第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件

第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第一節(jié)報告基因的表達檢測第二節(jié)外源基因整合的Southern雜交鑒定第三節(jié)外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測第四節(jié)外源基因表達蛋白的檢℃測第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第一節(jié)報告基因的表達檢測報告基因的兩大特點：表達產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化的植物細胞內(nèi)并不存在；便于檢查目前常使用的報告基因GFP，GUS，BAR，NPTII等第一節(jié)報告基因的表達檢測報告基因的兩大特點：第一節(jié)報告基因的表達檢測1、gfp（綠色熒光蛋白）基因簡介：綠色熒光蛋白是一些腔腸動物所特有的生物熒光素蛋白。生物熒光素蛋白是指存在于生物體的、能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的蛋白質(zhì)。它是一種能接受熒光輻射能并最終發(fā)射熒光的物質(zhì)。從水母中分離純化的Gfp是由238個氨基酸殘基組成的單體蛋白，分子量26888Da，它在藍光激發(fā)下能發(fā)出綠光。1、gfp（綠色熒光蛋白）基因簡介：綠色熒光蛋白是一些腔腸動Gfp作報告基因的優(yōu)點：適用于各種生物的基因轉(zhuǎn)化；檢查方法簡便，無需底物、梅、輔因子等物質(zhì)；便于活體檢測；檢測是可獲得直觀信息。Gfp作報告基因的優(yōu)點：2、gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因Gus基因存在于某些細菌體內(nèi)，是一種水解酶，能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。檢測方法：組織化學(xué)染色定位法以X-Gluc為底物，通過顯色反應(yīng)可直接觀察到組織器官中g(shù)us基因的活性。在適宜的條件下，該酶可將X-Gluc水解成藍色物質(zhì)，此靛藍染料使具有Gus活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色，用肉眼或顯微鏡即可觀察。2、gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因Gus基因存在于某些細菌體第二節(jié)外源基因整合的Southern雜交鑒定Southern雜交是以DNA或RNA為探針，檢查DNA鏈，用于外源基因整合的鑒定及分析。具有靈敏度高（可檢出1pgDNA樣品）；特異性強（可鑒別出20個堿基對左右的同源序列）的特點根據(jù)雜交時所用的具體方法分為：印跡雜交、斑點或狹縫雜交和細胞原位雜交等。分子雜交涉及三大內(nèi)容：制備雜交探針；制備被檢的核酸或蛋白質(zhì)樣品；印跡及雜交。第二節(jié)外源基因整合的Southern雜交鑒定Souther一、Southern雜交步驟（一）植物總DNA提取（二）雜交探針的制備探針：是經(jīng)過特殊化合物標記的特定的核苷酸序列。分為DNA探針和RNA探針，DNA探針又分為單鏈DNA探針和雙鏈DNA探針。雜交探針制備包括：探針核苷酸序列的獲取及標記兩部分。一、Southern雜交步驟（一）植物總DNA提取鑒定轉(zhuǎn)基因植株時應(yīng)使用同源探針，常以轉(zhuǎn)化的目的基因作探針。目的基因探針一般從載體質(zhì)粒上切取。包括質(zhì)粒DNA的分離純化；限制性內(nèi)切梅切割；電泳分離酶切片段；從凝膠中回收目的片段。1、探針核苷酸序列的獲取1、探針核苷酸序列的獲取2、探針標記（1）理想的標記物條件：標記前后探針的基本結(jié)構(gòu)相同，標記物不影響探針的雜交特異性；檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復(fù)性好且操作簡便、省時；穩(wěn)定、安全、無環(huán)境污染；經(jīng)濟。2、探針標記標記物分為：放射性和非放射性兩類放射性標記物主要有32P、35S、125I、14C等；非放射性標記物主要有生物素、地高辛、熒光素、辣根過氧化物酶等.標記物分為：放射性和非放射性兩類（2）放射性標記物制備核酸探針時使用的放射性標記物多為三磷酸核苷酸（NTP）或脫氧三磷酸核苷酸（dNTP），以這些標記的核苷酸作底物，通過酶促聚合反應(yīng)，使標記物摻入到多核苷酸鏈中，從而獲得合適探針。特點：放射自顯影靈敏度高，壓片時間短；分辨力較低；探針不能長期保存（2）放射性標記物（3）非放射性標記物特點：敏感性較差；穩(wěn)定性好、分辨力高，檢測所需時間短。對人和環(huán)境無害。生物素:是一種水溶性B族維生素，其分子中的戊酸羧基經(jīng)化學(xué)修飾可含有各種活性基團，它能與蛋白質(zhì)、核酸等多種物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，從而使這些物質(zhì)被生物素標記。（3）非放射性標記物生物素標記的探針可通過生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng)檢出，也可通過生物素-抗生物素抗體的免疫系統(tǒng)檢出?？股锼氐鞍卓膳c酶、熒光素等物質(zhì)結(jié)合，是抗生物素蛋白被這些物質(zhì)標記，雜交時，生物素標記探針與被檢的單鏈DNA中同源序列雜交，檢出時，加入被酶等標記物標記的抗生物素蛋白，生物素與被標記的抗生物素蛋白特異結(jié)合，形成雜交DNA-生物素-抗生物素-酶等標記物的雜交檢出體系，根據(jù)抗生物素蛋白上的標記物性質(zhì)進行檢出。生物素標記的探針可通過生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng)檢出，也圖28-3地高辛標記探針雜交體檢出原理示意圖圖28-3地高辛標記探針雜交體檢出原理示意圖3、標記方法放射性標記有體內(nèi)標記法及體外標記法。體外標記法包括化學(xué)法、酶法和PCR法酶法：是先將標記物標記在核苷酸上，然后通過酶促聚合反應(yīng)使帶標記的核苷酸摻入到核酸序列中，產(chǎn)生合適探針。包括切口平移法及隨機引物法。3、標記方法放射性標記有體內(nèi)標記法及體外標記法。體外標記法包PCR法：是利用Taq酶可將修飾的核苷酸摻入到PCR產(chǎn)物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP熒光素標記的dNTP）所得PCR產(chǎn)物可用作探針?；瘜W(xué)法：是通過標記物的活性基團與核酸分子中的某種基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而繼續(xù)標記，標記物直接與核酸分子相連。PCR法：是利用Taq酶可將修飾的核苷酸摻入到PCR產(chǎn)物中（28-4切口平移法28-4切口平移法28-5隨機引物法28-5隨機引物法三、Southern印跡雜交程序1、植物總DNA的限制酶切2、凝膠電泳分離酶切片段3、凝膠中的DNA變性4、印跡：毛細轉(zhuǎn)移法和電轉(zhuǎn)移法5、雜交6、雜交信號的檢出三、Southern印跡雜交程序5、雜交1）雜交體系：探針濃度：控制在0.5ng/ml或更低雜交反應(yīng)溫度：低于Tm值15-25℃雜交時間：5、雜交1）雜交體系：2）預(yù)雜交及洗膜雜交的特異性是影響雜交效果的重要因素，非特異性雜交的去除主要是通過雜交前的預(yù)雜交和雜交后的洗膜完成。預(yù)雜交：是在加入探針前用封閉劑封閉膜上的非特異性位點。常用封閉劑包括變性的非特異性DNA，如鮭魚精子DNA，小牛胸腺DNA等；另一類是高分子化合物，如Denhardts操作：將印跡后的固相膜放在含封閉劑的預(yù)雜交液中，37-42℃溫育3-12h2）預(yù)雜交及洗膜洗膜：是雜交后將固相膜依次置于不濃度的溶液中漂洗，以除去游離的及非特異性位點上結(jié)合的探針。洗膜液的溫度、離子強度及洗膜時間是影響洗膜效果的三要素。洗膜：是雜交后將固相膜依次置于不濃度的溶液中漂洗，以除去游離6、雜交信號的檢出放射性標記的探針通過放射自顯影檢出；包括：感光材料曝光、顯影、定影、水洗等過程。非放射性標記的探針主要通過酶反應(yīng)法檢出包括：偶聯(lián)反應(yīng)和酶的顯色反應(yīng)兩階段。6、雜交信號的檢出放射性標記的探針通過放射自顯影檢出；二、外源基因整合的PCR-Southern檢測該方法是先對被檢測材料進行外源基因的PCR擴增，然后再用目的基因的同源探針與擴增的特異性條帶進行雜交。注意：設(shè)置三個對照空白對照：無任何DNA模板；陽性對照：以外源基因的重組質(zhì)粒DNA為模板；陰性對照：以非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板。二、外源基因整合的PCR-Southern檢測該方法是先對被第三節(jié)外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測植物細胞總RNA的提取探針的制備印跡及雜交第三節(jié)外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測植物細胞總RN外源基因表達的RT-PCR檢測外源基因表達的RT-PCR檢測第四節(jié)外源基因表達蛋白的檢測外源基因表達蛋白檢測主要利用免疫學(xué)原理，主要方法是Western雜交和ELISA一、ELISA檢測酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種利用免疫學(xué)原理檢查抗原、抗體的技術(shù)。檢測程序包括：抗體制備、抗體或抗原的包被和免疫反應(yīng)及檢出。第四節(jié)外源基因表達蛋白的檢測外源基因表達蛋白檢測主要利用免1、抗體的制備抗體：是機體應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生的一組特殊的球蛋白，Ig表示。ELISA檢測中涉及的抗體有兩種，未標記的抗體和酶標記的抗體，酶標記的抗體有包括兩種：一是針對特異抗原的酶標一抗，一是針對一抗的酶標二抗。1、抗體的制備2、包被包被是將抗原或抗體固定在固相載體表面。常用的固相載體是多孔的聚苯乙烯微量反應(yīng)板。3、免疫反應(yīng)4、檢出2、包被圖30-1夾心法示意圖圖30-1夾心法示意圖第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件愛是什么？

一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無。

一只鳥兒飛過來，停在枝上，望著遠處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問道：“你愛這稻谷嗎？”

“愛。”

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓。”

鳥兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤的羽毛。

“現(xiàn)在你愛這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥兒抬頭望著遠處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛那一灣泉水，我有點渴了?！?/p>

精靈摘下一片樹葉，里面盛了一汪泉水。

鳥兒喝完泉水，準備振翅飛去。

“請再回答我一個問題，”精靈伸出指尖，鳥兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水。”

“我要去那片開著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子?！?/p>

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤你的干渴？”

“不能。”愛是什么？

一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無。

一只鳥兒飛過來，停在枝上，望著遠處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問道：“你愛這稻谷嗎？”

“愛?！?/p>

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓?！?/p>

鳥兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤的羽毛。

“現(xiàn)在你愛這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥兒抬頭望著遠處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛那一灣泉水，我有點渴了?！?/p>

精靈摘下一片樹葉，里面盛了一汪泉水。

鳥兒喝完泉水，準備振翅飛去。

“請再回答我一個問題，”精靈伸出指尖，鳥兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水。”

“我要去那片開著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子?！?/p>

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤你的干渴？”

“不能?！睈凼鞘裁?？

一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無。

二、Western雜交Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的蛋白質(zhì)檢測方法。程序：植物蛋白質(zhì)的提取SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)條帶印跡探針制備雜交與檢出二、Western雜交Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件

其實，世上最溫暖的語言，“不是我愛你，而是在一起?！?/p>

所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以誠相待，彼此尊重，相互包容，相互懂得，才能走的更遠。相遇是緣，相守是愛。緣是多么的妙不可言，而懂得又是多么的難能可貴。否則就會錯過一時，錯過一世！擇一人深愛，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牽，一路笑對風(fēng)雨。在平凡的世界，不求愛的轟轟烈烈；不求誓言多么美麗；唯愿簡單的相處，真心地付出，平淡地相守，才不負最美的人生；不負善良的自己。人海茫茫，不求人人都能刻骨銘心，但求對人對己問心無愧，無怨無悔足矣。大千世界，與萬千人中遇見，只是相識的開始，只有彼此真心付出，以心交心，以情換情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。然而，生活不僅是詩和遠方，更要面對現(xiàn)實。如果曾經(jīng)的擁有，不能天長地久，那么就要學(xué)會華麗地轉(zhuǎn)身，學(xué)會忘記。忘記該忘記的人，忘記該忘記的事兒，忘記苦樂年華的悲喜交集。人有悲歡離合，月有陰晴圓缺。對于離開的人，不必折磨自己脆弱的生命，虛度了美好的朝夕；不必讓心靈痛苦不堪，弄丟了快樂的自己。擦汗眼淚，告訴自己，日子還得繼續(xù)，誰都不是誰的唯一，相信最美的風(fēng)景一直在路上。人生，就是一場修行。你路過我，我忘記你；你有情，他無意。誰都希望在正確的時間遇見對的人，然而事與愿違時，你越渴望的東西，也許越是無情無義地棄你而去。所以美好的愿望，就會像肥皂泡一樣破滅，只能在錯誤的時間遇到錯的人。歲月匆匆像一陣風(fēng)，有多少故事留下感動。愿曾經(jīng)的相遇，無論是錦上添花，還是追悔莫及；無論是青澀年華的懵懂賞識，還是成長歲月無法躲避的經(jīng)歷……愿曾經(jīng)的過往，依然如花芬芳四溢，永遠無悔歲月賜予的美好相遇。其實，人生之路的每一段相遇，都是一筆財富，尤其親情、友情和愛情。在漫長的旅途上，他們都會豐富你的生命，使你的生命更充實，更真實；豐盈你的內(nèi)心，使你的內(nèi)心更慈悲，更善良。所以生活的美好，緣于一顆善良的心，愿我們都能善待自己和他人。一路走來，愿相親相愛的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不離不棄，相惜相守，共度人生的每一個朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的寶，感恩一路有你！感謝您對文章的閱讀跟下載，希望本篇文章能幫助到您，建議您下載后自己先查看一遍，把用不上的部分頁面刪掉哦，當(dāng)然包括最后一頁，最后祝您生活愉快!其實，世上最溫暖的語言，“不是我愛你，而是在一起?！?/p>

第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第一節(jié)報告基因的表達檢測第二節(jié)外源基因整合的Southern雜交鑒定第三節(jié)外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測第四節(jié)外源基因表達蛋白的檢℃測第九章轉(zhuǎn)基因植物的檢查與鑒定第一節(jié)報告基因的表達檢測報告基因的兩大特點：表達產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化的植物細胞內(nèi)并不存在；便于檢查目前常使用的報告基因GFP，GUS，BAR，NPTII等第一節(jié)報告基因的表達檢測報告基因的兩大特點：第一節(jié)報告基因的表達檢測1、gfp（綠色熒光蛋白）基因簡介：綠色熒光蛋白是一些腔腸動物所特有的生物熒光素蛋白。生物熒光素蛋白是指存在于生物體的、能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光的蛋白質(zhì)。它是一種能接受熒光輻射能并最終發(fā)射熒光的物質(zhì)。從水母中分離純化的Gfp是由238個氨基酸殘基組成的單體蛋白，分子量26888Da，它在藍光激發(fā)下能發(fā)出綠光。1、gfp（綠色熒光蛋白）基因簡介：綠色熒光蛋白是一些腔腸動Gfp作報告基因的優(yōu)點：適用于各種生物的基因轉(zhuǎn)化；檢查方法簡便，無需底物、梅、輔因子等物質(zhì)；便于活體檢測；檢測是可獲得直觀信息。Gfp作報告基因的優(yōu)點：2、gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因Gus基因存在于某些細菌體內(nèi)，是一種水解酶，能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。檢測方法：組織化學(xué)染色定位法以X-Gluc為底物，通過顯色反應(yīng)可直接觀察到組織器官中g(shù)us基因的活性。在適宜的條件下，該酶可將X-Gluc水解成藍色物質(zhì)，此靛藍染料使具有Gus活性的部位或位點呈現(xiàn)藍色，用肉眼或顯微鏡即可觀察。2、gus（β-葡萄糖苷酸酶）基因Gus基因存在于某些細菌體第二節(jié)外源基因整合的Southern雜交鑒定Southern雜交是以DNA或RNA為探針，檢查DNA鏈，用于外源基因整合的鑒定及分析。具有靈敏度高（可檢出1pgDNA樣品）；特異性強（可鑒別出20個堿基對左右的同源序列）的特點根據(jù)雜交時所用的具體方法分為：印跡雜交、斑點或狹縫雜交和細胞原位雜交等。分子雜交涉及三大內(nèi)容：制備雜交探針；制備被檢的核酸或蛋白質(zhì)樣品；印跡及雜交。第二節(jié)外源基因整合的Southern雜交鑒定Souther一、Southern雜交步驟（一）植物總DNA提?。ǘ╇s交探針的制備探針：是經(jīng)過特殊化合物標記的特定的核苷酸序列。分為DNA探針和RNA探針，DNA探針又分為單鏈DNA探針和雙鏈DNA探針。雜交探針制備包括：探針核苷酸序列的獲取及標記兩部分。一、Southern雜交步驟（一）植物總DNA提取鑒定轉(zhuǎn)基因植株時應(yīng)使用同源探針，常以轉(zhuǎn)化的目的基因作探針。目的基因探針一般從載體質(zhì)粒上切取。包括質(zhì)粒DNA的分離純化；限制性內(nèi)切梅切割；電泳分離酶切片段；從凝膠中回收目的片段。1、探針核苷酸序列的獲取1、探針核苷酸序列的獲取2、探針標記（1）理想的標記物條件：標記前后探針的基本結(jié)構(gòu)相同，標記物不影響探針的雜交特異性；檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復(fù)性好且操作簡便、省時；穩(wěn)定、安全、無環(huán)境污染；經(jīng)濟。2、探針標記標記物分為：放射性和非放射性兩類放射性標記物主要有32P、35S、125I、14C等；非放射性標記物主要有生物素、地高辛、熒光素、辣根過氧化物酶等.標記物分為：放射性和非放射性兩類（2）放射性標記物制備核酸探針時使用的放射性標記物多為三磷酸核苷酸（NTP）或脫氧三磷酸核苷酸（dNTP），以這些標記的核苷酸作底物，通過酶促聚合反應(yīng)，使標記物摻入到多核苷酸鏈中，從而獲得合適探針。特點：放射自顯影靈敏度高，壓片時間短；分辨力較低；探針不能長期保存（2）放射性標記物（3）非放射性標記物特點：敏感性較差；穩(wěn)定性好、分辨力高，檢測所需時間短。對人和環(huán)境無害。生物素:是一種水溶性B族維生素，其分子中的戊酸羧基經(jīng)化學(xué)修飾可含有各種活性基團，它能與蛋白質(zhì)、核酸等多種物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，從而使這些物質(zhì)被生物素標記。（3）非放射性標記物生物素標記的探針可通過生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng)檢出，也可通過生物素-抗生物素抗體的免疫系統(tǒng)檢出。抗生物素蛋白可與酶、熒光素等物質(zhì)結(jié)合，是抗生物素蛋白被這些物質(zhì)標記，雜交時，生物素標記探針與被檢的單鏈DNA中同源序列雜交，檢出時，加入被酶等標記物標記的抗生物素蛋白，生物素與被標記的抗生物素蛋白特異結(jié)合，形成雜交DNA-生物素-抗生物素-酶等標記物的雜交檢出體系，根據(jù)抗生物素蛋白上的標記物性質(zhì)進行檢出。生物素標記的探針可通過生物素-抗生物素蛋白的親和系統(tǒng)檢出，也圖28-3地高辛標記探針雜交體檢出原理示意圖圖28-3地高辛標記探針雜交體檢出原理示意圖3、標記方法放射性標記有體內(nèi)標記法及體外標記法。體外標記法包括化學(xué)法、酶法和PCR法酶法：是先將標記物標記在核苷酸上，然后通過酶促聚合反應(yīng)使帶標記的核苷酸摻入到核酸序列中，產(chǎn)生合適探針。包括切口平移法及隨機引物法。3、標記方法放射性標記有體內(nèi)標記法及體外標記法。體外標記法包PCR法：是利用Taq酶可將修飾的核苷酸摻入到PCR產(chǎn)物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP熒光素標記的dNTP）所得PCR產(chǎn)物可用作探針?；瘜W(xué)法：是通過標記物的活性基團與核酸分子中的某種基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而繼續(xù)標記，標記物直接與核酸分子相連。PCR法：是利用Taq酶可將修飾的核苷酸摻入到PCR產(chǎn)物中（28-4切口平移法28-4切口平移法28-5隨機引物法28-5隨機引物法三、Southern印跡雜交程序1、植物總DNA的限制酶切2、凝膠電泳分離酶切片段3、凝膠中的DNA變性4、印跡：毛細轉(zhuǎn)移法和電轉(zhuǎn)移法5、雜交6、雜交信號的檢出三、Southern印跡雜交程序5、雜交1）雜交體系：探針濃度：控制在0.5ng/ml或更低雜交反應(yīng)溫度：低于Tm值15-25℃雜交時間：5、雜交1）雜交體系：2）預(yù)雜交及洗膜雜交的特異性是影響雜交效果的重要因素，非特異性雜交的去除主要是通過雜交前的預(yù)雜交和雜交后的洗膜完成。預(yù)雜交：是在加入探針前用封閉劑封閉膜上的非特異性位點。常用封閉劑包括變性的非特異性DNA，如鮭魚精子DNA，小牛胸腺DNA等；另一類是高分子化合物，如Denhardts操作：將印跡后的固相膜放在含封閉劑的預(yù)雜交液中，37-42℃溫育3-12h2）預(yù)雜交及洗膜洗膜：是雜交后將固相膜依次置于不濃度的溶液中漂洗，以除去游離的及非特異性位點上結(jié)合的探針。洗膜液的溫度、離子強度及洗膜時間是影響洗膜效果的三要素。洗膜：是雜交后將固相膜依次置于不濃度的溶液中漂洗，以除去游離6、雜交信號的檢出放射性標記的探針通過放射自顯影檢出；包括：感光材料曝光、顯影、定影、水洗等過程。非放射性標記的探針主要通過酶反應(yīng)法檢出包括：偶聯(lián)反應(yīng)和酶的顯色反應(yīng)兩階段。6、雜交信號的檢出放射性標記的探針通過放射自顯影檢出；二、外源基因整合的PCR-Southern檢測該方法是先對被檢測材料進行外源基因的PCR擴增，然后再用目的基因的同源探針與擴增的特異性條帶進行雜交。注意：設(shè)置三個對照空白對照：無任何DNA模板；陽性對照：以外源基因的重組質(zhì)粒DNA為模板；陰性對照：以非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板。二、外源基因整合的PCR-Southern檢測該方法是先對被第三節(jié)外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測植物細胞總RNA的提取探針的制備印跡及雜交第三節(jié)外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測植物細胞總RN外源基因表達的RT-PCR檢測外源基因表達的RT-PCR檢測第四節(jié)外源基因表達蛋白的檢測外源基因表達蛋白檢測主要利用免疫學(xué)原理，主要方法是Western雜交和ELISA一、ELISA檢測酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種利用免疫學(xué)原理檢查抗原、抗體的技術(shù)。檢測程序包括：抗體制備、抗體或抗原的包被和免疫反應(yīng)及檢出。第四節(jié)外源基因表達蛋白的檢測外源基因表達蛋白檢測主要利用免1、抗體的制備抗體：是機體應(yīng)抗原刺激產(chǎn)生的一組特殊的球蛋白，Ig表示。ELISA檢測中涉及的抗體有兩種，未標記的抗體和酶標記的抗體，酶標記的抗體有包括兩種：一是針對特異抗原的酶標一抗，一是針對一抗的酶標二抗。1、抗體的制備2、包被包被是將抗原或抗體固定在固相載體表面。常用的固相載體是多孔的聚苯乙烯微量反應(yīng)板。3、免疫反應(yīng)4、檢出2、包被圖30-1夾心法示意圖圖30-1夾心法示意圖第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件第十章-轉(zhuǎn)基因植物的檢測與鑒定課件愛是什么？

一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無。

一只鳥兒飛過來，停在枝上，望著遠處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問道：“你愛這稻谷嗎？”

“愛?！?/p>

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓?！?/p>

鳥兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤的羽毛。

“現(xiàn)在你愛這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥兒抬頭望著遠處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛那一灣泉水，我有點渴了。”

精靈摘下一片樹葉，里面盛了一汪泉水。

鳥兒喝完泉水，準備振翅飛去。

“請再回答我一個問題，”精靈伸出指尖，鳥兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水?！?/p>

“我要去那片開著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子?！?/p>

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能?！?/p>

“它能滋潤你的干渴？”

“不能。”愛是什么？

一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無。

一只鳥兒飛過來，停在枝上，望著遠處將要成熟的稻田。

精靈取出一束黃澄澄的稻谷問道：“你愛這稻谷嗎？”

“愛?！?/p>

“為什么？”

“它驅(qū)趕我的饑餓?！?/p>

鳥兒啄完稻谷，輕輕梳理著光潤的羽毛。

“現(xiàn)在你愛這稻谷嗎？”精靈又取出一束黃澄澄的稻谷。

鳥兒抬頭望著遠處的一灣泉水回答：“現(xiàn)在我愛那一灣泉水，我有點渴了?！?/p>

精靈摘下一片樹葉，里面盛了一汪泉水。

鳥兒喝完泉水，準備振翅飛去。

“請再回答我一個問題，”精靈伸出指尖，鳥兒停在上面。

“你要去做什么更重要的事嗎？我這里又稻谷也有泉水。”

“我要去那片開著風(fēng)信子的山谷，去看那朵風(fēng)信子?！?/p>

“為什么？它能驅(qū)趕你的饑餓？”

“不能。”

“它能滋潤你的干渴？”

“不能?！睈凼鞘裁矗?/p>

一個精靈坐在碧綠的枝葉間沉思。

風(fēng)兒若有若無。

二、Western雜交Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的蛋白質(zhì)檢測方法