第十六章 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種

第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種xxx公司第十六章轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計，管理制度第十六章

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種轉(zhuǎn)基因育種：就是根據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運載進入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。

與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢：

(1)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)體系的建立使可利用的基因資源大大拓寬。（沒有物種局限性）

(2)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗，適應(yīng)各種不良環(huán)境條件的優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑。

(3)利用轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)可以對植物的目標(biāo)性狀進行定向變異和定向選擇：很強的目的性(4)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以大大提高選擇效率，加快育種進程。（5）通過轉(zhuǎn)基因的方法，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。第一節(jié)

作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

(一)國際轉(zhuǎn)基因植物研究與現(xiàn)狀

1.自從20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)創(chuàng)建到1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有35個科120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。（植物）2.先后有30多個國家批準(zhǔn)了3000多例田間試驗，涉及的植物種類有40多種，2000年已有13個國家種植了商品化的轉(zhuǎn)基因植物。（國家數(shù)量）年全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積約為280萬hm2，1997年增加到1100萬hm2，1998年為2780萬hm2，1999年增加到3990萬hm2，2000年達到4420萬hm2。（面積增長）

年，轉(zhuǎn)基因作物大部分(85％)種植在發(fā)達國家，其中美國種植的面積最大，2000年為3030萬hm2，占全球的68％。其次為加拿大，2001年為320萬hm2。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善和普及，發(fā)展中國家轉(zhuǎn)基因作物的種植面積也在逐年擴大，所占份額不斷增加，從1997年占全球轉(zhuǎn)基因面積的14％，到2000年占到了24％。其中以阿根廷和中國較多。5.目前所種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積最大。（不同農(nóng)作物）

6.目標(biāo)性狀：轉(zhuǎn)基因作物的主要目標(biāo)集中在培育具有抗除草劑特性的農(nóng)作物優(yōu)良品種,其次為培育抗蟲和毒病新品種上。

(二)我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況

1.我國是世界上第一個商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。2.主要目標(biāo)性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49項，包括水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種。4.目前經(jīng)農(nóng)業(yè)部審查并經(jīng)全國基因工程安全委員會批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的作物已有我國自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價抗蟲棉)、美國Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉，延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄，抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄，抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒及轉(zhuǎn)查爾酮合酶(CHS)反義RNA基因矮牽牛。

二、轉(zhuǎn)基因育種的程序

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行作物育種的基本過程可分為：目的基因或DNA的獲得；含有目的基因或者DNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；受體材料的選擇和再生系統(tǒng)的建立；轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定；轉(zhuǎn)基因植株的育種利用。

(一)目的基因的獲得

目的基因的獲得是利用作物轉(zhuǎn)基因育種的第一步。根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達的產(chǎn)物——蛋白進行基因克??；從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。

1．根據(jù)基因表達的產(chǎn)物——蛋白進行基因克隆

根據(jù)基因表達的產(chǎn)物進行基因克隆的主要步驟如下：首先，分離和純化控制目的性狀的蛋白質(zhì)或者多肽，并進行氨基酸序列分析；然后，根據(jù)所得氨基酸序列推導(dǎo)相應(yīng)的核苷酸序列；采用化學(xué)合成的方式合成該基因；最后，通過相應(yīng)的功能鑒定來確定所推導(dǎo)的序列是否為目的基因。（有很大的局限性）。

2．從基因組DNA或mRNA序列克隆基因

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的問世及其在基因工程中的廣泛應(yīng)用，已經(jīng)大大地加快了基因克隆步伐。此外，多種生物基因組序列計劃的相繼實施和完成，大規(guī)模EST數(shù)據(jù)庫的建立，也使得大規(guī)模進行基因克隆成為可能。

(1)同源序列法。同源序列法是根據(jù)…。

(2)表達序列標(biāo)簽：表達序列標(biāo)簽主要是通過cDNA的途徑獲得。利用表達序列標(biāo)簽法進行基因克隆的基本過程為利用已標(biāo)記的特異探針進行cDNA文庫篩選，結(jié)合巢式PCR和5'、3'-RACE，得到5'端和3'端部分序列直至獲得全長的目的基因。

(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因。圖位克隆

(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。(5)差異顯示法。

(二)目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

(三)受體材料的選擇受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。能否建立穩(wěn)定、高效、易于再生的受體系統(tǒng)是植物轉(zhuǎn)基因操作的關(guān)鍵技術(shù)之一。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：①高效穩(wěn)定的再生能力；②受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；③具有穩(wěn)定的外植體來源，即用于轉(zhuǎn)化的受體要易于得到而且可以大量供應(yīng)；④對篩選劑敏感，即當(dāng)轉(zhuǎn)化體篩選培養(yǎng)基中篩選劑濃度達到一定值時，能夠抑制非轉(zhuǎn)化植株細(xì)胞的生長、發(fā)育和分化，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞、植株能正常生長、發(fā)育和分化形成完整的植株。常用的受體材料有以下幾大類型。

1．愈傷組織再生系統(tǒng)

外植體材料來源廣泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點；缺點是轉(zhuǎn)化的外源基因遺傳穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)嵌合體。

2．直接分化再生系統(tǒng)

此類再生系統(tǒng)的優(yōu)點是獲得再生系統(tǒng)的周期短、操作簡單，體細(xì)胞變異小，并且能夠保持受體材料的遺傳穩(wěn)定性。

3．原生質(zhì)體再生系統(tǒng)

優(yōu)點是能夠直接高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，可以獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，并適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點是不易制備、再生困難和變異程度高等。

4．胚狀體再生系統(tǒng)

胚狀體作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體具有個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因的能力強，轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生等優(yōu)點。

5．生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)

目前主要從兩個途徑利用生殖細(xì)胞進行基因轉(zhuǎn)化：一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。

(四)轉(zhuǎn)基因方法的確定和外源基因的轉(zhuǎn)化

概括起來說主要有兩類。第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。

1．載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

載體法是目前為止最常見的一類轉(zhuǎn)基因方法。

(1)葉盤法。

(2)真空滲入法。

(3)原生質(zhì)體共培養(yǎng)法。

2．外源基因直接導(dǎo)入法

(1)化學(xué)刺激法。化學(xué)刺激法是借助于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)

(2)基因槍轟擊法。(3)高壓電穿孔法。又稱為電擊法。(4)微注射法。(5)其他直接轉(zhuǎn)化方法。如超聲波介導(dǎo)法、脈沖電泳法和離子束介導(dǎo)等

(五)轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定

1．轉(zhuǎn)化體的篩選

為了有效地選擇出這些真正的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，必要使用特異性的選擇標(biāo)記基因進行標(biāo)記。常用選擇標(biāo)記基因包括抗生素抗性基因及除草劑抗性基因兩大類，如卡那霉素抗性基因NPTⅡ和潮霉素抗性基因hpt，除草劑抗性基因bar基因等。

2．轉(zhuǎn)化體的鑒定

(1)DNA水平的鑒定常用的檢測方法主要有特異性PCR檢測和Southern雜交。

(2)轉(zhuǎn)錄水平的鑒定。常用的方法主要有Northern雜交和RT-PCR檢測。

(3)翻譯水平的鑒定。最主要的方法是Western雜交。

(六)轉(zhuǎn)化體的安全性評價和育種利用因而，通過轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種(系)，一般在獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合利用雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。第二節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物的遺傳特點

1.外源目的基因在許多轉(zhuǎn)化體中都能夠穩(wěn)定整合、正常表達，表現(xiàn)出經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律。2.但是，隨著轉(zhuǎn)基因應(yīng)用實踐的增多，越來越多的實驗發(fā)現(xiàn)，外源基因在受體中的命運受到一系列生理生化過程的作用并以復(fù)雜的遺傳方式表現(xiàn)出來。這主要是由于外源基因進入宿主細(xì)胞后，將會受到宿主基因組的監(jiān)控，一般要發(fā)生DNA片段丟失、重排、異常重組，加之外源基因在宿主基因組內(nèi)整合的隨機性和多拷貝的影響，使外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳規(guī)律變得非常復(fù)雜，對其了解還處于初始階段。

一、外源基因整合的機制

從現(xiàn)有研究結(jié)果來看，外源基因主要是通過同源重組、位點特異性重組、轉(zhuǎn)座作用和異常重組幾種整合方式進入受體基因組。

(一)同源重組整合

同源重組是外源DNA與受體細(xì)胞染色體DNA上的同源序列之間發(fā)生交換替代，并整合到受體染色體組上的一種重組方式。

(二)位點特異性重組

位點特異性重組發(fā)生在兩條DNA的特異位點上，在位點特異性重組酶的作用下，通過對DNA的特異性切割實現(xiàn)外源基因的整合。例如入噬菌體DNA通過其attp位點和大腸桿菌DNA的attB之間的位點特異性重組而實現(xiàn)整合過程。

(三)轉(zhuǎn)座作用目前比較成熟的有來自玉米的Ac-Ds系統(tǒng)等。利用轉(zhuǎn)座系統(tǒng)進行基因轉(zhuǎn)移的基本原理是通過體外重組將外源基因插入到上述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，在上述攜帶有目的DNA片段的重組轉(zhuǎn)座成分復(fù)制并整合插入到染色體其他區(qū)域時實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移。

(四)異常重組

異常重組整合是外源基因整合到植物基因組的最常見方式。一般認(rèn)為異常重組不需要有DNA的同源序列、RecA蛋白質(zhì)，以及轉(zhuǎn)座酶的參與。二、整合后的外源基因在植株體內(nèi)的表現(xiàn)

1.通過各種途徑整合進入植物基因組的外源基因中只有很少一部分能夠整合到基因組，而能夠穩(wěn)定遺傳的外源基因所占比例更是非常小。這主要是由于在轉(zhuǎn)基因后代中大多數(shù)外源基因都已經(jīng)丟失或者發(fā)生基因沉默(genesilence)所導(dǎo)致的。2.導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默的原因是十分復(fù)雜的，從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看按照整合方式和整合的拷貝數(shù)來分主要包括順式失活、反式失活和共抑制三種形式。順式失活是因為多拷貝的外源基因連在一起，發(fā)生甲基化作用而失活；反式失活是順式失活的一種復(fù)雜形式，順式失活的轉(zhuǎn)基因作為一個“沉默因子”而影響染色體上等位或非等位的基因甲基化，導(dǎo)致基因失活，而沉默因子本身不發(fā)生變化；共抑制發(fā)生在轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源同源基因之間或者轉(zhuǎn)基因純合體兩個位點之間的相互作用從而導(dǎo)致基因沉默。3.人們先后采用了多種方法克服基因沉默問題，其中最經(jīng)典的方式有去甲基化、降低拷貝數(shù)、添加增強子以及對外源基因的結(jié)構(gòu)進行改造等方法?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，重復(fù)序列是引起基因沉默的關(guān)鍵，因此如何降低外源基因在植物體內(nèi)整合的拷貝數(shù)是解決基因沉默的有效方式之一。4.這可以通過兩條途徑進行：一是在轉(zhuǎn)基因植株后代中選擇單拷貝植株；二是選用外源基因整合拷貝數(shù)低的轉(zhuǎn)基因方法。三、外源基因在后代中的遺傳規(guī)律轉(zhuǎn)基因植物的基因分離與經(jīng)典的遺傳分離是不同的。在經(jīng)典遺傳理論中遺傳分離是統(tǒng)一的，等位基因分離將會導(dǎo)致性狀分離，遺傳方式相對簡單。（無規(guī)律性）可能的原因有：外源基因的重排或者缺失，外源基因?qū)胝T發(fā)的隱性致死突變或轉(zhuǎn)基因純合致死，含轉(zhuǎn)基因的雄配子致死、非轉(zhuǎn)化體在早代逃避選擇等。進一步研究表明，轉(zhuǎn)基因分離方式的多樣性與轉(zhuǎn)基因的整合方式和拷貝數(shù)有關(guān)。多拷貝整合是常見的整合方式，在某些轉(zhuǎn)化事件中，轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)達到幾十個，它們有的串聯(lián)整合，有的獨立整合，有的串聯(lián)與獨立整合共存。這些轉(zhuǎn)基因拷貝在世代傳遞中的不穩(wěn)定性和相互位置的改變以及彼此間直接與(或)間接的互作，增加了外源基因分離與表達的復(fù)雜性。一般來說，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化后代多呈簡單的孟德爾遺傳，而一些直接轉(zhuǎn)化方法，基因槍法獲得的轉(zhuǎn)基因后代分離相對復(fù)雜一些。第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因作物品種的選育通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植株很少直接作為品種進行推廣應(yīng)用，這是由于各類作物品種都具有一系列主要育種目標(biāo)性狀，將外源基因?qū)胧荏w植株只能賦予該株具有特定的目標(biāo)性狀，對于其他目標(biāo)性狀是否符合生產(chǎn)的需要還不清楚。由于轉(zhuǎn)基因目標(biāo)性狀是通過非常規(guī)手段方式獲得的，外源基因的插入很有可能對原有基因組的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，并對宿主基因的表達產(chǎn)生影響，這勢必影響甚至改變該作物品種的原有性狀。此外，轉(zhuǎn)基因植物的安全風(fēng)險性也是一個值得考慮的問題。因此通過轉(zhuǎn)基因方式獲得的植株還必須通過常規(guī)的品種鑒定途徑才能用于生產(chǎn)。從現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因育種情況來看，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物主要用于為培育新的作物品種而創(chuàng)造育種資源。

一、轉(zhuǎn)基因作物育種目標(biāo)的制訂

1．依據(jù)市場經(jīng)濟的需要和生產(chǎn)發(fā)展前景

2．依據(jù)不同的自然環(huán)境、栽培條件，抓主要矛盾

3．落實具體性狀目標(biāo)

例如在當(dāng)前限制棉花生產(chǎn)的主要矛盾就是棉鈴蟲的危害。

4．要考慮品種的搭配

5．要充分考慮到轉(zhuǎn)基因作物，尤其是外源目的基因?qū)θ祟惤】岛铜h(huán)境安全的影響

二、轉(zhuǎn)基因方法的確定及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

1.由于不同的轉(zhuǎn)基因方法各有其優(yōu)缺點，因此在選擇具體的方法時應(yīng)該充分考慮到上述情況。例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對于轉(zhuǎn)化雙子葉植物十分有效

2.受體品種的選擇在轉(zhuǎn)基因育種中是十分重要的。一般來說，如果轉(zhuǎn)化方法可行，那么，受體品種首選生產(chǎn)上正在大面積推廣或即將在生產(chǎn)上推廣的優(yōu)良品種。用它們轉(zhuǎn)化而成的轉(zhuǎn)基因植株易于快速地培育出新品種在生產(chǎn)上推廣利用。

3.不管通過什么方法，都要對獲得的轉(zhuǎn)基因植株開展分子與遺傳分析，選擇單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因植株用于新品種的選育。

4.在確定具體的轉(zhuǎn)基因方法和候選目的基因之后，就可以對按照具體的方法實行外源目的基因的轉(zhuǎn)移，在進行嚴(yán)格的轉(zhuǎn)基因鑒定之后獲得轉(zhuǎn)基因植株直接作為作物的新品種或者是育種新資源。

三、轉(zhuǎn)基因作物品種的選育

利用遺傳轉(zhuǎn)化途徑培育的轉(zhuǎn)基因植株從育種角度來看只是產(chǎn)生的一種種質(zhì)資源。要想在生產(chǎn)上加以利用，必須通過育種家的加工，培育出成型的品種后，才能推廣。

(一)純系育種

所謂轉(zhuǎn)基因作物選擇育種是指在現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因群體中，通過個體選擇或混合選擇等方式選優(yōu)去劣，育成新品種的方法。

1．出現(xiàn)變異的原因

外源基因的導(dǎo)入、整合和表達，整合的目的基因的分離、一因多效、位置效應(yīng)以及克隆的體細(xì)胞無性系變異等都會引起變異。

2．選擇育種的方法

如果轉(zhuǎn)基因植株的株型，農(nóng)藝性狀比較整齊一致，僅有整合的目的基因分離，那么可以采用改良混合選擇育種。

(二)回交育種

(三)雜交