9頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五★有機成分復雜，它包括了所有的單糖和維生素

用于原生質體培養(yǎng)(包括原生質融合的培養(yǎng))KM-8P培養(yǎng)基特點：第10頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五N6培養(yǎng)基特點：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設計成分簡單KNO3

和(NH4)2SO4含量高廣泛應用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)等

第11頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五White培養(yǎng)基特點：1943年由Ｗhite為培養(yǎng)番茄根尖而設計的。1963年又作了改良，稱作Ｗhite改良培養(yǎng)基。特點：無機鹽含量較低適用：生根培養(yǎng)。第12頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五B5培養(yǎng)基特點：含較低的銨雙子葉植物尤其木本植物組培可選擇

第13頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五MS培養(yǎng)基特點：無機鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。

▲MS培養(yǎng)基是目前應用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機鹽的濃度較高，能保證組織培生長所需的礦物質營養(yǎng)。并且因為離子濃度高，在配制、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡

第14頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

二、

培養(yǎng)基成分

水

植物激素

無機鹽

有機物培養(yǎng)體支持材料

輔助性物質▲第15頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

一、無機鹽▲

氮枝葉生長需要氮素，缺氮老葉先發(fā)黃；氮過量，枝葉過度茂盛。磷

缺磷，植株生長緩慢，老葉暗紫色。鉀

促進花卉生長健壯，增強抗性，莖稈挺拔。缺鉀，葉尖、葉緣枯焦，葉片呈皺曲狀，老葉發(fā)黃或火燒狀。鈷

缺鈷，葉片失綠而卷曲，整個葉片向上彎曲凋枯。第16頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五二、有機物維生素肌醇氨基酸天然復合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物馬鈴薯汁液其它▲第17頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五碳水化合物選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖濃度：2%～3%，胚培養(yǎng)為4%～15%大生產時可用白糖▲第18頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

糖在培養(yǎng)基的作用：1）為細胞提供合成新物質的碳骨架2）為細胞的呼吸代謝提供底物和能量3）維持滲透壓第19頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五種類：

VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、VB3（煙酸）、Vc（抗壞血酸濃度：0.1－1.0mg/L作用：VB1

促愈傷組織產生，提高活力

VB6促根生長

Vc防組織褐變

VB3

與植物代謝和胚的發(fā)育有關系

維生素▲第20頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其種類和濃度不同。肌醇：又稱環(huán)己六醇，在糖類的轉化中起作用

第21頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五名稱分子量溶解性質性質蔗糖342.30溶于水、乙醇無變旋現象山梨糖180.16溶于水甜味與蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有變旋現象，以游離態(tài)或磷酯形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有變旋現象，甜度高于蔗糖鹽酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘油受高溫影響小，可高溫消毒核黃素（VB2）376.37溶于無水乙醇、微溶于水等電點PH=6.0，堿性溶液中易變質，光能加速變質鹽酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇對光、空氣、熱穩(wěn)定是轉氨酶的輔酶鈷胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高溫影響小，可高溫消毒，參與絲氨酸轉變?yōu)楦拾彼徇^程煙酸（VPP）123.11極易溶于水、乙醇對空氣、光、熱、PH值穩(wěn)定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇對空氣溫度穩(wěn)定葉酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH、微溶于水參與生物甲基化作用抗壞血酸（VC）176.12極易溶于水有較強的還原能力，可做抗氧化劑用，參與酪氨酸代謝及色氨酸的羥基化作用肌醇180.16易溶于水植物中廣泛存在，可能與IAA的代謝有關常見糖和維生素及其主要性質第22頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五椰乳：促愈傷組織和細胞培養(yǎng)，用量10－20%，使用注意莖尖大小香蕉泥：用量150－200ml/L，應用在蘭花組培馬鈴薯汁液：用量150－200g/L，使苗壯水解酪蛋白：濃度100－200mg/L，應用在微莖尖培養(yǎng)天然復合物▲第23頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

自然界中，植物激素是植物新陳代謝中產生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細胞分化、生長、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結實、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許多生理生化活動。

在培養(yǎng)基中，其各種成分對培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等。通常，不同植物，或不同品種，甚至同一植物的不同位置對激素的要求有很大的變化，這主要取決于植物的內源激素水平。組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）三、激素第24頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五（一）、激素的種類：1、生長素類：在自然界中，生長素影響莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現象

在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導細胞的分裂和根的分化，誘導愈傷組織）

第25頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

組織培養(yǎng)中常用的生長素：

1二氯苯氧乙酸（2，4－D）

2萘乙酸（NAA）3吲哚乙酸（IAA）

4吲哚－－3－丁酸（IBA）NAA、IAA、IBA被廣泛用于生根，2，4－D有利于愈傷組織的誘導和生長。

IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時間不要太久。

溶解方法：1MNaOH或95％酒精，以前者為好保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第26頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五2、細胞分裂素自然界中，細胞分裂素影響細胞分裂，頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等

組織培養(yǎng)中，細胞分類素主要促進細胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調節(jié)細胞分裂，細胞伸長，細胞分化和器官形成。常用的細胞分裂素有：6－芐氨基嘌呤（6－BA）

激動素（6-糠氨基嘌呤、KT）

玉米素（ZT）

噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）

溶解方法：1MHCL

保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第27頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五3、赤霉素由日本人黑澤1926年發(fā)現。自然界中，赤霉素能夠打破休眠、促進果實成長等效果。雖然已經用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因為它的作用往往是負面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3。在組織培養(yǎng)中與生長素和細胞分裂素相比，赤霉素不太常用，據報道赤霉素能刺激不定胚正常發(fā)育成小植株溶解方法：95％酒精保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解

滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌第28頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五4、脫落酸在自然界中，脫落酸能阻礙發(fā)育、促進老化、形成休眠芽等作用。

經試驗表明，脫落酸有利于胚性愈傷組織形成正常不定芽。

材料的試管保存，加上脫落酸能抑制生長，使繼代培養(yǎng)時間延長。溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第29頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五（二）、常見培養(yǎng)基中植物激素配方類型激素配方再生方式及用途1.無植物激素誘導生根、無性胚、愈傷組織形成2.單加生長素誘導生根、愈傷組織、無性胚、不定芽3.單加細胞分裂素誘導不定芽、側芽增殖、愈傷組織形成4.高生長素低細胞分裂素誘導芽、原球莖增殖、愈傷組織形成5.低生長素高細胞分裂素誘導叢芽、愈傷組織形成6.低生長素低細胞分裂素誘導不定芽、側芽增殖7.等量生長素與細胞分裂素誘導側芽增殖8.加生長抑制劑（多效唑、矮壯素等）壯苗、延緩生長、利于試管苗保存9.加GA3打破種子、芽休眠，促進伸長生長第30頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五名稱分子量溶解性質主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于熱水、乙醇、乙醚、丙酮促進細胞的延伸生長和細胞壁結構的松馳，也可用于誘導生根吲哚丁酸(IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀堿、稀酸液為生根刺激劑

a-萘乙酸(NAA)186.20易溶于熱水、丙酮、醚、乙酸、稀堿液促進細胞生長，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀堿液促進愈傷組織形成赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氫鈉和醋酸鈉的水溶液，其鈉促進莖、葉伸長生長，打破休眠（三）、常見生長調節(jié)劑及主要性能一覽表第31頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五（四）、常見生長調節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的換微摩爾/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173第32頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五四、培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂用量7－10g/L（0.7%-1%）注意：1若濃度過高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質就難于擴散到培養(yǎng)的組織中。

2當進行營養(yǎng)需要研究時，應注意不要使用瓊脂，因為市場供應所有瓊脂含有雜質，特別是含有Ca,Mg和微量元素。2.其它

卡拉膠、玻璃纖維、濾紙橋、海綿等▲第33頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五五、輔助性物質1.抗生素2.抗氧化物3.活性炭▲第34頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

抗生素1.常用種類：青霉素鏈霉素慶大霉素等2.用量：5%－20%3.作用：防止由外植體內生菌造成的污染。4過濾滅菌

▲第35頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

抗氧化物

常用抗氧化劑及使用：

半胱氨酸VC（50－200mg/L液洗滌外植體傷口表面）?；钚蕴?/p>

1.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進新梢增殖（濃度0.1－0.2%）；促進生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。2.常用濃度：0.5－10g/L3.活性炭的作用

①對生長的抑制：其吸附了植物激素②對生長的刺激：其吸附了有抑制作用的物質▲第36頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

第二節(jié)培養(yǎng)基配制一、母液配制與保存二、培養(yǎng)基配制第37頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五(一)母液配制流程圖

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基

溶解

定容

貼標簽保存于冰箱一、母液配制(以MS為例)第38頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

稱量藥品

天平預置全顯示清零稱藥第39頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五(二)母液配制要求：1.母液濃縮倍數：10-100，大量元素10；微量元素、鐵鹽100；有機物50；2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學純試劑3.防止沉淀4.激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100ml5.激素溶解：IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；2，4-D先溶于1MNaOH再加水；

KT、BA先溶于1MHCl再加水。

第40頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五為什么要配制母液？1）方便2）準確（有些成分量太?。?）母液要分類配，否則有些成分混合一起會產生沉淀以MS培養(yǎng)基為例：第41頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五MS培養(yǎng)基母液的配制第42頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五母液保存：在冰箱內

低溫保存第43頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五二、培養(yǎng)基配制移母液調PH值培養(yǎng)基熬制滅菌稱取蔗糖、瓊脂扎口定容分裝二次定容接種確定配方第44頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

大量元素母液

微量元素母液

鐵鹽母液

有機物母液

取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培養(yǎng)基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸進吸氣球里，數量看準，不滴不漏，吹凈為度。移母液第45頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五用自來水定容至1升定容：第46頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五稱取蔗糖、瓊脂用自來水定容到1升取蔗糖25－30g，瓊脂7－8g。第47頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五培養(yǎng)基熬制：3.將容量瓶中剩余的液體一并倒入鋁鍋中，搖晃使均勻。1.將定容好的培養(yǎng)液取1/3倒入鋁鍋中，同時加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。第48頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五用0.1MNaOH或HCl調PH值為6.0。調PH值：第49頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五分裝：趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30－40ml。第50頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五扎口與滅菌:要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應及時滅菌，防止變質。第51頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五

滅菌后，應盡快地轉移培養(yǎng)瓶使其冷卻，一般應將滅菌后的培養(yǎng)基儲藏于30℃以下的室內名，最好儲藏在4－10℃的條件下。應當注意的是，某些生長調節(jié)物質如IAA、ZT、ABA等以及某些維生素是不穩(wěn)定的，不能和其他的培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而要進行過濾滅菌。第52頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇一、單因子試驗二、多因子試驗三、逐步增減法四、廣譜試驗法第53頁，共60頁，2022年，5月20日，2點8分，星期五2種激素5種濃度的實驗組合Ⅰ6－BA（mg/L)A1A2A3A4A5NAA（mg/L)B1B2B4B3B5B1A1B1A2B1A3B1A4B1A5B2A1B2A2B2A3B2A4B2A5B3A1B3A2B3A3B3A4B3A5B4A1B4A2B4A3B4A4B4A5B5A1B5A2B5A3B5A4B5A5第5