熒光定量PCR原理擴增曲線課件

熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量PCR原理擴增曲線內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量1內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理2實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測熒光定量PCR原理－－定義實時定量PCR技術(shù)：與常規(guī)PCR技術(shù)比較：熒光定量PCR原3

擴增曲線熒光閾值

Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴增曲線熒光定量PCR原理－－常用名詞概念4Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase熒光基團熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴增曲線Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－5Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過域值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光域值Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－6Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值Ct值的定義：Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctva7CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系CyclenumberCk104Ck102Sample8線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認Notemplatecontrol確認PCR擴增效率（E）:0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認Notemplate9

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達量分析，siRNA效果確認，基因芯片結(jié)果驗證，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等熒光定量10內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理11非特異性熒光標記

SYBRGreenI特異性熒光標記

TaqManProbe常用熒光標記方法非特異性熒光標記常用熒光標記方法12SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenISYBRGreenI染料法——原理SYBRGreen13熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機理熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——14問題點：

SYBRGreenI與雙鏈DNA進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。SYBRGreenI染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：

設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！問題點：SYBRGreenI染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵15將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜16融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確SYBRGreenI染料法——融解曲線融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他17

對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜探針具有價格優(yōu)勢優(yōu)點

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高不能進行多重定量缺點SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點對DNA模板沒有選擇性優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)18Taqman探針法——原理

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法——原理5′端標記有報告基團(Repo19Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRRTaqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸201、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立1、引物、探針的設(shè)計：Taqman探針法——PCR體系的建立213’淬滅基團淬滅基團性質(zhì)建議使用的5’報告基團TAMRA熒光物質(zhì)FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非熒光物質(zhì)FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探針法——熒光標記物的選擇3’淬滅基團淬滅基團性質(zhì)建議使用的5’報告基團TAMRA熒光22

高度特異性重復(fù)性好可進行多重定量優(yōu)點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點Taqman探針法——優(yōu)缺點高度特異性優(yōu)點只適合一個特定的目標缺點Taqm23不同定量方法的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶不能進行多重定量適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好多重定量價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷不同定量方法的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍適用性廣適合科研中對各24內(nèi)容概要

熒光定量PCR原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南內(nèi)容概要熒光定量PCR原理25絕對定量解析方法絕對定量解析方法26Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,即得到該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量Sample25絕對定量的定義Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈27質(zhì)粒標準品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標準品使用目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA質(zhì)粒標準品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)28拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v質(zhì)粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計算拷貝數(shù)的計算：倍比梯度稀釋方法：質(zhì)粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計29

方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標準品：質(zhì)粒標準品濃度為106、105

、104

、103

；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標記探針；熒光定量擴增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量30Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標準品5×10328.1828.6428.410.16標準品5×10425.2525.1425.190.04標準品5×10522.1122.4622.280.12標準品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtST31擴增效率（E）計算

E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1

=2.03－1

＝1.03標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。擴增效率（E）計算標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得32未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36

=229087copies絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.33相對定量解析方法相對定量解析方法34理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA35以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行36管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

管家基因篩選方法根據(jù)文獻提供相對定量分析——管家基因篩選37

雙標準曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法雙標準曲線法相對定量分析——兩種常用的分析方法38

通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。

相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標準曲線法公式：通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行39優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標準曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數(shù)據(jù)優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單相對定量分析——雙標準曲線法40公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)點：無需作標準曲線缺點：假定擴增效率為100%；假定標準曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一

待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值－－－－△△Ct公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)41實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt42內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理43SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備模板準備引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備模板準備引物設(shè)計反應(yīng)條件44樣品制備環(huán)境要求模板準備數(shù)據(jù)分析RT上機濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計檢測電泳檢測樣品制備環(huán)境要求模板準備數(shù)據(jù)分析RT上機濃度確定SYBR法實45RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析上機AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析上機AMV下46模板準備引物設(shè)計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標準曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復(fù)＜4個無二級結(jié)構(gòu)擴增長度：100－200bp模板準備引物設(shè)計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析47反應(yīng)體系優(yōu)化上機反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ulMg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定擴增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標準曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實驗流程及注意事項標準品待測樣本陽性對照陰性對照反應(yīng)體系優(yōu)化上機反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)48技能要求誤差控制儀器介紹上機試劑選擇RT樣品制備模板準備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7seriesBioer－Linegeneseries分裝控制內(nèi)參控制機器校正控制平滑曲線，重復(fù)性好，靈敏度高SYBR法實驗流程及注意事項技能要求誤差控制儀器介紹上機試劑選擇RT樣品制備模板準備數(shù)據(jù)49

Rotor-gene6000MiniOpticonMx3005PTM

LINE-GENEFQD-66A

ABIPRISM7500iQ5Real-TimePCRDetectionSystem

Rotor-gene6000MiniOpticonMx50數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機RT樣品制備模板準備相對定量：2－△△Ct法絕對定量：標準曲線法可靠，準確的數(shù)據(jù)SYBR法實驗流程及注意事項數(shù)據(jù)分析儀器介紹分析方法上機RT樣品制備模板準備相對定量：251內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理52TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品SYBRGreen法探針法FP203RealMasterMix(Probe)

以DNA為模板FP202RealMasterMix

（SYBRGreen）

以RNA為模板FP302QuantqRT-PCR(SYBRGreen)KitFP303Quant一步法qRTPCR(SYBRGreen）TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品SYBRGreen法探針法F53TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品優(yōu)勢試劑盒中使用改良后的HotmasterTaqPolymerase，具有高效率、高靈敏度、高特異性特點多種不同的實驗緩沖液，滿足不同實驗需求高效的Quant系列逆轉(zhuǎn)錄酶，滿足RT需求獨特的Mg2＋自動調(diào)節(jié)，隨時保證為PCR提供最佳Mg2＋濃度TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品優(yōu)勢試劑盒中使用改良后的Hot54ThankYou世界觸手可及攜手共進，齊創(chuàng)精品工程ThankYou世界觸手可及攜手共進，齊創(chuàng)精品工程55熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量PCR原理擴增曲線內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量PCR原理擴增曲線熒光定量56內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理57實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測熒光定量PCR原理－－定義實時定量PCR技術(shù)：與常規(guī)PCR技術(shù)比較：熒光定量PCR原58

擴增曲線熒光閾值

Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴增曲線熒光定量PCR原理－－常用名詞概念59Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase熒光基團熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴增曲線Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－60Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過域值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光域值Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）BaselineLog－61Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值Ct值的定義：Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強度）Ctva62CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系CyclenumberCk104Ck102Sample63線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認Notemplatecontrol確認PCR擴增效率（E）:0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認Notemplate64

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達量分析，siRNA效果確認，基因芯片結(jié)果驗證，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等熒光定量65內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理66非特異性熒光標記

SYBRGreenI特異性熒光標記

TaqManProbe常用熒光標記方法非特異性熒光標記常用熒光標記方法67SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenISYBRGreenI染料法——原理SYBRGreen68熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機理熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——69問題點：

SYBRGreenI與雙鏈DNA進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。SYBRGreenI染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：

設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！問題點：SYBRGreenI染料法——問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵70將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線將溫度與熒光強度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜71融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確SYBRGreenI染料法——融解曲線融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他72

對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜探針具有價格優(yōu)勢優(yōu)點

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高不能進行多重定量缺點SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點對DNA模板沒有選擇性優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)73Taqman探針法——原理

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針Taqman探針法——原理5′端標記有報告基團(Repo74Taqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團淬滅基團探針DNA聚合酶引物RRRRTaqman探針法——工作機理熱變性引物和探針與模板退火延伸751、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立1、引物、探針的設(shè)計：Taqman探針法——PCR體系的建立763’淬滅基團淬滅基團性質(zhì)建議使用的5’報告基團TAMRA熒光物質(zhì)FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非熒光物質(zhì)FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探針法——熒光標記物的選擇3’淬滅基團淬滅基團性質(zhì)建議使用的5’報告基團TAMRA熒光77

高度特異性重復(fù)性好可進行多重定量優(yōu)點

只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點Taqman探針法——優(yōu)缺點高度特異性優(yōu)點只適合一個特定的目標缺點Taqm78不同定量方法的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶不能進行多重定量適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好多重定量價格高只適合特定目標病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷不同定量方法的比較方法優(yōu)點缺點適用范圍適用性廣適合科研中對各79內(nèi)容概要

熒光定量PCR原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南內(nèi)容概要熒光定量PCR原理80絕對定量解析方法絕對定量解析方法81Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,即得到該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量Sample25絕對定量的定義Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈82質(zhì)粒標準品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標準品使用目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA質(zhì)粒標準品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)83拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v質(zhì)粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計算拷貝數(shù)的計算：倍比梯度稀釋方法：質(zhì)粒標準品稀釋方法與拷貝數(shù)計84

方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標準品：質(zhì)粒標準品濃度為106、105

、104

、103

；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標記探針；熒光定量擴增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量85Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標準品5×10328.1828.6428.410.16標準品5×10425.2525.1425.190.04標準品5×10522.1122.4622.280.12標準品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtST86擴增效率（E）計算

E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1

=2.03－1

＝1.03標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標準曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。擴增效率（E）計算標準曲線制作：利用MeanCt作圖可得87未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36

=229087copies絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.88相對定量解析方法相對定量解析方法89理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同實際目的基因表達量分析相對定量的必要性理論上目的基因表達量分析條件SampleBSampleA90以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行校正，進行相對表達量分析。以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進行91管家基因

維持細胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

管家基因篩選方法根據(jù)文獻提供相對定量分析——管家基因篩選92

雙標準曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法雙標準曲線法相對定量分析——兩種常用的分析方法93

通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。

相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標準曲線法公式：通過標準曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行94優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標準曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數(shù)據(jù)優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單相對定量分析——雙標準曲線法95公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)點：無需作標準曲線缺點：假定擴增效率為100%；假定標準曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認的兩種相對定量方法之一

待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值－－－－△△Ct公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)96實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標基因和參照基因有相同的擴增效率，但擴增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt97內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品內(nèi)容概要熒光定量PCR的原理98SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備模板準備引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器