Hela細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與檢測

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)10/10Hela細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)掌握細(xì)胞凋亡的原理以及誘導(dǎo)凋亡的方法。了解DAPI染色的原理、方法并用它檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、移液器、離心機(jī)、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、顯微攝影技術(shù)儀器、錫紙。實(shí)驗(yàn)試劑PBS溶液以成品干粉加超純水配制；過濾后121oC滅菌20min，4oC保存H202溶液消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液DAPI染液實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)將對數(shù)增長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×105/L，胞懸浮于100μLDMEM培養(yǎng)基。加H2O2處理，至終濃度為0.8mmol/L。（H2O2母液濃度8.8mol/L）24小時后收集細(xì)胞進(jìn)行染色和形態(tài)學(xué)觀察。細(xì)胞凋亡檢測收集細(xì)胞(200uL胰酶37℃消化后，再加入1mL培養(yǎng)基)至1.5mLEP管，1000rpm離心5min。吸出上清，于沉淀中加入100uL甲醇溶液，室溫固定10min。1000rpm離心5min。棄上清，加100uLPBS洗滌沉淀細(xì)胞。1000rpm離心5min。棄上清，加50uLDAPI，于37℃染色10min。1000rpm，離心5min。棄上清，加100uLPBS洗滌。1000rpm，離心5min。棄上清，加15uLPBS重懸細(xì)胞。取15uL懸液于玻片上并于正置熒光顯微鏡下觀察。整理：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后把桌面收拾干凈，東西統(tǒng)一放回后面的臺子上。用完顯微鏡要復(fù)原顯微鏡，如果用了油鏡要擦拭鏡頭。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：分裂期細(xì)胞細(xì)胞的凋亡檢測：分裂期細(xì)胞圖1：細(xì)胞凋亡檢測（圖中標(biāo)出的為處于分裂期的細(xì)胞）分裂中期細(xì)胞圖2：細(xì)胞凋亡檢測（圖中標(biāo)出的為處于分裂中期的細(xì)胞）分裂中期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初期，我在視野中觀察到了很多如上圖中標(biāo)出的細(xì)胞，并誤以為是凋亡細(xì)胞。但是觀察發(fā)現(xiàn)，該類細(xì)胞并無特別致密且分散的藍(lán)色熒光，高亮區(qū)域主要集中在中間，且過于密集。圖2則更加明顯，藍(lán)色區(qū)域呈現(xiàn)出規(guī)則的紡錘形，在細(xì)胞中間還能夠觀察到排列整齊的染色體，說明該細(xì)胞正處于有絲分裂中期。經(jīng)過老師確認(rèn)后，這些細(xì)胞都是處于分裂期的細(xì)胞。通過對比分裂期的細(xì)胞，將其設(shè)為對照，處于凋亡stageIIb期的細(xì)胞處于凋亡stageIIb期的細(xì)胞圖3：細(xì)胞凋亡檢測（處于凋亡stageIIb期的細(xì)胞）處于凋亡stageIIb期的細(xì)胞圖4：細(xì)胞凋亡檢測（處于凋亡stageIIb處于凋亡stageIIb期的細(xì)胞處于凋亡stageIIa期的細(xì)胞處于凋亡stageIIa期的細(xì)胞圖5：細(xì)胞凋亡檢測（處于凋亡stageIIa期的細(xì)胞）如圖3-5所示，圖中標(biāo)出的細(xì)胞處于凋亡的不同時期，說明之前細(xì)胞傳代培養(yǎng)以及凋亡誘導(dǎo)的成功。本次觀察到的凋亡細(xì)胞主要為IIa和IIb兩個階段。處于這兩個階段的細(xì)胞形態(tài)比較特殊，染色情況比較容易分辨。這兩個階段同有絲分裂的細(xì)胞有著較大的區(qū)別。首先，可以見到較為分散且數(shù)量較少的染色亮斑；其次染色較深的區(qū)域并沒有集中在中央，呈彌散狀，而是散布在細(xì)胞的各個位置；stageIIa的細(xì)胞中能夠觀察到明顯的核形變化。受到染色時間、染液分布等問題的影響，我很難確定處于凋亡I期的細(xì)胞。由于在進(jìn)行觀察拍照前，細(xì)胞經(jīng)過了多次離心，因此凋亡小體基本上被去除，很難觀察到。分析與討論：細(xì)胞凋亡的檢測方法：1）形態(tài)學(xué)觀察方法1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。3、臺盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。4、透射電鏡觀察：可見凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。2）DNA凝膠電泳細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。正?；罴?xì)胞DNA電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER）條帶；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。3）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。4）流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞發(fā)生凋亡時，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用一特點(diǎn)，被檢測細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。細(xì)胞壞死、自噬與細(xì)胞凋亡：我們經(jīng)常接觸到細(xì)胞壞死、自噬與凋亡這三個名詞，它們之間有著什么樣的區(qū)別呢？三者都是細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化的生理過程，但是其特征以及誘因不同，生物學(xué)的意義也不同。其中細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡直接導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，而自噬則是通過消化分解細(xì)胞器以維持細(xì)胞成分的穩(wěn)定，不直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞壞死是因補(bǔ)體反應(yīng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞吸水膨脹，最終破膜而死。細(xì)胞壞死的特征為線粒體膨脹，細(xì)胞骨架降解，溶酶體釋放，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)沉淀靠近核膜邊，蛋白質(zhì)合成下降，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥。自噬主要的生理功能是將胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、RNA、過量儲存的糖原等）和一些細(xì)胞內(nèi)源性底物（包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器）在單位膜包裹的囊泡中大量降解，實(shí)現(xiàn)再循環(huán)，以維持細(xì)胞自身的穩(wěn)定。這個過程對于細(xì)胞成分更新、保持旺盛的生理狀態(tài)是至關(guān)重要的。在此過程中，自噬體的形成是關(guān)鍵，其直徑一般為300~900nm，平均500nm，囊泡內(nèi)常見的包含物有胞質(zhì)成分和某些細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)吞體、過氧化物酶體等。圖6：細(xì)胞自噬示意圖細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。圖7：細(xì)胞凋亡示意圖表1：細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的區(qū)別類型細(xì)胞凋亡細(xì)胞自噬細(xì)胞壞死起因生理或病理性生理或病理病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細(xì)胞區(qū)域細(xì)胞大片組織或成群細(xì)胞細(xì)胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體保持完整破損染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀無變化呈絮狀細(xì)胞器無明顯變化被吞噬體包裹腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解細(xì)胞體積固縮變小基本不變腫脹變大基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀無降解隨機(jī)降解，電泳圖譜涂抹狀調(diào)控內(nèi)部因素內(nèi)外因素都可影響外部因素炎癥反應(yīng)無無有實(shí)驗(yàn)總結(jié)思考：這次實(shí)驗(yàn)，我們在細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和檢測試驗(yàn)。在課上，我了解細(xì)胞傳代培養(yǎng)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的原理以及方法和具體操作時的注意事項(xiàng)，成功地觀察到了處于凋亡期的細(xì)胞。最重要的是