急性心肌梗死的臨床生化指標(biāo)及檢測(cè)方法課件

急性心肌梗死的臨床生化指標(biāo)及檢測(cè)方法1急性心肌梗死的臨床生化指標(biāo)及檢測(cè)方法1概述2概述2一、概述心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21世紀(jì)人類健康的頭號(hào)殺手。急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction，AMI)是主要的心血管疾病，全球每年有1700萬人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死。急性心肌梗死既往在歐美常見，美國35~84歲人群中年發(fā)病率男性為71%，女性為22%，每年約有150萬人發(fā)生急性心肌梗死，45萬人發(fā)生再次心肌梗死。在我國，本病雖不如歐美多見，但近10年來，急性心肌梗死的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，目前已接近國際平均水平。3一、概述心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21AMI是指急性心肌缺血性壞死，大多是在冠脈病變的基礎(chǔ)上發(fā)生冠脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血所致。通常原因?yàn)樵诠诿}不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛基礎(chǔ)上繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血管持續(xù)、完全閉塞。AMI發(fā)病突然，急性期死亡率約為30%。對(duì)其早期診斷，以便進(jìn)行及時(shí)有效的治療，是減低急性心肌梗死的死亡率和合并癥、提高患者生存率的關(guān)鍵。4AMI是指急性心肌缺血性壞死，大多是在冠脈病變的基礎(chǔ)上發(fā)生冠診斷AMI的條件有：臨床癥狀、心電圖異常和生化指標(biāo)等。但大約1/3的AMI病人早期臨床癥狀不典型，約1/2的病人心電圖不能出現(xiàn)特征性ST段改變，此時(shí)生化指標(biāo)的改變?cè)贏MI診斷和指導(dǎo)治療中就顯得非常重要.目前，研究人員已基本弄清楚急性心肌梗死患者血清中一些生化指標(biāo)發(fā)生的變化及其規(guī)律。5診斷AMI的條件有：臨床癥狀、心電圖異常和生化指標(biāo)等。5二、診斷AMI的常用生化指標(biāo)肌酸激酶及其同工酶乳酸脫氫酶及其同工酶肌紅蛋白和碳酸酐酶心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白糖原磷酸化酶BB超敏C-反應(yīng)蛋白其他6二、診斷AMI的常用生化指標(biāo)肌酸激酶及其同工酶6㈠、肌酸激酶及其同工酶肌酸激酶（CK）AMI患者血液中CK常在發(fā)病后4~6小時(shí)開始升高，18~24小時(shí)達(dá)峰值，3天左右降至正常。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CK的靈敏度僅為22%，且由于CK并非心肌所特有，在非心臟手術(shù)或骨骼肌、平滑肌損害患者血清中CK也會(huì)升高，所以其特異性仍較差。7㈠、肌酸激酶及其同工酶肌酸激酶（CK）7肌酸激酶同工酶（CK-MB）CK-MB在AMI發(fā)病4~6小時(shí)開始升高，12~24小時(shí)達(dá)高峰，可為正常的20倍，約2天降至正常，對(duì)AMI診斷具有較高的敏感性，其陽性率在90%以上。在相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)，CK-MB被譽(yù)為診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但CK-MB并非心臟所特有的酶，正常人骨骼肌中也有少量CK-MB，且CK-MB診斷時(shí)間窗口短，其敏感性和特異性都不盡如人意。盡管如此。8肌酸激酶同工酶（CK-MB）8㈡、乳酸脫氫酶及其同工酶乳酸脫氫酶（LDH）LDH在AMI發(fā)病后24小時(shí)開始升高，3~4天達(dá)高峰，持續(xù)1~2周消失。影響LDH的因素較多，充血性心力衰竭、腫瘤、骨骼肌疾患等均可使LDH升高。所以，通常不用LDH作為AMI早期診斷指標(biāo)，而適用于診斷病程已超過2~3天的病例。9㈡、乳酸脫氫酶及其同工酶乳酸脫氫酶（LDH）9乳酸脫氫酶同工酶（LDH1

）AMI后LDH1在6~8小時(shí)增高，3~5天達(dá)峰值，持續(xù)7~14天。以LDH1/LDH2≥1和CK-MB≥15IU/L作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其陽性率前者(52.2%)明顯高于后者(30.4%)。隨發(fā)病時(shí)間延長，LDH1/LDH2比值逐漸升高，至24小時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)2周，該比值的陽性率還在95%以上。因此，該比值測(cè)定對(duì)心肌梗死的早期及晚期的診斷均有一定價(jià)值。10乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）10㈢、肌紅蛋白和碳酸酐酶肌紅蛋白（Mb）Mb最早可在梗死后1.5小時(shí)開始升高，5~12小時(shí)達(dá)到高峰，24小時(shí)恢復(fù)正常。Mb的診斷特異性低，因肌肉損傷、腎功能減退以及長期肌注、開胸手術(shù)等因素均可使之升高。Mb對(duì)心肌特異性不高，但Mb是心肌缺血損傷后升高最早的指標(biāo)之一。與CK共同為適合于AMI的早期診斷指標(biāo)，且Mb陰性有助于排除AMI。另外，由于血中Mb能迅速被腎臟清除，所以測(cè)定Mb還有助于觀察AMI病程中有無再梗死發(fā)生，以及梗死有無擴(kuò)展。11㈢、肌紅蛋白和碳酸酐酶肌紅蛋白（Mb）11肌紅蛋白/碳酸酐酶比值（Mb/CAIII）胸痛發(fā)生2小時(shí)內(nèi)，Mb和Mb/CAIII顯示出相當(dāng)高的靈敏性，分別為40%和60%，在2~6小時(shí)內(nèi)，這兩項(xiàng)指標(biāo)的敏感性比CK-MB更高。在骨骼肌損傷時(shí)，Mb和Mb/CAIII均升高，但Mb/CAIII保持恒定，而心肌損傷時(shí)，Mb/CAIII明顯升高。同時(shí)測(cè)定血清Mb和CAIII，用Mb/CAIII比值有利于區(qū)別Mb是來源于心肌還是骨骼肌。測(cè)定Mb/CAIII在AMI診斷中具有較高的靈敏性和特異性，是診斷心肌損傷的早期標(biāo)志物之一。12肌紅蛋白/碳酸酐酶比值（Mb/CAIII）12㈣、心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）血清H-FABP在AMI早期(0~3小時(shí))即可檢測(cè)到。H-FABP自上世紀(jì)90年代起開始作為診斷AMI的早期診斷指標(biāo)，它對(duì)診斷AMI的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率均較高。但目前臨床應(yīng)用還不廣泛，它與肌紅蛋白一樣，缺少對(duì)心臟的特異性。13㈣、心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP㈤、糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶BB（GPBB）GPBB主要存在于心肌細(xì)胞和腦細(xì)胞中，在正常生理?xiàng)l件下，GPBB在心肌細(xì)胞中以GPBB-糖原復(fù)合物的形式與肌漿網(wǎng)緊密結(jié)合。當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)，糖原分解加速消耗，使與之結(jié)合的GPBB由結(jié)合型變?yōu)橛坞x型，心肌細(xì)胞中釋出來。GPBB被認(rèn)為是最為敏感的診斷AMI的指標(biāo)之一，其特異性與CK-MB相似。14㈤、糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶BB（GPBB）14㈥、超敏C-反應(yīng)蛋白C-反應(yīng)蛋白（CRP）C-反應(yīng)蛋白是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，對(duì)疾病的診斷雖無特異性。但其血漿水平上升是各種原因引起的炎癥和組織損傷的靈敏指標(biāo)，且在很長一段時(shí)間可保持穩(wěn)定。HS-CRP可作為心血管危險(xiǎn)事件發(fā)生進(jìn)行的預(yù)測(cè)指標(biāo)。HS-CRP水平3-5mg/L可作為心肌梗死危險(xiǎn)性分級(jí)的較佳臨界點(diǎn)。在冠心病患者中HS-CRP升高提示冠狀動(dòng)脈病變可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。15㈥、超敏C-反應(yīng)蛋白C-反應(yīng)蛋白（CRP）15㈦、其他其他的用于判斷心肌損傷的生化標(biāo)志物還有如門冬氨酸氨基移換酶(CAST)、肌球蛋白重鏈(MHC)和輕鏈(MLC)、肝細(xì)胞生長因子、B型鈉尿肽(BNP)、脫氧核糖核酸酶以及β-羥丁酸脫氫酶等。但由于其特異性或敏感性原因，使得這些心肌損傷標(biāo)志物的臨床應(yīng)用受到了一定的限制。16㈦、其他其他的用于判斷心肌損傷的生化標(biāo)志物還有如門冬氨酸氨基1717從總的趨勢(shì)來看，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)展，心肌損傷的血液生化標(biāo)志物已從早先的以酶活性為主的檢測(cè)（如AST，LD及其同工酶、CK及其同工酶等）發(fā)展到目前的以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為主的檢測(cè)，包括多種早期標(biāo)志物和晚期標(biāo)志物，隨著這些新的靈敏、特異的心肌損傷標(biāo)志物的廣泛應(yīng)用，以酶活性為主的檢測(cè)項(xiàng)目在診斷心臟疾病時(shí)已逐漸少用以至不再應(yīng)用。另外，多種標(biāo)志物的聯(lián)合使用可以使各種標(biāo)志物互為補(bǔ)充，彌補(bǔ)單一標(biāo)志物的某些不足。18從總的趨勢(shì)來看，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)展，心肌損傷的血液生化標(biāo)心肌肌鈣蛋白19心肌肌鈣蛋白19一、概述心肌蛋白(Troponin，Tn)是肌肉組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，與原肌球蛋白(Tropomyosin)和肌動(dòng)蛋白(Actin)結(jié)合構(gòu)成肌原纖維的細(xì)肌絲，參與肌肉的收縮和舒張過程。心肌肌鈣蛋白(CardiacTroponin，cTn)是心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，由三種亞基組成，包括Ca2+結(jié)合亞基-肌鈣蛋白C(TnC)，抑制亞基-肌鈣蛋白I(cTnI)和與原肌球蛋白結(jié)合亞基-肌鈣蛋白T(cTnT)，三種亞基組成復(fù)合體，調(diào)節(jié)肌肉收縮活動(dòng)。20一、概述心肌蛋白(Troponin，Tn)是肌肉組織收縮在心肌細(xì)胞受損后，隨肌原纖維崩解破壞而不斷釋放進(jìn)入血液。其中cTnC不能作為心臟特異性標(biāo)志物，因?yàn)楣趋兰TnC與心肌cTnC的氨基酸序列是完全相同的。而cTnT與cTnI在心肌與骨骼肌中具有獨(dú)特的氨基酸排列，所以心肌中cTnT和cTnI具有心肌特異性，其遠(yuǎn)比CK，CK-MB等酶變化更為敏感，能檢出酶學(xué)方法檢查不出的微小的心肌壞死。肌鈣蛋白是目前為止發(fā)現(xiàn)的輔助診斷心肌損傷的最佳確定標(biāo)志物，21在心肌細(xì)胞受損后，隨肌原纖維崩解破壞而不斷釋放進(jìn)入血液。其中2002年中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)在其公布的“心肌損傷標(biāo)志物的應(yīng)用準(zhǔn)則”中建議:

將心肌肌鈣蛋白(cTnT或cTnI)取代CK-MB成為檢出心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。222002年中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)在其公布的“心肌損傷標(biāo)志物的應(yīng)用二、心肌肌鈣蛋白T心肌肌鈣蛋白T（cTnT）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新的診斷心肌缺血、壞死的高敏感性、高特異性的血清學(xué)指標(biāo)。cTnT參與構(gòu)成心肌調(diào)節(jié)蛋白，其結(jié)合于心肌細(xì)胞收縮器上，分子量為37000D。AMI后2~3小時(shí)cTnT就升高，2~4天達(dá)到峰值，cTnT活性可較正常上限升高數(shù)十至百倍以上，12~14天下降至正常。在AMI后，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，診斷AMI的絕對(duì)敏感窗口在cTnT也較CK、CK-MB寬，其中cTnT為10.5~140小時(shí)，而CK和CK-MB是9~31小時(shí)。鑒于cTnT濃度升高持續(xù)時(shí)間長，其對(duì)長期間診斷，對(duì)回顧性診斷都是非常適宜的指標(biāo)。23二、心肌肌鈣蛋白T心肌肌鈣蛋白T（cTnT）是20世紀(jì)9最近研究發(fā)現(xiàn)，cTnT在骨骼肌損傷、肺部疾病、腎衰竭時(shí)也升高，其心肌特異性較心肌肌鈣蛋白I（cTnI）低。24最近研究發(fā)現(xiàn)，cTnT在骨骼肌損傷、肺部疾病三、心肌肌鈣蛋白I

cTnI是心肌細(xì)胞所特有的一種收縮蛋白，僅存在于心肌收縮蛋白的細(xì)肌絲上，是一種單鏈多膚，分子量為22500D。肌鈣蛋白I(cTnI)含有三個(gè)亞型:快反應(yīng)型、慢反應(yīng)型、心臟特異型。前兩者與骨骼肌相關(guān)，后者僅存在于心肌中。cTnI與骨骼肌Tn的氨基酸序列顯示40%不同源性，且cTnI膚鏈的N端增加了31個(gè)氨基酸，分子量為24。cTnI在胎兒及健康或疾病狀態(tài)的成人骨骼肌中不表達(dá)，因此具有高度心肌特異性，為cTnI作為心肌細(xì)胞損傷的特異性標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。25三、心肌肌鈣蛋白IcTnI是心肌細(xì)胞所特有的一種收縮蛋白，在人心肌組織內(nèi)cTnI的含量約為5mg/g濕重組織。生理狀態(tài)下，cTnI以兩種形式存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，少量cTnI(3%~5%)游離于細(xì)胞漿中以游離形式存在，為可溶性，大部分以結(jié)構(gòu)蛋白形式固定于心肌肌纖維上，為不可溶性。正常人血液中cTnI含量一般低于0.3μg/L，當(dāng)心肌細(xì)胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破壞時(shí)，游離的cTnI可迅速透過細(xì)胞膜進(jìn)入血流，隨著損傷加重，結(jié)合部分的cTnI被分解出來，成為游離的cTnI不斷釋放入血，導(dǎo)致cTnI持續(xù)升高。26在人心肌組織內(nèi)cTnI的含量約為5mg/g濕重組織。生理狀態(tài)四、比較cTnI和cTnT的診斷價(jià)值比較cTnI和cTnT作為早期診斷心肌損傷的價(jià)值：cTnT在出現(xiàn)骨骼肌損傷、腎衰竭等疾病時(shí)也升高，而cTnI分子量較小，正常血中濃度很低，心肌損傷后能快速釋放入血液中，且呈百倍升高，且在血清中持續(xù)性存在;因此，cTnI是目前效率最高的診斷AMI標(biāo)志物。27四、比較cTnI和cTnT的診斷價(jià)值比較cTnI和cTnT作2001年11月美國心臟病學(xué)會(huì)和心臟病協(xié)會(huì)提出測(cè)定cTnI作為診斷AMI和急性冠狀動(dòng)脈綜合癥危險(xiǎn)分層的第一位標(biāo)準(zhǔn)。在人類心肌損傷的診斷中，cTnI已經(jīng)成為“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。282001年11月美國心臟病學(xué)會(huì)和心臟病協(xié)會(huì)提出測(cè)定cTnI作心肌肌鈣蛋白I的測(cè)定方法29心肌肌鈣蛋白I的測(cè)定方法29一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法二、放射免疫法三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)四、膠體金免疫層析法五、免疫比濁法六、金標(biāo)銀染法七、質(zhì)譜分析法八、生物傳感器30一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法二、放射免疫法三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)四、一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法實(shí)驗(yàn)原理：化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLlA)是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物。它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。CLlA是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑（可以是發(fā)光劑或催化劑等）標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記后的抗原和抗體與待測(cè)物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟（如離心分離，洗滌等），然后再加入氧化劑或酶底物，最后以測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度形式測(cè)定待測(cè)物的含量。31一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法實(shí)驗(yàn)原理：31基本類型：化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類:直接標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析、以酶為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和以電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光免疫分析。32基本類型：32實(shí)驗(yàn)材料：待測(cè)血清；ALP-Avidin，Biotin，Sulfo-NHS-Biotin，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液；AMPPD；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)用微量反應(yīng)板；多標(biāo)計(jì)數(shù)儀等；33實(shí)驗(yàn)材料：33生物素-檢測(cè)抗體(Biotin-IgG2)復(fù)合物的制備：①清洗平衡濃縮離心管：以PBST清洗濃縮離心管，在其頂部填充PBST，以5000rpm4℃離心4h。②濃縮抗體、更換支持緩沖液：加入0.5mg待標(biāo)記抗體，以5000rpm離心40min以濃縮抗體，加入4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液1.5mL，以5000rpm離心，重復(fù)1次，加入HEPES緩沖液0.4mL，振蕩混勻。③標(biāo)記生物素：加入0.2mLSulfo-NHS-Biotin，震蕩混勻，室溫反應(yīng)30min。加入含0.5%疊氮鈉的HEPES緩沖液2mL，以5000rpm離心5h，重復(fù)4次，最后將沉淀物以HEPES緩沖液重新懸浮至0.5ml，儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?4生物素-檢測(cè)抗體(Biotin-IgG2)復(fù)合物的制備：34實(shí)驗(yàn)方法：①微量反應(yīng)板孔內(nèi)捕獲抗體的包被和封閉：96孔化學(xué)發(fā)光分析用微量反應(yīng)板孔內(nèi)分別加入一定量10μg/mL的捕獲抗體(IgG1)溶液，置于4℃冰箱中包被過夜;然后以含有0.05%Tween20的Tris-HCl洗滌液(pH7.0)洗滌板孔3次，加入含1%BSA的封閉液于4℃封閉過夜，以Tris-HCl洗滌液洗滌3次，拍干，用保鮮膜包好置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?5實(shí)驗(yàn)方法：35實(shí)驗(yàn)方法：②微量反應(yīng)板孔內(nèi)的免疫反應(yīng)：取已包被IgG1并封閉好的微量反應(yīng)板，于板孔對(duì)應(yīng)位置加入抗原標(biāo)準(zhǔn)或樣品50μL/孔，加入含1:2000稀釋的Biotin-IgG2和1:2000稀釋的ALP-Avidin的混合液50μL/孔，振蕩混勻，37℃溫育60min。36實(shí)驗(yàn)方法：36實(shí)驗(yàn)方法：③化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：取出微量反應(yīng)板，以去離子水清洗板孔6次，拍干殘留水，加入1:50稀釋的AMPPD發(fā)光試劑10μ/孔，37℃溫育10min，然后將反應(yīng)板轉(zhuǎn)移到多標(biāo)計(jì)數(shù)儀中讀取每孔的發(fā)光強(qiáng)度。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品孔的發(fā)光強(qiáng)度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出對(duì)應(yīng)樣品中抗原(cTnI)的含量。37實(shí)驗(yàn)方法：37方法評(píng)價(jià)：①檢測(cè)速度快，整個(gè)測(cè)定周期約75min，比傳統(tǒng)的兩步雙抗體夾心ELISA法快得多。②具有很高的靈敏度，方法檢出限為0.02ng/mL，比傳統(tǒng)的兩步雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)限降低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。③檢測(cè)范圍寬(0.04~36.2ng/mL)，比傳統(tǒng)的兩步雙抗體夾心ELISA法提高近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。38方法評(píng)價(jià)：38方法評(píng)價(jià)：④結(jié)果可靠，與傳統(tǒng)ELISA法的測(cè)定結(jié)果符合性良好。⑤由于具有以上優(yōu)點(diǎn)，該方法有著廣闊的市場(chǎng)推廣應(yīng)用前景。⑥化學(xué)發(fā)光法安全、靈敏、通用性強(qiáng)，是研究和應(yīng)用很廣泛的方法，但相對(duì)ELISA法而言，該方法儀器成本相對(duì)較高。39方法評(píng)價(jià)：39實(shí)驗(yàn)原理：先將待測(cè)血清與一定量的兔抗cTnI抗體混合、37℃孵育。然后加入125I標(biāo)記的cTnI，與待測(cè)血清中的cTnI競(jìng)爭(zhēng)抗cTnI抗體，形成抗原一抗體復(fù)合物。該復(fù)合物與再次加入的猴抗兔IgG結(jié)合形成沉淀。離心除去上清液。測(cè)定沉淀物的放射強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得cTnI的濃度。二、放射免疫法40實(shí)驗(yàn)原理：二、放射免疫法40方法評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)中所用的抗體都為多克隆抗體，因而交叉反應(yīng)多，靈敏度差，測(cè)定低限只能達(dá)到10μg/L，而且檢測(cè)時(shí)間為24-36h，與骨骼肌的交叉反應(yīng)率在STriI濃度為20mg/L時(shí)可達(dá)25%，且操作復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長，同時(shí)，由于存在放射污染的危險(xiǎn)，其臨床應(yīng)用受到限制，因此已經(jīng)基本被其它更安全、簡(jiǎn)便的方法取代。41方法評(píng)價(jià)：41實(shí)驗(yàn)原理：將待檢血清和辣根過氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的多抗混合、37℃孵育。把孵育液加入被cTnI包被的微孔板中。由于包被的cTnI與待檢血清中的cTnI競(jìng)爭(zhēng)多抗，使HRP被間接地固定于微孔板上，通過測(cè)定微孔板中HRP的催化活性，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算cTnI的濃度。三、酶聯(lián)免疫吸附法42實(shí)驗(yàn)原理：三、酶聯(lián)免疫吸附法42方法評(píng)價(jià)：ELISA法是國內(nèi)研究最多的測(cè)定cTnI的方法，該方法靈敏度適中，使用相對(duì)比較簡(jiǎn)便，儀器價(jià)格也不很高，但該方法也存在著許多不足，如測(cè)定周期偏長、靈敏度相對(duì)較低、需要配備特殊的儀器以及專業(yè)的操作人員等。該法最低檢出限為4μg/L，反應(yīng)時(shí)間長達(dá)5~6h。由于測(cè)定中使用了多抗，交叉反應(yīng)仍然無法消除，存在較大的局限性。43方法評(píng)價(jià)：43四、膠體金免疫層析法實(shí)驗(yàn)原理：利用兩個(gè)cTnI單克隆抗體的結(jié)合來檢測(cè)cTnI。當(dāng)血清樣本滴到吸收孔內(nèi)，第一個(gè)被膠體金標(biāo)記的抗體與cTnI結(jié)合形成一個(gè)抗體抗原結(jié)合體。第二個(gè)固定化的cTnI單抗捕捉到這個(gè)結(jié)合體，產(chǎn)生一個(gè)粉紅色的顏色帶，相對(duì)于無結(jié)合體的存在，反應(yīng)圈內(nèi)則沒有色帶。方法評(píng)價(jià)：該法標(biāo)本用量少，簡(jiǎn)便快速，適合于cTnI的床旁檢測(cè)?；谠摲椒ㄩ_發(fā)的檢測(cè)卡，雖可快速完成檢測(cè)，但僅能用于cTnI定性和急性心肌梗死患者的初選，臨床應(yīng)用有一定局限性。44四、膠體金免疫層析法實(shí)驗(yàn)原理：44實(shí)驗(yàn)原理：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物，在增濁劑的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。該法將cTnI與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合，導(dǎo)致相鄰的膠乳顆粒彼此交聯(lián)，進(jìn)而通過比較反應(yīng)前后透射光和散射光改變的程度，達(dá)到測(cè)定目的。方法評(píng)價(jià)：該法靈敏度可達(dá)0.3ng/mL，線性范圍為0～25ng/mL免疫比濁法相關(guān)性好、線性范圍寬、精密度高，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。五、免疫比濁法45實(shí)驗(yàn)原理：五、免疫比濁法45實(shí)驗(yàn)原理：金標(biāo)銀染法是以硝酸纖維膜作為基底，結(jié)合一步法雙單克隆抗體夾心技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、納米金探針技術(shù)以及納米顆粒上的銀染放大技術(shù)建立的一種檢測(cè)cTnI的快速測(cè)定法。方法評(píng)價(jià)：該方法在預(yù)先準(zhǔn)備好膜基底和免疫金探針的情況下，能在40min內(nèi)報(bào)告結(jié)果。檢測(cè)臨界值為0.3ng/mL，線型范圍為0.3～42ng/mL，對(duì)肌紅蛋白、sTnT、sTnI的交叉反應(yīng)非常低，與ELISA法相比符合率為86%。但該方法僅是對(duì)cTnI進(jìn)行的初步探索，尚不成熟。六、金標(biāo)銀染法46實(shí)驗(yàn)原理：六、金標(biāo)銀染法46實(shí)驗(yàn)原理：從心肌組織勻漿中分離、提取肌鈣蛋白，并采用親和色譜法和免疫印跡法等建立肌鈣蛋白肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜圖譜，然后利用質(zhì)譜分析儀檢測(cè)急性心肌梗死患者的血清。結(jié)果表明質(zhì)譜分析法可快速證實(shí)待測(cè)標(biāo)本中是否存在肌鈣蛋白，并可分析出肌鈣蛋白I、T、C三個(gè)亞單位各自所占的比例。方法評(píng)價(jià)：但其只能定性診斷，不能定量，尚需探索研究。該法可用于早期診斷急性心肌梗死，且通過比較證實(shí)飛行質(zhì)譜法的敏感性和特異性均明顯優(yōu)于cTnI快速檢測(cè)法。七、質(zhì)譜分析法47實(shí)驗(yàn)原理：七、質(zhì)譜分析法47實(shí)驗(yàn)原理：待分析物擴(kuò)散進(jìn)入固定化生物敏感膜層，經(jīng)分子識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的換能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號(hào)，再經(jīng)電子線路(檢測(cè)放大器)放大并輸出?？蓸?gòu)建一種表面等離子體子共振傳感裝置，用于檢測(cè)cTnI。方法評(píng)價(jià)：具有一定的臨床開發(fā)價(jià)值。八、生物傳感器48實(shí)驗(yàn)原理：八、生物傳感器48心肌肌鈣蛋白I的臨床意義49心肌肌鈣蛋白I的臨床意義49一、AMI的診斷、預(yù)后和危險(xiǎn)分層在AMI初期，cTnI的敏感性略遜于CK-MB，但CK-MB的心臟特異性及靈敏度較低而且血清半衰期相對(duì)較短。在AMI出現(xiàn)癥狀后4~6小時(shí)cTnI開始升高，15~24小時(shí)達(dá)峰值，持續(xù)6~8天。與傳統(tǒng)的心肌酶CK，CK-MB，LDH相比，cTnI在診治AMI方面有較高的敏感度，在發(fā)病12~72小時(shí)內(nèi)cTnI的敏感度達(dá)90%以上，72~150小時(shí)內(nèi)為70%;在AMI后4天內(nèi)cTnI敏感度為93%~100%。所以，cTnI不僅適于AMI早期診斷，也適于中、晚期診斷，尤其適用于就診時(shí)間晚，心肌酶已正常的AMI患者。50一、AMI的診斷、預(yù)后和危險(xiǎn)分層在AMI初期，cTnI的敏感二、估計(jì)心肌梗死面積AMI后cTnI的釋放主要是心肌細(xì)胞壞死，結(jié)構(gòu)蛋白分解所致，所以cTnI的釋放量與心肌細(xì)胞壞死數(shù)量即心肌梗死面積可能有著較好的相關(guān)關(guān)系。用CK-MB計(jì)算梗死面積已得到病理和臨床證cTnI含量與CK-MB有良好的相關(guān)性，說明cTnI含量越高AMI病人的梗死面積越大。研究表明，cTnI含量與AMI病人的梗死面積呈正相關(guān)，但與梗死部位無明顯相關(guān)性。51二、估計(jì)心肌梗死面積AMI后cTnI的釋放主要是心肌細(xì)胞壞死三、判斷溶栓療效早期冠狀動(dòng)脈再灌注的指示物CK-MB，Mb，cTnT和cTnI在血栓治療成功后的早期動(dòng)力學(xué)比較研究表明，四種標(biāo)志物在溶栓后釋放的早期動(dòng)力學(xué)基本相似，但是cTnT和cTnI在90min的冠狀動(dòng)脈再灌注平均指數(shù)顯著大于CK-MB和Mb。用cTnI，cTnT，CK和CK-MB作為溶栓療效判斷指標(biāo)，其敏感度分別為95%，80%，54%和56%，特異度分別為100%，89%，79%和82%，表明cTnI在判斷溶栓療效中具有較高的臨床指導(dǎo)價(jià)值。52三、判斷溶栓療效早期冠狀動(dòng)脈再灌注的指示物CK-MB，Mb，四、監(jiān)測(cè)心臟手術(shù)造成的心肌損傷已有研究表明，cTnI是冠脈成形術(shù)后微小心肌損傷非常敏感的標(biāo)志物，與支架是否置入無關(guān)。在cTnI不正常的患者中，有38%的患者在支架置入術(shù)后發(fā)生分支閉塞。cTnI對(duì)心臟手術(shù)后早期并發(fā)癥具有預(yù)測(cè)作用，心臟手術(shù)期間明顯的心肌損傷可以使術(shù)后并發(fā)癥發(fā)病率增加10倍。對(duì)心臟手術(shù)患者手術(shù)前后檢測(cè)cTnI平，可及時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌梗死并預(yù)測(cè)患者轉(zhuǎn)歸。冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后心肌梗死的診斷在心臟手術(shù)中有重要作用，cTnI對(duì)術(shù)后微小心肌損傷的預(yù)測(cè)價(jià)值最高。53四、監(jiān)測(cè)心臟手術(shù)造成的心肌損傷已有研究表明，cTnI是冠脈成五、對(duì)病毒性心肌炎的診斷一般應(yīng)用心肌酶譜檢查作為心肌損傷的指標(biāo)，但其敏感性和特異性較差。cTnI僅在心肌特異表達(dá)，而CK-MB，AST，LDH非心肌細(xì)胞所特有，可產(chǎn)生假陽性。因而cTnI作為心肌細(xì)胞受損的敏感而特異的指標(biāo)，在心肌炎早期診斷中具有很好的應(yīng)用價(jià)值。造成cTnI升高早期與病毒損害有關(guān)，病程后期則與機(jī)體的免疫機(jī)制有關(guān)。54五、對(duì)病毒性心肌炎的診斷一般應(yīng)用心肌酶譜檢查作為心肌損傷的指六、其他燒傷患者心肌損傷診斷骨骼肌損傷的鑒別診斷甲狀腺機(jī)能減退病人心肌損傷的診斷血液透析、危重及創(chuàng)傷后病人心肌損傷的診斷藥物作用觀察55六、其他燒傷患者心肌損傷診斷55問題及展望56問題及展望56cTnI作為檢測(cè)心肌損傷高度特異與敏感的指標(biāo)，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、風(fēng)險(xiǎn)分層與療效觀察等方面，且檢測(cè)方法和技術(shù)不斷更新，并日趨完善。但其目前仍面臨一些問題，主要是檢測(cè)方法尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化以及質(zhì)控手段的不完善，使不同檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果缺乏可比性。因此，在抗體的制備、參照物和檢測(cè)試劑等許多方面均需建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。隨著在這方面研究的進(jìn)一步深入，以及抗體制備及標(biāo)記技術(shù)的不斷進(jìn)步，cTnI檢測(cè)會(huì)有更廣泛的研發(fā)及應(yīng)用前景。57cTnI作為檢測(cè)心肌損傷高度特異與敏感的指標(biāo)，已廣泛應(yīng)用于謝謝！58謝謝！58急性心肌梗死的臨床生化指標(biāo)及檢測(cè)方法59急性心肌梗死的臨床生化指標(biāo)及檢測(cè)方法1概述60概述2一、概述心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21世紀(jì)人類健康的頭號(hào)殺手。急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction，AMI)是主要的心血管疾病，全球每年有1700萬人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死。急性心肌梗死既往在歐美常見，美國35~84歲人群中年發(fā)病率男性為71%，女性為22%，每年約有150萬人發(fā)生急性心肌梗死，45萬人發(fā)生再次心肌梗死。在我國，本病雖不如歐美多見，但近10年來，急性心肌梗死的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，目前已接近國際平均水平。61一、概述心血管疾病是危害人類健康及生命的嚴(yán)重疾病，已成為21AMI是指急性心肌缺血性壞死，大多是在冠脈病變的基礎(chǔ)上發(fā)生冠脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血所致。通常原因?yàn)樵诠诿}不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛基礎(chǔ)上繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血管持續(xù)、完全閉塞。AMI發(fā)病突然，急性期死亡率約為30%。對(duì)其早期診斷，以便進(jìn)行及時(shí)有效的治療，是減低急性心肌梗死的死亡率和合并癥、提高患者生存率的關(guān)鍵。62AMI是指急性心肌缺血性壞死，大多是在冠脈病變的基礎(chǔ)上發(fā)生冠診斷AMI的條件有：臨床癥狀、心電圖異常和生化指標(biāo)等。但大約1/3的AMI病人早期臨床癥狀不典型，約1/2的病人心電圖不能出現(xiàn)特征性ST段改變，此時(shí)生化指標(biāo)的改變?cè)贏MI診斷和指導(dǎo)治療中就顯得非常重要.目前，研究人員已基本弄清楚急性心肌梗死患者血清中一些生化指標(biāo)發(fā)生的變化及其規(guī)律。63診斷AMI的條件有：臨床癥狀、心電圖異常和生化指標(biāo)等。5二、診斷AMI的常用生化指標(biāo)肌酸激酶及其同工酶乳酸脫氫酶及其同工酶肌紅蛋白和碳酸酐酶心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白糖原磷酸化酶BB超敏C-反應(yīng)蛋白其他64二、診斷AMI的常用生化指標(biāo)肌酸激酶及其同工酶6㈠、肌酸激酶及其同工酶肌酸激酶（CK）AMI患者血液中CK常在發(fā)病后4~6小時(shí)開始升高，18~24小時(shí)達(dá)峰值，3天左右降至正常。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CK的靈敏度僅為22%，且由于CK并非心肌所特有，在非心臟手術(shù)或骨骼肌、平滑肌損害患者血清中CK也會(huì)升高，所以其特異性仍較差。65㈠、肌酸激酶及其同工酶肌酸激酶（CK）7肌酸激酶同工酶（CK-MB）CK-MB在AMI發(fā)病4~6小時(shí)開始升高，12~24小時(shí)達(dá)高峰，可為正常的20倍，約2天降至正常，對(duì)AMI診斷具有較高的敏感性，其陽性率在90%以上。在相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)，CK-MB被譽(yù)為診斷AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但CK-MB并非心臟所特有的酶，正常人骨骼肌中也有少量CK-MB，且CK-MB診斷時(shí)間窗口短，其敏感性和特異性都不盡如人意。盡管如此。66肌酸激酶同工酶（CK-MB）8㈡、乳酸脫氫酶及其同工酶乳酸脫氫酶（LDH）LDH在AMI發(fā)病后24小時(shí)開始升高，3~4天達(dá)高峰，持續(xù)1~2周消失。影響LDH的因素較多，充血性心力衰竭、腫瘤、骨骼肌疾患等均可使LDH升高。所以，通常不用LDH作為AMI早期診斷指標(biāo)，而適用于診斷病程已超過2~3天的病例。67㈡、乳酸脫氫酶及其同工酶乳酸脫氫酶（LDH）9乳酸脫氫酶同工酶（LDH1

）AMI后LDH1在6~8小時(shí)增高，3~5天達(dá)峰值，持續(xù)7~14天。以LDH1/LDH2≥1和CK-MB≥15IU/L作為AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其陽性率前者(52.2%)明顯高于后者(30.4%)。隨發(fā)病時(shí)間延長，LDH1/LDH2比值逐漸升高，至24小時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)2周，該比值的陽性率還在95%以上。因此，該比值測(cè)定對(duì)心肌梗死的早期及晚期的診斷均有一定價(jià)值。68乳酸脫氫酶同工酶（LDH1）10㈢、肌紅蛋白和碳酸酐酶肌紅蛋白（Mb）Mb最早可在梗死后1.5小時(shí)開始升高，5~12小時(shí)達(dá)到高峰，24小時(shí)恢復(fù)正常。Mb的診斷特異性低，因肌肉損傷、腎功能減退以及長期肌注、開胸手術(shù)等因素均可使之升高。Mb對(duì)心肌特異性不高，但Mb是心肌缺血損傷后升高最早的指標(biāo)之一。與CK共同為適合于AMI的早期診斷指標(biāo)，且Mb陰性有助于排除AMI。另外，由于血中Mb能迅速被腎臟清除，所以測(cè)定Mb還有助于觀察AMI病程中有無再梗死發(fā)生，以及梗死有無擴(kuò)展。69㈢、肌紅蛋白和碳酸酐酶肌紅蛋白（Mb）11肌紅蛋白/碳酸酐酶比值（Mb/CAIII）胸痛發(fā)生2小時(shí)內(nèi)，Mb和Mb/CAIII顯示出相當(dāng)高的靈敏性，分別為40%和60%，在2~6小時(shí)內(nèi)，這兩項(xiàng)指標(biāo)的敏感性比CK-MB更高。在骨骼肌損傷時(shí)，Mb和Mb/CAIII均升高，但Mb/CAIII保持恒定，而心肌損傷時(shí)，Mb/CAIII明顯升高。同時(shí)測(cè)定血清Mb和CAIII，用Mb/CAIII比值有利于區(qū)別Mb是來源于心肌還是骨骼肌。測(cè)定Mb/CAIII在AMI診斷中具有較高的靈敏性和特異性，是診斷心肌損傷的早期標(biāo)志物之一。70肌紅蛋白/碳酸酐酶比值（Mb/CAIII）12㈣、心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）血清H-FABP在AMI早期(0~3小時(shí))即可檢測(cè)到。H-FABP自上世紀(jì)90年代起開始作為診斷AMI的早期診斷指標(biāo)，它對(duì)診斷AMI的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率均較高。但目前臨床應(yīng)用還不廣泛，它與肌紅蛋白一樣，缺少對(duì)心臟的特異性。71㈣、心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP㈤、糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶BB（GPBB）GPBB主要存在于心肌細(xì)胞和腦細(xì)胞中，在正常生理?xiàng)l件下，GPBB在心肌細(xì)胞中以GPBB-糖原復(fù)合物的形式與肌漿網(wǎng)緊密結(jié)合。當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí)，糖原分解加速消耗，使與之結(jié)合的GPBB由結(jié)合型變?yōu)橛坞x型，心肌細(xì)胞中釋出來。GPBB被認(rèn)為是最為敏感的診斷AMI的指標(biāo)之一，其特異性與CK-MB相似。72㈤、糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶BB（GPBB）14㈥、超敏C-反應(yīng)蛋白C-反應(yīng)蛋白（CRP）C-反應(yīng)蛋白是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，對(duì)疾病的診斷雖無特異性。但其血漿水平上升是各種原因引起的炎癥和組織損傷的靈敏指標(biāo)，且在很長一段時(shí)間可保持穩(wěn)定。HS-CRP可作為心血管危險(xiǎn)事件發(fā)生進(jìn)行的預(yù)測(cè)指標(biāo)。HS-CRP水平3-5mg/L可作為心肌梗死危險(xiǎn)性分級(jí)的較佳臨界點(diǎn)。在冠心病患者中HS-CRP升高提示冠狀動(dòng)脈病變可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。73㈥、超敏C-反應(yīng)蛋白C-反應(yīng)蛋白（CRP）15㈦、其他其他的用于判斷心肌損傷的生化標(biāo)志物還有如門冬氨酸氨基移換酶(CAST)、肌球蛋白重鏈(MHC)和輕鏈(MLC)、肝細(xì)胞生長因子、B型鈉尿肽(BNP)、脫氧核糖核酸酶以及β-羥丁酸脫氫酶等。但由于其特異性或敏感性原因，使得這些心肌損傷標(biāo)志物的臨床應(yīng)用受到了一定的限制。74㈦、其他其他的用于判斷心肌損傷的生化標(biāo)志物還有如門冬氨酸氨基7517從總的趨勢(shì)來看，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)展，心肌損傷的血液生化標(biāo)志物已從早先的以酶活性為主的檢測(cè)（如AST，LD及其同工酶、CK及其同工酶等）發(fā)展到目前的以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為主的檢測(cè)，包括多種早期標(biāo)志物和晚期標(biāo)志物，隨著這些新的靈敏、特異的心肌損傷標(biāo)志物的廣泛應(yīng)用，以酶活性為主的檢測(cè)項(xiàng)目在診斷心臟疾病時(shí)已逐漸少用以至不再應(yīng)用。另外，多種標(biāo)志物的聯(lián)合使用可以使各種標(biāo)志物互為補(bǔ)充，彌補(bǔ)單一標(biāo)志物的某些不足。76從總的趨勢(shì)來看，隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的進(jìn)展，心肌損傷的血液生化標(biāo)心肌肌鈣蛋白77心肌肌鈣蛋白19一、概述心肌蛋白(Troponin，Tn)是肌肉組織收縮的調(diào)節(jié)蛋白，與原肌球蛋白(Tropomyosin)和肌動(dòng)蛋白(Actin)結(jié)合構(gòu)成肌原纖維的細(xì)肌絲，參與肌肉的收縮和舒張過程。心肌肌鈣蛋白(CardiacTroponin，cTn)是心肌細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，由三種亞基組成，包括Ca2+結(jié)合亞基-肌鈣蛋白C(TnC)，抑制亞基-肌鈣蛋白I(cTnI)和與原肌球蛋白結(jié)合亞基-肌鈣蛋白T(cTnT)，三種亞基組成復(fù)合體，調(diào)節(jié)肌肉收縮活動(dòng)。78一、概述心肌蛋白(Troponin，Tn)是肌肉組織收縮在心肌細(xì)胞受損后，隨肌原纖維崩解破壞而不斷釋放進(jìn)入血液。其中cTnC不能作為心臟特異性標(biāo)志物，因?yàn)楣趋兰TnC與心肌cTnC的氨基酸序列是完全相同的。而cTnT與cTnI在心肌與骨骼肌中具有獨(dú)特的氨基酸排列，所以心肌中cTnT和cTnI具有心肌特異性，其遠(yuǎn)比CK，CK-MB等酶變化更為敏感，能檢出酶學(xué)方法檢查不出的微小的心肌壞死。肌鈣蛋白是目前為止發(fā)現(xiàn)的輔助診斷心肌損傷的最佳確定標(biāo)志物，79在心肌細(xì)胞受損后，隨肌原纖維崩解破壞而不斷釋放進(jìn)入血液。其中2002年中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)在其公布的“心肌損傷標(biāo)志物的應(yīng)用準(zhǔn)則”中建議:

將心肌肌鈣蛋白(cTnT或cTnI)取代CK-MB成為檢出心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。802002年中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)在其公布的“心肌損傷標(biāo)志物的應(yīng)用二、心肌肌鈣蛋白T心肌肌鈣蛋白T（cTnT）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新的診斷心肌缺血、壞死的高敏感性、高特異性的血清學(xué)指標(biāo)。cTnT參與構(gòu)成心肌調(diào)節(jié)蛋白，其結(jié)合于心肌細(xì)胞收縮器上，分子量為37000D。AMI后2~3小時(shí)cTnT就升高，2~4天達(dá)到峰值，cTnT活性可較正常上限升高數(shù)十至百倍以上，12~14天下降至正常。在AMI后，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，診斷AMI的絕對(duì)敏感窗口在cTnT也較CK、CK-MB寬，其中cTnT為10.5~140小時(shí)，而CK和CK-MB是9~31小時(shí)。鑒于cTnT濃度升高持續(xù)時(shí)間長，其對(duì)長期間診斷，對(duì)回顧性診斷都是非常適宜的指標(biāo)。81二、心肌肌鈣蛋白T心肌肌鈣蛋白T（cTnT）是20世紀(jì)9最近研究發(fā)現(xiàn)，cTnT在骨骼肌損傷、肺部疾病、腎衰竭時(shí)也升高，其心肌特異性較心肌肌鈣蛋白I（cTnI）低。82最近研究發(fā)現(xiàn)，cTnT在骨骼肌損傷、肺部疾病三、心肌肌鈣蛋白I

cTnI是心肌細(xì)胞所特有的一種收縮蛋白，僅存在于心肌收縮蛋白的細(xì)肌絲上，是一種單鏈多膚，分子量為22500D。肌鈣蛋白I(cTnI)含有三個(gè)亞型:快反應(yīng)型、慢反應(yīng)型、心臟特異型。前兩者與骨骼肌相關(guān)，后者僅存在于心肌中。cTnI與骨骼肌Tn的氨基酸序列顯示40%不同源性，且cTnI膚鏈的N端增加了31個(gè)氨基酸，分子量為24。cTnI在胎兒及健康或疾病狀態(tài)的成人骨骼肌中不表達(dá)，因此具有高度心肌特異性，為cTnI作為心肌細(xì)胞損傷的特異性標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。83三、心肌肌鈣蛋白IcTnI是心肌細(xì)胞所特有的一種收縮蛋白，在人心肌組織內(nèi)cTnI的含量約為5mg/g濕重組織。生理狀態(tài)下，cTnI以兩種形式存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，少量cTnI(3%~5%)游離于細(xì)胞漿中以游離形式存在，為可溶性，大部分以結(jié)構(gòu)蛋白形式固定于心肌肌纖維上，為不可溶性。正常人血液中cTnI含量一般低于0.3μg/L，當(dāng)心肌細(xì)胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破壞時(shí)，游離的cTnI可迅速透過細(xì)胞膜進(jìn)入血流，隨著損傷加重，結(jié)合部分的cTnI被分解出來，成為游離的cTnI不斷釋放入血，導(dǎo)致cTnI持續(xù)升高。84在人心肌組織內(nèi)cTnI的含量約為5mg/g濕重組織。生理狀態(tài)四、比較cTnI和cTnT的診斷價(jià)值比較cTnI和cTnT作為早期診斷心肌損傷的價(jià)值：cTnT在出現(xiàn)骨骼肌損傷、腎衰竭等疾病時(shí)也升高，而cTnI分子量較小，正常血中濃度很低，心肌損傷后能快速釋放入血液中，且呈百倍升高，且在血清中持續(xù)性存在;因此，cTnI是目前效率最高的診斷AMI標(biāo)志物。85四、比較cTnI和cTnT的診斷價(jià)值比較cTnI和cTnT作2001年11月美國心臟病學(xué)會(huì)和心臟病協(xié)會(huì)提出測(cè)定cTnI作為診斷AMI和急性冠狀動(dòng)脈綜合癥危險(xiǎn)分層的第一位標(biāo)準(zhǔn)。在人類心肌損傷的診斷中，cTnI已經(jīng)成為“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。862001年11月美國心臟病學(xué)會(huì)和心臟病協(xié)會(huì)提出測(cè)定cTnI作心肌肌鈣蛋白I的測(cè)定方法87心肌肌鈣蛋白I的測(cè)定方法29一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法二、放射免疫法三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)四、膠體金免疫層析法五、免疫比濁法六、金標(biāo)銀染法七、質(zhì)譜分析法八、生物傳感器88一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法二、放射免疫法三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)四、一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法實(shí)驗(yàn)原理：化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLlA)是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物。它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。CLlA是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑（可以是發(fā)光劑或催化劑等）標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記后的抗原和抗體與待測(cè)物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟（如離心分離，洗滌等），然后再加入氧化劑或酶底物，最后以測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度形式測(cè)定待測(cè)物的含量。89一、化學(xué)發(fā)光免疫分析法實(shí)驗(yàn)原理：31基本類型：化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類:直接標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析、以酶為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和以電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為標(biāo)記物的電化學(xué)發(fā)光免疫分析。90基本類型：32實(shí)驗(yàn)材料：待測(cè)血清；ALP-Avidin，Biotin，Sulfo-NHS-Biotin，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液；AMPPD；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)用微量反應(yīng)板；多標(biāo)計(jì)數(shù)儀等；91實(shí)驗(yàn)材料：33生物素-檢測(cè)抗體(Biotin-IgG2)復(fù)合物的制備：①清洗平衡濃縮離心管：以PBST清洗濃縮離心管，在其頂部填充PBST，以5000rpm4℃離心4h。②濃縮抗體、更換支持緩沖液：加入0.5mg待標(biāo)記抗體，以5000rpm離心40min以濃縮抗體，加入4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液1.5mL，以5000rpm離心，重復(fù)1次，加入HEPES緩沖液0.4mL，振蕩混勻。③標(biāo)記生物素：加入0.2mLSulfo-NHS-Biotin，震蕩混勻，室溫反應(yīng)30min。加入含0.5%疊氮鈉的HEPES緩沖液2mL，以5000rpm離心5h，重復(fù)4次，最后將沉淀物以HEPES緩沖液重新懸浮至0.5ml，儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?2生物素-檢測(cè)抗體(Biotin-IgG2)復(fù)合物的制備：34實(shí)驗(yàn)方法：①微量反應(yīng)板孔內(nèi)捕獲抗體的包被和封閉：96孔化學(xué)發(fā)光分析用微量反應(yīng)板孔內(nèi)分別加入一定量10μg/mL的捕獲抗體(IgG1)溶液，置于4℃冰箱中包被過夜;然后以含有0.05%Tween20的Tris-HCl洗滌液(pH7.0)洗滌板孔3次，加入含1%BSA的封閉液于4℃封閉過夜，以Tris-HCl洗滌液洗滌3次，拍干，用保鮮膜包好置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?3實(shí)驗(yàn)方法：35實(shí)驗(yàn)方法：②微量反應(yīng)板孔內(nèi)的免疫反應(yīng)：取已包被IgG1并封閉好的微量反應(yīng)板，于板孔對(duì)應(yīng)位置加入抗原標(biāo)準(zhǔn)或樣品50μL/孔，加入含1:2000稀釋的Biotin-IgG2和1:2000稀釋的ALP-Avidin的混合液50μL/孔，振蕩混勻，37℃溫育60min。94實(shí)驗(yàn)方法：36實(shí)驗(yàn)方法：③化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：取出微量反應(yīng)板，以去離子水清洗板孔6次，拍干殘留水，加入1:50稀釋的AMPPD發(fā)光試劑10μ/孔，37℃溫育10min，然后將反應(yīng)板轉(zhuǎn)移到多標(biāo)計(jì)數(shù)儀中讀取每孔的發(fā)光強(qiáng)度。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品孔的發(fā)光強(qiáng)度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出對(duì)應(yīng)樣品中抗原(cTnI)的含量。95實(shí)驗(yàn)方法：37方法評(píng)價(jià)：①檢測(cè)速度快，整個(gè)測(cè)定周期約75min，比傳統(tǒng)的兩步雙抗體夾心ELISA法快得多。②具有很高的靈敏度，方法檢出限為0.02ng/mL，比傳統(tǒng)的兩步雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)限降低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。③檢測(cè)范圍寬(0.04~36.2ng/mL)，比傳統(tǒng)的兩步雙抗體夾心ELISA法提高近兩個(gè)數(shù)量級(jí)。96方法評(píng)價(jià)：38方法評(píng)價(jià)：④結(jié)果可靠，與傳統(tǒng)ELISA法的測(cè)定結(jié)果符合性良好。⑤由于具有以上優(yōu)點(diǎn)，該方法有著廣闊的市場(chǎng)推廣應(yīng)用前景。⑥化學(xué)發(fā)光法安全、靈敏、通用性強(qiáng)，是研究和應(yīng)用很廣泛的方法，但相對(duì)ELISA法而言，該方法儀器成本相對(duì)較高。97方法評(píng)價(jià)：39實(shí)驗(yàn)原理：先將待測(cè)血清與一定量的兔抗cTnI抗體混合、37℃孵育。然后加入125I標(biāo)記的cTnI，與待測(cè)血清中的cTnI競(jìng)爭(zhēng)抗cTnI抗體，形成抗原一抗體復(fù)合物。該復(fù)合物與再次加入的猴抗兔IgG結(jié)合形成沉淀。離心除去上清液。測(cè)定沉淀物的放射強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得cTnI的濃度。二、放射免疫法98實(shí)驗(yàn)原理：二、放射免疫法40方法評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)中所用的抗體都為多克隆抗體，因而交叉反應(yīng)多，靈敏度差，測(cè)定低限只能達(dá)到10μg/L，而且檢測(cè)時(shí)間為24-36h，與骨骼肌的交叉反應(yīng)率在STriI濃度為20mg/L時(shí)可達(dá)25%，且操作復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間長，同時(shí)，由于存在放射污染的危險(xiǎn)，其臨床應(yīng)用受到限制，因此已經(jīng)基本被其它更安全、簡(jiǎn)便的方法取代。99方法評(píng)價(jià)：41實(shí)驗(yàn)原理：將待檢血清和辣根過氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的多抗混合、37℃孵育。把孵育液加入被cTnI包被的微孔板中。由于包被的cTnI與待檢血清中的cTnI競(jìng)爭(zhēng)多抗，使HRP被間接地固定于微孔板上，通過測(cè)定微孔板中HRP的催化活性，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算cTnI的濃度。三、酶聯(lián)免疫吸附法100實(shí)驗(yàn)原理：三、酶聯(lián)免疫吸附法42方法評(píng)價(jià)：ELISA法是國內(nèi)研究最多的測(cè)定cTnI的方法，該方法靈敏度適中，使用相對(duì)比較簡(jiǎn)便，儀器價(jià)格也不很高，但該方法也存在著許多不足，如測(cè)定周期偏長、靈敏度相對(duì)較低、需要配備特殊的儀器以及專業(yè)的操作人員等。該法最低檢出限為4μg/L，反應(yīng)時(shí)間長達(dá)5~6h。由于測(cè)定中使用了多抗，交叉反應(yīng)仍然無法消除，存在較大的局限性。101方法評(píng)價(jià)：43四、膠體金免疫層析法實(shí)驗(yàn)原理：利用兩個(gè)cTnI單克隆抗體的結(jié)合來檢測(cè)cTnI。當(dāng)血清樣本滴到吸收孔內(nèi)，第一個(gè)被膠體金標(biāo)記的抗體與cTnI結(jié)合形成一個(gè)抗體抗原結(jié)合體。第二個(gè)固定化的cTnI單抗捕捉到這個(gè)結(jié)合體，產(chǎn)生一個(gè)粉紅色的顏色帶，相對(duì)于無結(jié)合體的存在，反應(yīng)圈內(nèi)則沒有色帶。方法評(píng)價(jià)：該法標(biāo)本用量少，簡(jiǎn)便快速，適合于cTnI的床旁檢測(cè)?；谠摲椒ㄩ_發(fā)的檢測(cè)卡，雖可快速完成檢測(cè)，但僅能用于cTnI定性和急性心肌梗死患者的初選，臨床應(yīng)用有一定局限性。102四、膠體金免疫層析法實(shí)驗(yàn)原理：44實(shí)驗(yàn)原理：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物，在增濁劑的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。該法將cTnI與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合，導(dǎo)致相鄰的膠乳顆粒彼此交聯(lián)，進(jìn)而通過比較反應(yīng)前后透射光和散射光改變的程度，達(dá)到測(cè)定目的。方法評(píng)價(jià)：該法靈敏度可達(dá)0.3ng/mL，線性范圍為0～25ng/mL免疫比濁法相關(guān)性好、線性范圍寬、精密度高，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。五、免疫比濁法103實(shí)驗(yàn)原理：五、免疫比濁法45實(shí)驗(yàn)原理：金標(biāo)銀染法是以硝酸纖維膜作為基底，結(jié)合一步法雙單克隆抗體夾心技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、納米金探針技術(shù)以及納米顆粒上的銀染放大技術(shù)建立的一種檢測(cè)cTnI的快速測(cè)定法。方法評(píng)價(jià)：該方法在預(yù)先準(zhǔn)備好膜基底和免疫金探針的情況下，能在40min內(nèi)報(bào)告結(jié)果。檢測(cè)臨界值為0.3ng/mL，線型范圍為0.3～42ng/mL，對(duì)肌紅蛋白、sTnT、sTnI的交叉反應(yīng)非常低，與ELISA法相比符合率為86%。但該方法僅是對(duì)cTnI進(jìn)行的初步探索，尚不成熟。六、金標(biāo)銀染法10