2 編制說明-植物源性食品中甜菜堿的測(cè)定 高效液相色譜法

《植物源性食品中甜菜堿的測(cè)定高效液相色譜法》農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)編制說明起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所負(fù)責(zé)人：朱大洲聯(lián)系電話箱：zhudazhou@工作簡(jiǎn)況，包括任務(wù)來(lái)源、協(xié)作單位、主要工作過程、標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作等；（一）任務(wù)來(lái)源根據(jù)農(nóng)質(zhì)標(biāo)函〔2020〕128號(hào)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管司關(guān)于下達(dá)2020年農(nóng)業(yè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知（2020年7月31日印發(fā)）,由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所主持承擔(dān)《植物源性食品中甜菜堿的測(cè)定高效液相色譜法》的制定（項(xiàng)目編號(hào)：HYB-20143），承擔(dān)方法建立、方法驗(yàn)證及相關(guān)起草工作。（二）主要起草單位農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所等。（三）編寫人員與分工表1.主要起草人員信息及任務(wù)分工姓名單位職稱專業(yè)特長(zhǎng)及分工（四）主要工作過程（應(yīng)包含起草、征求意基本意見、送審等環(huán)節(jié)的時(shí)間及具體情況。）編制組依據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)與編寫規(guī)則》和GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫與規(guī)則第四部分：化學(xué)分析方法》，參照GB/T5009.1《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)制定工作。主要工作過程如下：2020年7-10月份，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草小組，負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)起草、驗(yàn)證、組織專家研討等工作；完成資料收集、整理工作，在參考國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)植物源性食品中甜菜堿化合物的測(cè)定高效液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化。開展方法重現(xiàn)性、靈敏度、檢出限、分離度、準(zhǔn)確度、線性關(guān)系等技術(shù)內(nèi)容的確定研究。2020年11月-2021年6月，完成液相條件和前處理?xiàng)l件優(yōu)化，確定最佳前處理方法。檢驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)摸索研究，起草出方法初稿，討論、驗(yàn)證與修改。2021年7月-2021年2月，收集有代表性的樣品，分析檢測(cè)，以驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的適用性。編制《植物源性食品中甜菜堿高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)），修訂標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)增列新舊標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比；（一）標(biāo)準(zhǔn)編制依據(jù)和原則本標(biāo)準(zhǔn)的編寫制定過程中以提高方法選擇性、精密度、靈敏度、準(zhǔn)確度和分析效率，降低分析成本為總原則。力求反映科學(xué)技術(shù)的先進(jìn)成果和先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，使用性能的普遍性，包括方法精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度等方面能滿足要求，確保標(biāo)準(zhǔn)既保持技術(shù)上的先進(jìn)性，又具有經(jīng)濟(jì)上的合理性。遵循了標(biāo)準(zhǔn)制定過程中的先進(jìn)性、經(jīng)濟(jì)性和適用性原則。在標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中嚴(yán)格遵循國(guó)家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，嚴(yán)格執(zhí)行強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。在GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》和GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的指導(dǎo)下，與同體系標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)以及配套使用的取樣、試劑規(guī)格等標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循了政策協(xié)調(diào)統(tǒng)一性原則。在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中力求做到：技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無(wú)誤；文字表達(dá)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)明、易懂，標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)合理，內(nèi)容編排、層次劃分等符合邏輯與規(guī)定。（二）標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容通過查閱文獻(xiàn)、專利和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，明確了植物源食品中甜菜堿的定量測(cè)定主要技術(shù)方法等，通過系統(tǒng)研究確定甜菜堿化合物的高效液相色譜測(cè)定方法，主要內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)適用范圍、規(guī)范性引用文件、原理、試劑、儀器設(shè)備、分析步驟、分析結(jié)果的表述等。首先確定甜菜堿的液相色譜參數(shù)，優(yōu)化液相條件，前處理提取條件，研究了方法檢出限和定量限，準(zhǔn)確度和精密度，通過三方驗(yàn)證檢驗(yàn)方法的可靠性。三、主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜合報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果；（一）方法條件優(yōu)化1、試樣的制備試樣取可食部分經(jīng)勻漿機(jī)勻漿或高速粉碎機(jī)或組織搗碎機(jī)粉碎均勻后，儲(chǔ)存于樣品瓶中，樣品現(xiàn)用現(xiàn)制備。干樣品稱取0.1g-0.5g，鮮樣稱取2.0g-5.0g（樣品精確至0.0001g）。2、單因素試驗(yàn)-試樣前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化2.1提取溶劑的選擇選取以下7種提取試劑溶液：A:60%甲醇溶液；B:70%甲醇溶液；C:80%甲醇溶液；D:甲醇溶液；E:三氯甲烷:甲醇混合液（V:V=1:1）；F:二氯甲烷:甲醇混合液（V:V=1:1）；G:超純水。按以下步驟進(jìn)行操作：稱取1.0g紅甜菜于錐形瓶中，分別加入上述7種提取試劑25mL，于75℃恒溫水浴回流提取60min,冷卻至室溫。將提取溶液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，分別用上述7種提取試劑洗滌錐形瓶，將洗液全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中，過0.45μm濾膜。待測(cè)。表2.不同提取試劑測(cè)定結(jié)果（`X±SD,n=3）提取試劑甜菜堿含量（mg/100g）60%甲醇181.62±6.2770%甲醇195.18±3.4880%甲醇203.64±3.98甲醇222.63±5.76三氯甲烷:甲醇（V:V=1:1）182.70±8.48二氯甲烷:甲醇（V:V=1:1）186.87±11.83超純水193.42±7.30不同提取試劑測(cè)定紅甜菜中甜菜堿含量如表2所示。結(jié)果表明，甲醇溶液提取效果最高，其次為80%甲醇溶液、70%甲醇溶液。三氯甲烷:甲醇溶液（V:V=1:1）提取效果最低。所以，選擇甲醇、70%甲醇和80%甲醇溶液作為正交實(shí)驗(yàn)的提取試劑。2.2提取時(shí)間的選擇樣品分別提取10min、20min、30min、40min、50min、60min和70min，其他操作步驟同2.1。表3.不同提取時(shí)間測(cè)定結(jié)果（`X±SD,n=3）提取時(shí)間（min）甜菜堿含量（mg/100g）10202.97±7.6220199.18±2.5630204.14±1.2940192.75±17.5850190.84±5.7260190.66±6.9270191.40±13.05不同提取時(shí)間測(cè)定紅甜菜中甜菜堿含量如表3所示。結(jié)果表明，提取30min時(shí)，甜菜堿的含量最高，其次為10min、和20min。提取60min時(shí)，甜菜堿含量最低。綜合考慮，選擇10、20和30min溶液作為正交實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間。2.3提取溫度的選擇樣品分別于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃和100℃提取10min，其他操作步驟同2.1。表4.不同提取溫度測(cè)定結(jié)果（`X±SD,n=3）提取溫度（℃）甜菜堿含量（mg/100g）25183.28±5.2635199.96±5.8045219.92±8.5855202.25±8.9465199.28±2.3775193.03±8.6885195.02±7.37100193.10±3.48不同提取溫度測(cè)定紅甜菜中甜菜堿含量如表4所示。結(jié)果表明，提取溫度為45℃時(shí)，甜菜堿的含量最高，其次為55℃和35℃。25℃時(shí)，甜菜堿含量最低。因此，選擇35、45和55℃作為正交實(shí)驗(yàn)的提取溫度。2.4料液比的選擇樣品分別加入1:15、1:25、1:35和1:45的料液比，其他操作步驟同2.1。表5.不同料液比測(cè)定結(jié)果（`X±SD,n=3）料液比甜菜堿含量（mg/100g）1:15217.16±5.781:25218.26±10.001:35220.96±11.191:45216.56±4.72不同料液比測(cè)定紅甜菜中甜菜堿含量如表5所示。結(jié)果表明，分別加入4種料液比測(cè)定甜菜堿含量無(wú)明顯差異。因此，料液比不是影響甜菜堿的提取主要因素。2.5提取方式按步驟2.1進(jìn)行試驗(yàn)，分別選取超聲、振蕩和水浴振蕩三種提取方式。表6.不同提取方式測(cè)定結(jié)果（`X±SD,n=3）提取方式甜菜堿含量（mg/100g）超聲190.54±2.18振蕩195.31±11.00水浴振蕩218.26±10.00不同提取方式測(cè)定紅甜菜中甜菜堿含量如表6所示。結(jié)果表明，水浴振蕩提取測(cè)定的甜菜堿含量最高，超聲測(cè)定甜菜堿含量最低。所以選取水浴振蕩提取方式。3、正交試驗(yàn)-試樣前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，以甲醇體積分?jǐn)?shù)（A,%）、提取溫度（B,℃）、提取時(shí)間（C，min）為考察因素，甜菜堿含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅甜菜中甜菜堿的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。因素和水平見表7。表7.因素與水平水平因素A%B,℃C,min1100351028045203705530表8.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果序號(hào)因素甜菜堿含量A%B,℃C,minD(誤差)（mg/100g）11111209.3221222209.2531333205.0942123199.1052231199.9762312193.7673132197.4183213196.7893321194.45`k1207.89201.94199.95201.24`k2197.61202.00200.93200.14`k3196.21197.77200.82200.32R35.0212.522.941.10表9.方差分析結(jié)果變異來(lái)源平方和自由度均方FPA243.872121.94127.95<0.05B35.38217.6918.56<0.05C1.7220.86D(誤差)2.0921.05注：F0.05(2,4)=6.94;F0.01(2,4)=18.00正交試驗(yàn)結(jié)果分析如表8所示，方差分析結(jié)果如表9所示。由表8可知，各因素對(duì)甜菜堿含量影響程度的結(jié)果排序?yàn)锳>B>C，即甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間，由表9方差分析結(jié)果可知，甲醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)甜菜堿含量存在顯著性影響（P<0.05），提取時(shí)間對(duì)甜菜堿含量無(wú)顯著性影響（P>0.05）。綜合考慮極差分析和方差分析結(jié)果，確定最優(yōu)條件為A1B2C1,即為甲醇溶液，45℃提取10min。4、色譜條件的選擇和優(yōu)化篩選參數(shù)：色譜柱和洗脫程序選取以下3種色譜柱：A:ZORBAXSB-Aq，5μm，4.6×150mmB:ZORBAXNH2，5μm，4.6×150mm；C:ZORBAXRx-SIL,5μm，4.6×150mm。（2）4種洗脫程序見表10-13，流動(dòng)相A:乙腈；B為水。表10.流動(dòng)相等度洗脫程序時(shí)間，min流動(dòng)相A，%流動(dòng)相B，%流速mL/min050501.03050501.0表11.流動(dòng)相等度洗脫程序時(shí)間，min流動(dòng)相A，%流動(dòng)相B，%流速mL/min060401.03060401.0表12.流動(dòng)相等度洗脫程序時(shí)間，min流動(dòng)相A，%流動(dòng)相B，%流速mL/min070301.03070301.0表13.流動(dòng)相等度洗脫程序時(shí)間，min流動(dòng)相A，%流動(dòng)相B，%流速mL/min080201.03080201.0實(shí)驗(yàn)處理：將甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)工作液注入液相色譜儀中，選擇SB-Aq、NH2和Rx-SIL對(duì)甜菜堿進(jìn)行分離。對(duì)比4種洗脫程序。柱溫為30℃。根據(jù)目標(biāo)化合物峰形對(duì)稱性確定最佳色譜條件。通過對(duì)比上述3種色譜柱對(duì)甜菜堿的分離效果，結(jié)果表明Rx-SIL色譜柱分離效果優(yōu)于SB-Aq和NH2色譜柱。對(duì)比4種相洗脫程序，結(jié)果見圖1-4，圖1乙腈：水=50:50等度洗脫圖2乙腈：水=60:40等度洗脫圖3乙腈：水=70:30等度洗脫圖4乙腈：水=80:20等度洗脫由圖1-4為不同濃度的洗脫程序，從出峰的時(shí)間，峰型對(duì)稱性，響應(yīng)程度等因素綜合考慮，乙腈：水=80:20等度洗脫效果最佳，因此選取乙腈：水=80:20等度洗脫。綜上，實(shí)驗(yàn)確定最佳色譜條件如下：色譜柱：Rx-SIL，5μm，4.6×150mm；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A-乙腈；流動(dòng)相B-水等度洗脫，洗脫程序如下：表13.流動(dòng)相等度洗脫程序時(shí)間，min流動(dòng)相A，%流動(dòng)相B，%流速mL/min080201.03080201.0流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：196nm；進(jìn)樣量：10μL。5、方法的科學(xué)性、可操作性的驗(yàn)證5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液線性范圍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品25.0mg，用超純水溶解并定容至25mL即為10.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃下，貯存于密閉棕色玻璃瓶中，有效期為6個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：吸取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL棕色容量瓶中，用超純水定容至10mL，制成標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)時(shí)現(xiàn)配。標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液：吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用超純水配制成質(zhì)量濃度為0.01mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表14。表14.甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和濃度范圍組分回歸方程相關(guān)系數(shù)濃度范圍（mg/mL）甜菜堿y=2147.3x-1.66461.00.01067-0.85365.2方法的檢出限與定量限取樣品按照實(shí)驗(yàn)建立方法處理，上機(jī)測(cè)定觀察信噪比，適當(dāng)進(jìn)行稀釋，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別以3和10倍的信噪比計(jì)算。當(dāng)樣品取樣量為5.0g，定容體積為50mL時(shí)，甜菜堿的檢出限為1.0mg/100g，定量限為3.0mg/100g。5.3方法的精密度選取含有甜菜堿的谷物、蔬菜、水果等代表性食品，以干枸杞、藜麥和菠菜為研究對(duì)象別進(jìn)行精密度試驗(yàn)，平行測(cè)定6個(gè)樣品，考察檢測(cè)方法的精密度。表15.精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果甜菜堿測(cè)定值（mg/100g）平均值（mg/100g）RSD（%）123456干枸杞772.22772.74802.52789.01789.86779.67784.341.49藜麥881.65857.45824.99869.95853.38853.38858.592.24菠菜204.82202.72203.03199.20195.24199.55200.761.72根據(jù)GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求，被測(cè)組分含量大于100mg/kg時(shí)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)為3.8%。由表15可知，樣品中的甜菜堿6次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.8%，表明該方法的精密度良好，適合定量分析。5.4方法的回收率選回收率公式如下：QUOTEX1-X0式中，P-加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率；m-加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量；X1-加標(biāo)試樣的測(cè)定值；X0-本底的測(cè)定值。分別準(zhǔn)確稱取干枸杞、藜麥和菠菜樣品，向樣品本底添加低、中、高三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算甜菜堿的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。表16.甜菜堿回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）樣品本值（mg/100g）加標(biāo)量（mg）加標(biāo)回收率%RSD%123456均值(n=6)干枸杞784.341.00103.6598.57101.6895.82100.18101.13100.172.712.0197.2696.9395.3297.09104.6598.2398.253.274.01102.07102.37101.2598.44104.18102.35101.781.89藜麥858.590.45100.2495.7495.58103.2899.86104.3799.853.670.9097.2295.19101.9999.6397.44104.1499.273.331.80104.00102.3199.30101.3595.71101.91100.762.90菠菜200.761.0097.5095.4296.89102.88104.2098.1399.173.532.01102.5695.5296.4696.67100.2598.6398.352.674.0195.7096.17100.34100.20104.4795.6598.763.15根據(jù)GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的要求，被測(cè)組分含量大于100mg/kg時(shí)，回收率范圍在95%-105%之間。由表16知，干枸杞、藜麥和菠菜樣品中的甜菜堿平均加標(biāo)回收率分別在95.32%-104.65%、95.19%-104.37%、之間，加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，各組分回收率結(jié)果滿足GB/T27404-2008的要求，表明方法回收率高，適合植物源性食品中甜菜堿含量的測(cè)定。5.5樣品測(cè)定選取橙子、白心火龍果、西紅柿、甜瓜、豌豆莢、香蕉、西蘭花、紅心火龍果、土豆、黃豆、糙米、紅豆粉、茯苓紅豆薏米粉、多種莓果麥片、豆?jié){粉16種樣品。按實(shí)驗(yàn)建立的方法，計(jì)算不同樣品中甜菜堿的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，各樣品在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值均