實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的幾個(gè)關(guān)鍵注意事項(xiàng)

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近年，從科學(xué)研究到臨床檢測(cè)，從“非洲豬瘟〞的檢測(cè)到“新冠病毒〞的檢測(cè)，熒光定量PCR儀器已成為分子生物學(xué)研究的常規(guī)設(shè)備。檢測(cè)方法的迅速發(fā)展，檢測(cè)任務(wù)的緊急也對(duì)檢測(cè)人員提出了更高的要求，需要他們具備熟練操作能力和分析判斷數(shù)據(jù)結(jié)果的能力。對(duì)于熒光定量PCR結(jié)果，最直觀的判斷就是看CT值和擴(kuò)增曲線是否正常。好多人在平日試驗(yàn)中會(huì)遇到異常擴(kuò)增曲線的困擾，譬如，核酸污染風(fēng)險(xiǎn)引起樣本陽(yáng)性、打折的擴(kuò)增曲線、復(fù)孔間重復(fù)性不好和陰性樣本擴(kuò)增曲線抬升等。面對(duì)異常的擴(kuò)增曲線，筆者將從以下幾個(gè)實(shí)例分析對(duì)比常見(jiàn)的異常擴(kuò)增曲線產(chǎn)生的原因及其解決方法。

一、確定是否有核酸污染風(fēng)險(xiǎn)的存在

由于在試驗(yàn)過(guò)程中，簡(jiǎn)單產(chǎn)生氣溶膠，造成樣本陽(yáng)性，所以要做好設(shè)施和環(huán)境的消毒處理。

（一）有效消毒劑的選擇

消毒劑包括鄰苯基苯酚、次氯酸鹽、強(qiáng)堿類(lèi)及戊二醛等。我們要根據(jù)不同的需要來(lái)選擇，如堿類(lèi)（氫氧化鈉、氫氧化鉀等）、氯化物和酚化合物適用于建筑物、木質(zhì)結(jié)構(gòu)、水泥表面、設(shè)施設(shè)備的消毒，而酒精和碘化物適用于人員消毒。消毒劑必需有效，如“非洲豬瘟〞病毒，用0.8%氫氧化鈉、含2.3%有效氯的次氯酸鹽、0.3%福爾馬林溶液、3%鄰苯基苯酚和3%碘化合物，處理30min即可將其殺滅。

（二）儀器設(shè)備和環(huán)境的消毒

1.生物安全柜內(nèi)消毒。如進(jìn)行“非洲豬瘟〞檢測(cè)活動(dòng)時(shí)應(yīng)在生物安全柜中操作區(qū)鋪隔水墊，試驗(yàn)后卷起隔水墊置于污物桶后消毒滅菌，采用有效消毒劑將生物安全柜內(nèi)操作區(qū)消毒處理1遍，再用清水浸泡紗布或吸水紙清洗1～2遍。

2.剪刀、鑷子等可重復(fù)使用物品消毒。剪刀、鑷子等可高壓滅菌的物品直接置于銳器盒高壓滅菌處理。不能高壓滅菌的物品考慮消毒劑浸泡，可用塑料盒盛裝有效消毒劑進(jìn)行浸泡處理30min。不能用消毒劑浸泡但可高壓處理的，可放進(jìn)生物安全滅菌袋后直接高壓蒸汽消毒（121℃，30min）。

3.儀器、工作臺(tái)面、地面、環(huán)境消毒。消毒的頻次可根據(jù)做試驗(yàn)次數(shù)的多少來(lái)定，少時(shí)14d消毒1次，多時(shí)7d消毒1次?？捎米贤饩€燈消毒30～60min，但紫外線燈用久后不能起到殺滅微生物的效果，所以試驗(yàn)終止后，儀器、工作臺(tái)面、地面、環(huán)境均應(yīng)用消毒液噴灑擦拭消毒。對(duì)金屬儀器等消毒時(shí)應(yīng)防止對(duì)儀器的腐蝕。試驗(yàn)過(guò)程中若出現(xiàn)樣品溢灑或容器破碎等狀況，發(fā)生小量液體樣品溢灑時(shí)，應(yīng)用吸水紙吸干，然后在表面噴灑有效消毒劑進(jìn)行處理。發(fā)生大量液體樣品溢灑時(shí)，應(yīng)當(dāng)立刻用毛巾或紙巾覆蓋感染性物質(zhì)及相關(guān)破碎物品，然后在上面噴灑有效消毒劑，消毒30min。再對(duì)吸水毛巾或紙巾以及破碎物品進(jìn)行清理（玻璃碎片應(yīng)用鑷子清理），然后再用有效消毒劑噴灑或擦拭污染區(qū)域。清理完畢后，應(yīng)對(duì)清潔用具及垃圾進(jìn)行高壓滅菌。檢驗(yàn)人員在整個(gè)操作過(guò)程中應(yīng)佩戴手套。清理操作區(qū)域及環(huán)境消毒完畢后，如水分蒸發(fā)導(dǎo)致臺(tái)面、內(nèi)壁等出現(xiàn)白色結(jié)晶現(xiàn)象，應(yīng)采用蒸餾水噴灑擦拭清理潔凈。另外，還要開(kāi)負(fù)壓空氣過(guò)濾裝置，保持試驗(yàn)室清白。

二、確定熒光定量PCR儀操作軟件設(shè)置的正確與否

試驗(yàn)前檢驗(yàn)員要對(duì)照試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢查熒光PCR儀設(shè)置的加熱時(shí)間、保持的溫度、循環(huán)的次數(shù)、熒光信號(hào)的采集和通道等是否與試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置的要求一致。有一個(gè)對(duì)比簡(jiǎn)單忽視的設(shè)置問(wèn)題是需要看一下所選用的試劑中是否含有ROX來(lái)作為參比熒光染料。有的熒光定量PCR儀可以用ROX來(lái)作為參比熒光染料，用以校正儀器系統(tǒng)以外的物理誤差。例如，均一化的校正作用，由于移液誤差或者蒸發(fā)導(dǎo)致的一批熒光反應(yīng)管內(nèi)的體積誤差等。目前，市面上有的熒光定量PCR試劑盒預(yù)混液是不含有ROX參比熒光染料的，假如用此類(lèi)試劑盒時(shí)，應(yīng)將ROX參比功能關(guān)閉，否則可能會(huì)出現(xiàn)圍繞基線上下波動(dòng)的“鋸齒狀〞擴(kuò)增曲線。遇到這種問(wèn)題，可以在“菜單設(shè)置〞中找到“參比熒光染料〞功能，將ROX改為None，重新將樣本參與含熒光反應(yīng)液和聚合酶的反應(yīng)體系中重新進(jìn)行擴(kuò)增分析，結(jié)果就正常了。切記不要將原來(lái)的反應(yīng)管重新進(jìn)行擴(kuò)增1次，假如這樣，擴(kuò)增曲線是一條直線，結(jié)果呈陰性，從而造成檢驗(yàn)結(jié)果的錯(cuò)誤。有的熒光定量PCR儀默認(rèn)是對(duì)所有熒光通道及所有樣品孔進(jìn)行熒光采集，用戶不用畏懼?jǐn)?shù)據(jù)丟失，試驗(yàn)終止后，可對(duì)儀器設(shè)置錯(cuò)誤的反應(yīng)孔的熒光通道、樣品名稱(chēng)等進(jìn)行更改，結(jié)果就會(huì)顯示出正確的擴(kuò)增曲線。

還有可能出現(xiàn)其他一些異常結(jié)果。如多組分圖擴(kuò)增曲線沒(méi)有抬升，本應(yīng)是很明顯的陰性樣本，但是擴(kuò)增圖譜的擴(kuò)增曲線抬升了，這樣抬升曲線就會(huì)與閾值線相交，反而出現(xiàn)了CT值。這主要是由于軟件在進(jìn)行基線自動(dòng)扣除的時(shí)候出現(xiàn)了錯(cuò)誤，引起了擴(kuò)增曲線的抬升。出現(xiàn)這種狀況首先可采取手動(dòng)調(diào)整基線的方法，重新定義基線就可恢復(fù)正常。即將基線起點(diǎn)改為熒光信號(hào)穩(wěn)定的循環(huán)數(shù)（一般是3）;基線終點(diǎn)則改成擴(kuò)增曲線起峰的前一個(gè)循環(huán)數(shù)（譬如起峰是在第25個(gè)循環(huán)，那基線的終點(diǎn)就是24）。另外，引起這種現(xiàn)象發(fā)生的原因是所選耗材、試劑或者操作導(dǎo)致背景熒光信號(hào)有所波動(dòng)，從而造成反應(yīng)孔的自動(dòng)基線扣除錯(cuò)誤，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線的抬升。

三、確定耗材和儀器配件是否使用正確

耗材對(duì)于熒光定量PCR來(lái)說(shuō)十分重要，好多異常的擴(kuò)增曲線是由于耗材使用不當(dāng)引起的。

（一）錯(cuò)誤使用普通PCR儀器所對(duì)應(yīng)的耗材

普通PCR耗材一般透光性不均勻，會(huì)造成熒光透過(guò)對(duì)比薄的地方，熒光信號(hào)強(qiáng);透過(guò)對(duì)比厚的地

方，熒光信號(hào)弱。這樣會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增熒光信號(hào)曲線時(shí)而上抬、時(shí)而下降的異常變動(dòng)，從而出現(xiàn)擴(kuò)增曲線打折的現(xiàn)象。

（二）未選擇跟儀器加熱模塊規(guī)格相匹配的耗材

有的熒光定量PCR儀加熱模塊分為兩種，試驗(yàn)前一定要確定好自己的儀器是哪一種加熱模塊，再來(lái)選擇相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)耗材。假如小的加熱模塊使用較大的耗材，則會(huì)造成耗材壓扁，甚至造成機(jī)器出現(xiàn)故障并出現(xiàn)報(bào)警的現(xiàn)象;假如大的加熱模塊使用較小的耗材，則會(huì)造成反應(yīng)管的外壁和熒光定量PCR儀的溫控模塊沒(méi)有充分接觸，從而出現(xiàn)熱傳導(dǎo)不充分，進(jìn)而影響聚合酶的活性，結(jié)果會(huì)引起同一個(gè)檢測(cè)樣本重復(fù)性不好，或者出現(xiàn)非特異擴(kuò)增（溶解曲線多峰）現(xiàn)象，有的甚至出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

（三）使用了質(zhì)量對(duì)比差的耗材

大部分熒光定量PCR儀器是一個(gè)開(kāi)放的平臺(tái)，客戶可以使用開(kāi)放的試劑、開(kāi)放的耗材。但是目前市面上熒光定量PCR耗材種類(lèi)繁多，質(zhì)量也是千差萬(wàn)別。在耗材選擇上，盡量選擇一些名牌企業(yè)的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品，不要由于低廉選用質(zhì)量差或不符合要求的試驗(yàn)耗材，帶來(lái)不必要的試驗(yàn)錯(cuò)誤。例如，使用質(zhì)量不好的耗材可能會(huì)引起熒光值不穩(wěn)定，從而造成反應(yīng)孔的自動(dòng)基線扣除錯(cuò)誤，得到不確切的CT值;使用質(zhì)量好的耗材，熒光信號(hào)正常，會(huì)出現(xiàn)明顯指數(shù)增長(zhǎng)曲線和CT值。假如使用PCR封膜質(zhì)量不好的反應(yīng)管，在PCR擴(kuò)增加熱過(guò)程中又受到蒸發(fā)的熱水蒸氣的影響，簡(jiǎn)單產(chǎn)生變形，這樣會(huì)引起“熒光的折射〞，即“光學(xué)扭曲〞現(xiàn)象。該試驗(yàn)假如使用了ROX作為參比熒光染料，ROX就會(huì)有效地校正這種熒光信號(hào)偏差，出現(xiàn)均勻的擴(kuò)增曲線，其結(jié)果才是正常的。

四、確定所使用的試劑是否正常

假如無(wú)核酸污染風(fēng)險(xiǎn)的存在、軟件設(shè)置都正確、試驗(yàn)耗材及配件也沒(méi)有問(wèn)題，但是擴(kuò)增曲線還是異常，這個(gè)時(shí)候就要確定所用試劑是否正常。

（一）確定試劑是否有效

確定試劑是否有效，包括查看試劑是否在有效期內(nèi)，是否反復(fù)凍融屢屢，運(yùn)輸條件是否正常?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)比試劑的批次號(hào)，結(jié)合試驗(yàn)中的陽(yáng)性、陰性對(duì)照結(jié)果，若陰性對(duì)照出現(xiàn)非特異性起跳，要先結(jié)合同一陰性對(duì)照的多組分圖，看看是否有擴(kuò)增曲線;假如是由于背景熒光波動(dòng)導(dǎo)致基線自動(dòng)扣除錯(cuò)誤導(dǎo)致的起跳，可通過(guò)手動(dòng)調(diào)整基線的方式進(jìn)行更改。假如是染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，可以通過(guò)溶解曲線來(lái)判斷是污染，還是引物二聚體;假如是探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)，則可能是污染導(dǎo)致的起跳。只有陽(yáng)性、陰性對(duì)照結(jié)果正確，才能確定試劑的有效性。

（二）觀測(cè)擴(kuò)增后的試劑體積

假如在擴(kuò)增過(guò)程中試劑中的水分蒸發(fā)，可能會(huì)引起擴(kuò)增體系中擴(kuò)增物質(zhì)濃度增高，在發(fā)射光源的照射下，熒光信號(hào)加強(qiáng)（熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增物濃度呈正相關(guān)），出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線抬升的現(xiàn)象。假如試驗(yàn)體系中參與了ROX作為參比熒光對(duì)照，ROX參比熒光染料可以區(qū)分?jǐn)U增曲線抬升是真擴(kuò)增，還是試劑蒸發(fā)引起的擴(kuò)增。假如參比熒光物質(zhì)的反應(yīng)管沒(méi)蓋好或者使用了PCR封膜質(zhì)量不好的反應(yīng)管，就會(huì)造成ROX反應(yīng)體系有蒸發(fā)和水分丟失的現(xiàn)象，ROX參比熒光染料的濃度會(huì)漸漸地增加，結(jié)果就出現(xiàn)ROX參比熒光擴(kuò)增曲線抬升現(xiàn)象，而正常孔中ROX熒光會(huì)一直不變。所以在做PCR試驗(yàn)加完試劑上機(jī)擴(kuò)增時(shí)，一定要檢查PCR反應(yīng)管是否已經(jīng)蓋好并且密封嚴(yán)實(shí)。這樣既防止試劑蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果，又防止試劑蒸發(fā)形成氣溶膠。

五、確定試驗(yàn)過(guò)程中的操作細(xì)節(jié)是否有誤

假如以上都正常，還要注意試驗(yàn)過(guò)程中的操作細(xì)節(jié)。例如，在做標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，是不是梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，假如不是梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，可能會(huì)引起標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增的效率或者R2值的異常。從冰箱冷凍室中取出的試劑是不均勻的，假如試劑溶化后沒(méi)有混勻，這時(shí)候取出的試劑是不均勻的，會(huì)影響后面的擴(kuò)增。定量PCR預(yù)混液跟核酸模板加好