酶工程酶和細胞的固定化課件

酶工程酶和細胞的固定化酶工程酶和細胞的固定化1（優(yōu)選）酶工程酶和細胞的固定化（優(yōu)選）酶工程酶和細胞的固定化2果葡糖漿：葡萄糖異構(gòu)酶/木糖異構(gòu)酶異麥芽酮糖：蔗糖變位酶阿斯巴甜：嗜熱菌蛋白酶果葡糖漿：葡萄糖異構(gòu)酶/木糖異構(gòu)酶異麥芽酮糖：蔗糖變位酶阿斯36-氨基青霉烷酸（6-APA）：青霉素?；?-氨基頭孢烷酸（7-ACA）：D-氨基酸氧化酶苯乙醇胺（又用作瘦肉精）：脂肪酶丙烯酰胺：腈水解酶氨基酸：氨基?；?酰脲酶6-氨基青霉烷酸（6-APA）：7-氨基頭孢烷酸（7-ACA4果葡糖漿葡萄糖異構(gòu)酶青霉素?；?-氨基青霉烷酸果葡糖漿葡萄糖異構(gòu)酶青霉素?；?-氨基青霉烷酸5Immobilization,

Why

？EnzymepropertiesImmobilizedEnzymeor

cell？CarrierpropertiesImmobilizedeffectImmobilizedMethods&ParametersGroup,charge&hydrophobicityImmobilization,Why？EnzymeImm6Contentsofchapter44.2固定化的載體和方法4.3固定化酶的性質(zhì)GoGo4.1固定化的目的和定義Go4.4應(yīng)用實例GoContentsofchapter44.2固定化的載74.1固定化的目的和定義4.1固定化的目的和定義8Why？成本高生產(chǎn)過程難以連續(xù)產(chǎn)物分離困難利用率低穩(wěn)定性差反應(yīng)過程難以控制游離酶/細胞:Why？成本高生產(chǎn)過程產(chǎn)物分離利用率低穩(wěn)定性差反應(yīng)過程難以控9Why？成本↓反復/連續(xù)生產(chǎn)過程產(chǎn)物分離容易利用率↑穩(wěn)定性↑固定化酶/細胞:反應(yīng)過程易控制Why？成本↓反復/連續(xù)產(chǎn)物分離利用率↑穩(wěn)定性↑固定化酶/細10

固定化酶/細胞技術(shù)是指利用物理或化學特定的手段，將游離的酶或細胞定位，或限制于特定的空間區(qū)域，使其保持催化活性，并可反復使用的技術(shù)。定義固定化酶酶需要分離純化；酶活力有損失；不適合多酶反應(yīng)；催化效率高，節(jié)省空間固定化細胞無需酶的分離純化酶活損失小，更穩(wěn)定多酶體系，無需輔酶再生生產(chǎn)成本低定義固定化酶固定化細胞114.2固定化的載體和方法4.2固定化的載體和方法12Carriers化學性質(zhì)要求親水性/疏水性膨脹系數(shù)——低穩(wěn)定性——高形態(tài)學性質(zhì)要求粒徑小，粒度分布窄內(nèi)表面積——大孔徑——足夠大機械性質(zhì)要求耐壓性——高可壓縮性——低彈性——足夠其他要求來源——廣泛成本——低食品級（用于食品工業(yè)）Carriers化學性質(zhì)要求形態(tài)學性質(zhì)要求機械性質(zhì)要求其他要13載體孔徑大于酶分子大小，以保證酶構(gòu)象的自由變化，提高酶活，降低空間位阻。被吸附到空穴內(nèi)壁的酶分子EupergitC孔徑10-20nm酶活力較低依賴于孔徑Eupergit250L孔徑＞100nm酶活力高酶負載高載體孔徑及分布載體孔徑大于酶被吸附到空穴內(nèi)壁的酶分子EupergitCE14擴散限制可以克服時，載體最小孔徑是多少？rp＞20+de一般最小孔徑2rp=40+2de酶直徑de孔半徑rp若酶分子直徑5nm，最小載體孔徑應(yīng)為50nm擴散限制可以克服時，載體最小孔徑是多少？rp＞20+de酶直15孔徑、比表面積、酶負載量的關(guān)系該圖中隨孔徑增大，酶所占據(jù)的內(nèi)表面積越小，酶負載量越小。固定化酶的比活力起初隨孔徑增大而減小；載體孔徑大于60nm時，酶活力增加，說明擴散限制越來越小。菊糖酶固定在可控孔的二氧化硅載體上孔徑、比表面積、酶負載量的關(guān)系該圖中隨孔徑增大，酶所占據(jù)的內(nèi)16無機載體高壓穩(wěn)定性攪拌器中易受磨損vs多孔玻璃SiO2硅藻土SiO2斑脫土(膨潤土)Al2Mg3Si4H2O121.5g青霉素酰化酶/1g斑脫土無機載體高壓穩(wěn)攪拌器中vs多孔玻璃硅藻土斑脫土(膨潤土)117無機載體應(yīng)用功能基團制造商多孔玻璃SiO2實驗室-OHCorning(USA)Waters(USA)Schuller(D)多孔硅膠SiO2工業(yè)規(guī)模-OHGrace(USA)（商品名Deloxan?）Solvay(D)Degussa(D)明礬硅石-OH介孔分子篩MCM-41實驗室無機載體應(yīng)用功能基團制造商多孔玻璃SiO2實驗室-OHCor18有機載體——天然高分子，如多糖類與蛋白質(zhì)的相容性較好瓊脂糖寬網(wǎng)狀，親水性，與酶作用弱，酶不易失活纖維素功能化：CM(羧甲基)-纖維素DEAE(二乙基氨基乙基)-纖維素工業(yè)：DEAE-纖維素用于葡萄糖異構(gòu)酶固定化，1986葡聚糖機械穩(wěn)定性低，來源受限水溶性，實驗室實驗室有機載體——天然高分子，如多糖類與蛋白質(zhì)的瓊脂糖纖維素功能化19有機載體——合成聚合物載體化學和機械穩(wěn)定性高性能優(yōu)良操作簡單離子交換樹脂聚甲基丙烯酸衍生物聚丙烯酸酯衍生物固定化脂肪酶催化非水系統(tǒng)反應(yīng)有機載體——合成聚合物載體化學和機械性能優(yōu)良離子交換樹脂聚甲20新型載體磁性高分子微球高分子復配載體：兩種及以上高分子體系，經(jīng)氫鍵、疏水作用等次級鍵聚集，生物相容，傳質(zhì)性能好。海藻酸+聚丙烯，聚乙烯亞胺-卡拉膠，硅膠-海藻酸鈣……聚合物納米凝膠包埋辣根過氧化物酶，提高穩(wěn)定性，保持酶在有機溶劑中的活力納米載體介孔磁性載體固定化微生物用于污水處理，COD去除率可達82.7%新型載體磁性高分子微球高分子復配載體：海藻酸+聚丙烯，聚乙烯21微膠囊（半透膜）

凝膠

Methods包埋（可溶形式）

載體固定化交聯(lián)

通過化學鍵與載體連接

吸附

離子鍵結(jié)合

配位結(jié)合

共價結(jié)合

微膠囊（半透膜）凝膠22(1)吸附法1916年Nellson&Griffin木炭固定蔗糖酶簡易，可逆性載體重復使用避免化學修飾保持酶活(1)吸附法1916年Nellson&Griffin23酶吸附固定化的不同方法離子吸附生物特異性非特異性配位疏水作用酶吸附固定化的不同方法離子吸附生物特異性非特異性配位疏水作用24pH7.0~7.5氨基酰化酶酶液0.05mol/LNaOH，水洗滌DEAE-SephadexA251g/60mL酶液冷庫攪拌吸附過夜吸去上清液4℃?zhèn)溆盟?，醋酸鈉溶液洗滌固定化酶活力回收：50%~60%；600~800mol/(hg)濕固定化酶最早應(yīng)用于工業(yè)化的固定化酶pH7.0~7.50.05mol/LNaOH，水洗滌125(2)共價法A-活性氨基酸殘基；B-載體上的官能團C-載體；D-間隔臂酶與載體連接牢固，穩(wěn)定性高，但酶易失活(2)共價法A-活性氨基酸殘基；B-載體上的官能團酶與載體26不同氨基酸殘基的活性官能團載體的結(jié)合官能團酶的結(jié)合官能團天然高分子載體人工合成高聚物載體不同氨基酸殘基的活性官能團載體的結(jié)合官能團酶的結(jié)合官能團天然27載體與酶的共價結(jié)合模式1重氮化2疊氮化3烷基化和芳基化4溴化氰5Schiff堿6Ugi反應(yīng)7酰胺化8巰基-二硫鍵變換反應(yīng)9Mercury-酶相互作用10氧化11肽鍵載體的結(jié)合官能團酶的結(jié)合官能團載體需事先活化載體與酶的共價結(jié)合模式1重氮化2疊氮化載體的結(jié)合28重氮化反應(yīng)舉例：含-NH2載體與異硫氰酸反應(yīng)酶中游離氨基、組氨酸咪唑基、酪氨酸的酚基參與反應(yīng)用于固定酪氨酸含量較高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶重氮化反應(yīng)舉例：含-NH2載體與異硫氰酸反應(yīng)酶中游離氨基、組29舉例：含-COOH載體,如CMC酶中游離氨基參與反應(yīng)與琥珀酰亞胺反應(yīng)與氯化亞砜反應(yīng)舉例：含-COOH載體,如CMC酶中游離氨基與琥珀酰亞胺反30舉例：含-COOH載體,如CMC與酶中游離氨基、巰基、羥基、酚羥基反應(yīng)疊氮化反應(yīng)酯化酰肼衍生物疊氮衍生物舉例：含-COOH載體,如CMC與酶中游離氨基、巰基、羥基31舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基反應(yīng)與溴化氰反應(yīng)活潑的亞胺碳酸酯條件溫和舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基反應(yīng)與溴化氰32舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基、巰基反應(yīng)與三氯均三嗪反應(yīng)磺?；磻?yīng)環(huán)氧化反應(yīng)，如Eupergit舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基、巰基反應(yīng)與33舉例：含硅無機載體方法一：載體表面包覆有機層（如瓊脂糖、葡聚糖、白蛋白），或用表面聚合法“鍍上”一層聚合物，再對包覆后的表面活化方法二：利用有機硅試劑直接活化硅羥基舉例：含硅無機載體方法一：載體表面包覆有機層（如瓊脂糖、葡聚34蒸餾水1mL,1mol/LHCl1mL，5%NaNO21mLABSE-交聯(lián)瓊脂3g冰水浴，15min，洗去NO2-4℃?zhèn)溆?mol/LNa2CO3調(diào)節(jié)pH7.0，冰水浴2hABSE-交聯(lián)瓊脂固定化堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶約300u，BSA20mg，NaCl，MgSO4，ZnSO4溶液重氮鹽ABSE：對氨基苯磺酰乙基蒸餾水1mL,1mol/LHCl1mL，5%N35(3)包埋法不涉及化學修飾，條件溫和，酶活力回收率高凝膠包埋法：酶分子包在高聚物格子中(3)包埋法不涉及化學修飾，條件凝膠包埋法：36i.天然凝膠包埋法海藻酸鈉+細胞+酶CaCl2溶液其他天然凝膠：明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等i.天然凝膠包埋法海藻酸鈉CaCl2溶液其他天然凝膠：37噴射切割器噴射切割器38注射方法得藻酸鹽球珠噴射切割器得藻酸鹽球珠注射方法得藻酸鹽球珠噴射切割器得藻酸鹽球珠39ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠的合成與酶的包埋——

網(wǎng)格型丙烯酰胺BISBIS：N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠的合成與酶的包埋40美國Altus公司已上市10個產(chǎn)品，年利潤百萬美元。影響因素：交聯(lián)劑、介質(zhì)、溫度，pH，離子強度，緩沖液種類，添加劑等酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸緩沖液（pH7.Corning，Valio，Suminoto，SnamProgettiExamples：甜味劑工業(yè)酶分子包在高聚物格子中界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜將酶包埋。異麥芽酮糖：蔗糖變位酶用于固定酪氨酸含量較高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶n-丁醇4200m3D-間隔臂如：疏水的酰亞胺酯修飾酵母醇脫氫酶，可定量吸附在XAD-7多聚體小珠上。1.酶2.單體+交聯(lián)劑3.起始劑4.攪拌分散1.酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸緩沖液（pH7.3）2.丙烯酰胺單體15~30%BIS交聯(lián)劑5%3.起始劑：0.6mLTEMED，200mg過硫酸銨緩沖液4.1mL失水山梨醇半油酸酯，400mL甲苯-氯仿固定化酶顆粒100~200μm珠狀聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法氮氣，4℃，30minBIS：N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺；TEMED：四甲基乙二胺攪拌分散美國Altus公司已上市10個產(chǎn)品，年利潤百萬美元。1.酶411.酶2.單體+交聯(lián)劑3.起始劑1.1kg濕重E.coli懸浮于2L0.9%NaCl，8℃2.丙烯酰胺單體750g，BIS交聯(lián)劑2.4L，8℃聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌（天冬氨酸酶）3.100mLβ-二甲基氨基丙腈，500mL，1%過硫酸鉀（起始劑）20~25℃到30℃時冰水迅速冷卻凝膠切成3~4mm3的立方體ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法15~20min1.酶1.1kg濕重E.2.丙烯酰胺單體750g，42來自小牛腸黏膜的純堿性磷酸酶（ALP）被四甲氧基硅烷（TMOS）溶膠-凝膠固定化后活力回收30%，與溶液酶相比，穩(wěn)定性提高。iii.溶膠-凝膠包埋法將無機硅源前驅(qū)體與酶混合，水解、縮合反應(yīng)，得透明溶膠，經(jīng)陳化、聚合形成多孔凝膠，即得固定化酶來自小牛腸黏膜的純堿性磷酸酶（ALP）被四甲氧基iii.溶43B.微囊化：以物理方式將酶包封于半透膜內(nèi)微囊內(nèi)徑幾微米-幾百微米，酶關(guān)在不同構(gòu)型半透膜外殼內(nèi)，小分子自由進出，避免酶失活。酶被膠囊膜限制在內(nèi)部，底物或產(chǎn)物可以自由擴散。微膠囊材料：聚酰胺膜、火棉膠膜等B.微囊化：以物理方式將酶包封于半透膜內(nèi)酶被膠囊膜限制在內(nèi)44界面沉淀法制備微膠囊乳化油包水的微滴加入高聚物高聚物在油水界面上沉淀、析出，將酶包埋界面沉淀法制備微膠囊乳化油包水加入高聚物高聚物在油水界45微膠囊制備方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜將酶包埋。界面聚合法：親水性單體+疏水性單體在界面發(fā)生聚合將酶包埋。二級乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次級乳化液，而后將聚合物溶液固化。脂質(zhì)體包埋法：類似于“細胞質(zhì)膜”式的結(jié)構(gòu)。聚電解質(zhì)絡(luò)合法：如海藻酸鈉與聚賴氨酸通過靜電作用結(jié)合。微膠囊制備方法46(4)交聯(lián)法利用雙功能試劑進行酶之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能試劑間形成共價鍵，得到三維交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。常用的交聯(lián)試劑戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（hexamethylenediamine順丁烯二酸酐（maleicanhydride）(4)交聯(lián)法利用雙功能試劑進行酶之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功47A.酶分子之間的交聯(lián)B.酶與水不溶性載體交聯(lián)A.酶分子之間的交聯(lián)B.酶與水不溶性載體交聯(lián)48A.酶分子間的戊二醛交聯(lián)：氨基的交聯(lián)反應(yīng)交聯(lián)時的pH值一般與酶的等電點pI相同A.酶分子間的戊二醛交聯(lián)：49交聯(lián)酶晶體CLEC：將純酶晶體進行交聯(lián)，底物和產(chǎn)物擴散通過2-5nm微孔通道進行。高純度、高活性、高生產(chǎn)效率如：核糖核酸酶A、枯草芽孢桿菌蛋白酶、羧肽酶B以及醇脫氫酶的交聯(lián)酶晶體。美國Altus公司已上市10個產(chǎn)品，年利潤百萬美元。交聯(lián)酶聚集體CLEA：通過合適的沉淀劑，如：硫酸銨、叔丁醇和PEG將酶沉淀，同時保留活性可達100%，然后用戊二醛交聯(lián)。交聯(lián)酶晶體CLEC：將純酶晶體進行交聯(lián)，底物交聯(lián)酶聚集體CL502.5%戊二醛溶液2mL胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.2mol/LpH6醋酸緩沖液攪拌1~3h凝膠在勻漿器內(nèi)粉碎檢測A280水洗去游離戊二醛和酶戊二醛交聯(lián)胰凝乳蛋白酶戊二醛終濃度0.3~0.6%得最好的活力回收2.5%戊二醛溶液胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.251B.酶與載體交聯(lián)：采用交聯(lián)劑將酶分子偶聯(lián)到水不溶性載體上，形成水不溶性的固定化酶。B.酶與載體交聯(lián)：52交聯(lián)酶的特性：a.交聯(lián)得到的固定化酶/固定化菌體結(jié)合牢固，酶很難脫落，可長期使用。b.交聯(lián)反應(yīng)條件劇烈，而且交聯(lián)需酶分子中的多個基團同時參與，致使酶活力損失較大c.制成的固定化酶/菌體顆粒較小雙重固定化法包埋+交聯(lián)吸附+交聯(lián)交聯(lián)酶的特性：53傳統(tǒng)固定化方法的比較特征載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法離子吸附法物理吸附法共價結(jié)合法制備易易難中較難結(jié)合力中弱強強強酶活性高高中或低低高載體再生性較容易容易難不能再生不能再生底物專一性不變不變可變可變不變穩(wěn)定性中低高高高固定化成本低低高中中或高抗微生物能力無無無可能較強傳統(tǒng)固定化方法的比較特征載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法離子吸附法物理54(5)非傳統(tǒng)固定化方法修飾-吸附法如：單甲氧基PEG(1900)以NPCF（氯甲酸對硝基苯酯）活化，使玫瑰假絲酵母脂酶PEG化，增加酶活。To：酶難以吸附在載體，或吸附量低(5)非傳統(tǒng)固定化方法修飾-吸附法如：單甲氧基PEG(1955吸附-包埋法如：兩步法來自放線菌的青霉素V酰基轉(zhuǎn)移酶固定：a.酶吸附于硅藻土，b.包埋于聚丙烯酰胺凝膠如：來自黑曲霉的葡糖淀粉酶固定化（可穩(wěn)定21天）：a.吸附于糊化的玉米淀粉上，b.包埋于藻酸鹽纖維中。To：酶容易從載體表面脫離吸附-包埋法如：兩步法來自放線菌的青霉素V?；D(zhuǎn)移酶固定：T56吸附-交聯(lián)法如：青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶吸附固定在殼聚糖、瓊脂糖、苯氧乙酰纖維素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等不同載體上，再用戊二醛交聯(lián)。在60℃下穩(wěn)定性比自由酶提高10倍以上。To：酶容易流失，穩(wěn)定性差吸附-交聯(lián)法如：青霉素G?；D(zhuǎn)移酶吸附固定在殼聚糖、瓊脂糖、574mL堿性蛋白酶液離子交換樹脂DowerMWA-11g,用多種緩沖液洗滌pH6.51%戊二醛溶液活力回收率27%過濾，磷酸鉀緩沖液洗滌吸附交聯(lián)法固定堿性蛋白酶0℃，1h4mL堿性蛋白酶液離子交換樹脂DowerMWA-1pH58修飾-包埋法酶先共價結(jié)合明膠、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共軛物再被包埋進凝膠基質(zhì)中。如：天然牛血清胺氧化酶PEG化，再與水凝膠作用

To：包埋酶流失修飾-包埋法酶先共價結(jié)合明膠、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共59修飾后固定化額外電荷的引入氨基酸殘基的互換疏水性的改變不飽和鍵的引入提高有機溶劑中溶解度環(huán)節(jié)支持物表面的毒性如：疏水的酰亞胺酯修飾酵母醇脫氫酶，可定量吸附在XAD-7多聚體小珠上。修飾后固定化額外電荷的引入如：疏水的酰亞胺酯修飾酵母醇脫氫60固定化酶化學后處理如：固定在CNBr活化瓊脂糖上的黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性，在經(jīng)該酶的糖鏈氨烷化后，借助戊二醛的交聯(lián)，得到明顯改進。固定化酶化學后處理如：固定在CNBr活化瓊脂糖上的黑曲霉的β614.3固定化酶的性質(zhì)4.3固定化酶的性質(zhì)62Properties固定化酶活力固定化酶穩(wěn)定性固定化酶底物特異性最適溫度最適pH值Properties固定化酶固定化酶固定化酶最適溫度最適pH63固定化酶的活力固定化酶活力一般低于天然酶固定化載體與酶的相互作用引起酶活性中心或調(diào)解中心的構(gòu)象發(fā)生了改變，甚至影響了活性中心的氨基酸，從而導致酶活力下降；固定化載體增加了酶分子的活性中心與反應(yīng)底物之間的阻力（載體空隙太小或固定化方式與位置不當），使得底物無法和酶接觸，影響對底物的定位作用，從而降低酶活力；固定化酶的活力固定化酶活力固定化載體與酶的相互作用引起酶活性64固定化酶的穩(wěn)定性固定化后酶分子與載體多點連接，防止酶分子伸展變形；酶分子失去了

分子間相互作用的機會，

抑制了降解，提高了酶的穩(wěn)定性，保存時間延長。固定化酶穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性）一般高于天然酶c.影響因素：交聯(lián)劑、介質(zhì)、溫度，pH，離子強度，緩沖液種類，添加劑等b.對蛋白酶抵抗性增強，對變性劑（如尿素、有機溶劑、鹽酸胍等）耐受性提高，保留較高酶活力；對酶抑制劑、對不同pH值的穩(wěn)定性提高固定化酶的穩(wěn)定性固定化后酶分子與載體固定化酶穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性65酶工程酶和細胞的固定化課件66固定化酶的底物特異性固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有關(guān)。

作用于低分子量底物的酶，特異性無明顯變化（如氨基?；?、葡萄糖氧化酶等）。c.既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，特異性往往會發(fā)生變化。例：固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽的作用保持不變，而對酶蛋白的降解活力僅為游離酶的3%左右原因：載體的空間位阻作用，大分子底物難于接近酶分子固定化酶的底物特異性固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小67固定化酶的最適溫度與游離酶相比，固定化酶的最適溫度一般變化不大，部分酶固定化后最適溫度發(fā)生明顯變化。例1：利用重氮化法制備固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，最適溫度比游離酶高出5～10攝氏度。例2：色氨酸酶與載體共價結(jié)合之后，最適溫度比游離酶高5～15攝氏度。固定化酶的最適溫度與游離酶相比，固定化酶的最適溫度一般變化68b.不同方法固定化同一種酶，最適溫度可能不同。例：氨基酰化酶（游離酶最適60攝氏度）i用DEAE-葡聚糖凝膠為離子結(jié)合載體得到的固定化酶最適溫度為72攝氏度；ii用DEAE-纖維素結(jié)合后，最適溫度為67攝氏度；Iii用烷基化共價結(jié)合后，最適溫度比游離酶有所下降。酶工程酶和細胞的固定化課件69固定化酶的最適pH值酶固定化后最適pH值一般會發(fā)生變化，主要取決于固定化酶所處的微環(huán)境的性質(zhì)b.載體性質(zhì)的影響帶負電載體：最適pH帶正電載體：最適pHc.產(chǎn)物性質(zhì)的影響酸性產(chǎn)物：最適pH堿性產(chǎn)物：最適pH固定化酶的最適pH值酶固定化后最適pH值一般會發(fā)生變化704.4應(yīng)用實例4.4應(yīng)用實例71Examples：甜味劑工業(yè)-D-吡喃葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶-D-呋喃果糖固定化葡萄糖異構(gòu)酶：年產(chǎn)量12-20t（干重），半衰期80~150天，反應(yīng)溫度58~60℃固定化方法：細胞交聯(lián)法（Novo公司）結(jié)晶與離子交換吸附法（Genencor公司）Examples：甜味劑工業(yè)-D-吡喃葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶72固定化β-半乳糖苷酶：半衰期20個月，生產(chǎn)能力2000kg產(chǎn)物/kg催化劑乳糖β-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：基于Eupergit?載體使用固定化酶的公司：Corning，Valio，Suminoto，SnamProgetti葡萄糖+固定化β-半乳糖苷酶：乳糖β-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：73固定化-半乳糖苷酶：處理300t含1~5%棉子糖的糖蜜/d，1990棉子糖-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：酶與微生物Mortierellavinacea菌絲體交聯(lián)使用固定化酶的公司：HokkaidoSugar蔗糖+固定化-半乳糖苷酶：棉子糖-半乳糖苷酶半乳糖固定化方法：74蔗糖蔗糖異構(gòu)酶1-O--D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖異麥芽酮糖+明串珠菌二糖+固定化蔗糖異構(gòu)酶：半衰期8000h以上，生產(chǎn)60000t異麥芽酮糖/a，1987固定化方法：海藻酸鈉交聯(lián)包埋法使用固定化酶的公司：SudzuckerAG，Cerestar，MitsuiSeitoCo.低聚糖蔗糖蔗糖異構(gòu)酶1-O--D-吡喃葡萄糖基-D-呋喃果糖異麥75Examples：抗生素工業(yè)固定化酶1t氨氣45t水10000m3約30℃二甲基氯硅烷300tN,N-二甲基苯胺800t五代氯磷酸600t氨氣160t二氯甲烷4200m3n-丁醇4200m3-40℃青霉素G，1000t6-APA，500t固定化青霉素?；杆馇嗝顾?-APA:6-氨基青霉素烷酸Examples：抗生素工業(yè)固定化酶1t二甲基氯硅烷3076生產(chǎn)商AsahiChem.Ind.DSMRecordati酶來源巨型芽孢桿菌類產(chǎn)堿桿菌大腸桿菌固定化方法共價法，多孔聚丙烯腈共價法，凝膠載體共價法，Eupergit?載體固定化收率未知未知60-70%酶活力未知約200U/mL100-150U/mL,濕載體溫度30-36℃未知37操作穩(wěn)定性約1000h未知高達1000循環(huán)，＞60d青霉素G水解的反應(yīng)條件生產(chǎn)商AsahiChem.Ind.DSMRecordati77Examples：氨基酸生產(chǎn)N-?；?DL-氨基酸?；D(zhuǎn)移酶L-氨基酸N-?；?D-氨基酸+水+?；D(zhuǎn)移酶通過吸附劑固定在離子交換樹脂上Examples：氨基酸生產(chǎn)N-?；??；D(zhuǎn)移酶L-氨基酸N78身體健康，學習進步！身體健康，酶工程酶和細胞的固定化酶工程酶和細胞的固定化80（優(yōu)選）酶工程酶和細胞的固定化（優(yōu)選）酶工程酶和細胞的固定化81果葡糖漿：葡萄糖異構(gòu)酶/木糖異構(gòu)酶異麥芽酮糖：蔗糖變位酶阿斯巴甜：嗜熱菌蛋白酶果葡糖漿：葡萄糖異構(gòu)酶/木糖異構(gòu)酶異麥芽酮糖：蔗糖變位酶阿斯826-氨基青霉烷酸（6-APA）：青霉素?；?-氨基頭孢烷酸（7-ACA）：D-氨基酸氧化酶苯乙醇胺（又用作瘦肉精）：脂肪酶丙烯酰胺：腈水解酶氨基酸：氨基?；?酰脲酶6-氨基青霉烷酸（6-APA）：7-氨基頭孢烷酸（7-ACA83果葡糖漿葡萄糖異構(gòu)酶青霉素?；?-氨基青霉烷酸果葡糖漿葡萄糖異構(gòu)酶青霉素酰化酶6-氨基青霉烷酸84Immobilization,

Why

？EnzymepropertiesImmobilizedEnzymeor

cell？CarrierpropertiesImmobilizedeffectImmobilizedMethods&ParametersGroup,charge&hydrophobicityImmobilization,Why？EnzymeImm85Contentsofchapter44.2固定化的載體和方法4.3固定化酶的性質(zhì)GoGo4.1固定化的目的和定義Go4.4應(yīng)用實例GoContentsofchapter44.2固定化的載864.1固定化的目的和定義4.1固定化的目的和定義87Why？成本高生產(chǎn)過程難以連續(xù)產(chǎn)物分離困難利用率低穩(wěn)定性差反應(yīng)過程難以控制游離酶/細胞:Why？成本高生產(chǎn)過程產(chǎn)物分離利用率低穩(wěn)定性差反應(yīng)過程難以控88Why？成本↓反復/連續(xù)生產(chǎn)過程產(chǎn)物分離容易利用率↑穩(wěn)定性↑固定化酶/細胞:反應(yīng)過程易控制Why？成本↓反復/連續(xù)產(chǎn)物分離利用率↑穩(wěn)定性↑固定化酶/細89

固定化酶/細胞技術(shù)是指利用物理或化學特定的手段，將游離的酶或細胞定位，或限制于特定的空間區(qū)域，使其保持催化活性，并可反復使用的技術(shù)。定義固定化酶酶需要分離純化；酶活力有損失；不適合多酶反應(yīng)；催化效率高，節(jié)省空間固定化細胞無需酶的分離純化酶活損失小，更穩(wěn)定多酶體系，無需輔酶再生生產(chǎn)成本低定義固定化酶固定化細胞904.2固定化的載體和方法4.2固定化的載體和方法91Carriers化學性質(zhì)要求親水性/疏水性膨脹系數(shù)——低穩(wěn)定性——高形態(tài)學性質(zhì)要求粒徑小，粒度分布窄內(nèi)表面積——大孔徑——足夠大機械性質(zhì)要求耐壓性——高可壓縮性——低彈性——足夠其他要求來源——廣泛成本——低食品級（用于食品工業(yè)）Carriers化學性質(zhì)要求形態(tài)學性質(zhì)要求機械性質(zhì)要求其他要92載體孔徑大于酶分子大小，以保證酶構(gòu)象的自由變化，提高酶活，降低空間位阻。被吸附到空穴內(nèi)壁的酶分子EupergitC孔徑10-20nm酶活力較低依賴于孔徑Eupergit250L孔徑＞100nm酶活力高酶負載高載體孔徑及分布載體孔徑大于酶被吸附到空穴內(nèi)壁的酶分子EupergitCE93擴散限制可以克服時，載體最小孔徑是多少？rp＞20+de一般最小孔徑2rp=40+2de酶直徑de孔半徑rp若酶分子直徑5nm，最小載體孔徑應(yīng)為50nm擴散限制可以克服時，載體最小孔徑是多少？rp＞20+de酶直94孔徑、比表面積、酶負載量的關(guān)系該圖中隨孔徑增大，酶所占據(jù)的內(nèi)表面積越小，酶負載量越小。固定化酶的比活力起初隨孔徑增大而減?。惠d體孔徑大于60nm時，酶活力增加，說明擴散限制越來越小。菊糖酶固定在可控孔的二氧化硅載體上孔徑、比表面積、酶負載量的關(guān)系該圖中隨孔徑增大，酶所占據(jù)的內(nèi)95無機載體高壓穩(wěn)定性攪拌器中易受磨損vs多孔玻璃SiO2硅藻土SiO2斑脫土(膨潤土)Al2Mg3Si4H2O121.5g青霉素酰化酶/1g斑脫土無機載體高壓穩(wěn)攪拌器中vs多孔玻璃硅藻土斑脫土(膨潤土)196無機載體應(yīng)用功能基團制造商多孔玻璃SiO2實驗室-OHCorning(USA)Waters(USA)Schuller(D)多孔硅膠SiO2工業(yè)規(guī)模-OHGrace(USA)（商品名Deloxan?）Solvay(D)Degussa(D)明礬硅石-OH介孔分子篩MCM-41實驗室無機載體應(yīng)用功能基團制造商多孔玻璃SiO2實驗室-OHCor97有機載體——天然高分子，如多糖類與蛋白質(zhì)的相容性較好瓊脂糖寬網(wǎng)狀，親水性，與酶作用弱，酶不易失活纖維素功能化：CM(羧甲基)-纖維素DEAE(二乙基氨基乙基)-纖維素工業(yè)：DEAE-纖維素用于葡萄糖異構(gòu)酶固定化，1986葡聚糖機械穩(wěn)定性低，來源受限水溶性，實驗室實驗室有機載體——天然高分子，如多糖類與蛋白質(zhì)的瓊脂糖纖維素功能化98有機載體——合成聚合物載體化學和機械穩(wěn)定性高性能優(yōu)良操作簡單離子交換樹脂聚甲基丙烯酸衍生物聚丙烯酸酯衍生物固定化脂肪酶催化非水系統(tǒng)反應(yīng)有機載體——合成聚合物載體化學和機械性能優(yōu)良離子交換樹脂聚甲99新型載體磁性高分子微球高分子復配載體：兩種及以上高分子體系，經(jīng)氫鍵、疏水作用等次級鍵聚集，生物相容，傳質(zhì)性能好。海藻酸+聚丙烯，聚乙烯亞胺-卡拉膠，硅膠-海藻酸鈣……聚合物納米凝膠包埋辣根過氧化物酶，提高穩(wěn)定性，保持酶在有機溶劑中的活力納米載體介孔磁性載體固定化微生物用于污水處理，COD去除率可達82.7%新型載體磁性高分子微球高分子復配載體：海藻酸+聚丙烯，聚乙烯100微膠囊（半透膜）

凝膠

Methods包埋（可溶形式）

載體固定化交聯(lián)

通過化學鍵與載體連接

吸附

離子鍵結(jié)合

配位結(jié)合

共價結(jié)合

微膠囊（半透膜）凝膠101(1)吸附法1916年Nellson&Griffin木炭固定蔗糖酶簡易，可逆性載體重復使用避免化學修飾保持酶活(1)吸附法1916年Nellson&Griffin102酶吸附固定化的不同方法離子吸附生物特異性非特異性配位疏水作用酶吸附固定化的不同方法離子吸附生物特異性非特異性配位疏水作用103pH7.0~7.5氨基?；该敢?.05mol/LNaOH，水洗滌DEAE-SephadexA251g/60mL酶液冷庫攪拌吸附過夜吸去上清液4℃?zhèn)溆盟?，醋酸鈉溶液洗滌固定化酶活力回收：50%~60%；600~800mol/(hg)濕固定化酶最早應(yīng)用于工業(yè)化的固定化酶pH7.0~7.50.05mol/LNaOH，水洗滌1104(2)共價法A-活性氨基酸殘基；B-載體上的官能團C-載體；D-間隔臂酶與載體連接牢固，穩(wěn)定性高，但酶易失活(2)共價法A-活性氨基酸殘基；B-載體上的官能團酶與載體105不同氨基酸殘基的活性官能團載體的結(jié)合官能團酶的結(jié)合官能團天然高分子載體人工合成高聚物載體不同氨基酸殘基的活性官能團載體的結(jié)合官能團酶的結(jié)合官能團天然106載體與酶的共價結(jié)合模式1重氮化2疊氮化3烷基化和芳基化4溴化氰5Schiff堿6Ugi反應(yīng)7酰胺化8巰基-二硫鍵變換反應(yīng)9Mercury-酶相互作用10氧化11肽鍵載體的結(jié)合官能團酶的結(jié)合官能團載體需事先活化載體與酶的共價結(jié)合模式1重氮化2疊氮化載體的結(jié)合107重氮化反應(yīng)舉例：含-NH2載體與異硫氰酸反應(yīng)酶中游離氨基、組氨酸咪唑基、酪氨酸的酚基參與反應(yīng)用于固定酪氨酸含量較高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶重氮化反應(yīng)舉例：含-NH2載體與異硫氰酸反應(yīng)酶中游離氨基、組108舉例：含-COOH載體,如CMC酶中游離氨基參與反應(yīng)與琥珀酰亞胺反應(yīng)與氯化亞砜反應(yīng)舉例：含-COOH載體,如CMC酶中游離氨基與琥珀酰亞胺反109舉例：含-COOH載體,如CMC與酶中游離氨基、巰基、羥基、酚羥基反應(yīng)疊氮化反應(yīng)酯化酰肼衍生物疊氮衍生物舉例：含-COOH載體,如CMC與酶中游離氨基、巰基、羥基110舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基反應(yīng)與溴化氰反應(yīng)活潑的亞胺碳酸酯條件溫和舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基反應(yīng)與溴化氰111舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基、巰基反應(yīng)與三氯均三嗪反應(yīng)磺?；磻?yīng)環(huán)氧化反應(yīng)，如Eupergit舉例：含-OH載體,如多糖與酶中游離氨基、羥基、巰基反應(yīng)與112舉例：含硅無機載體方法一：載體表面包覆有機層（如瓊脂糖、葡聚糖、白蛋白），或用表面聚合法“鍍上”一層聚合物，再對包覆后的表面活化方法二：利用有機硅試劑直接活化硅羥基舉例：含硅無機載體方法一：載體表面包覆有機層（如瓊脂糖、葡聚113蒸餾水1mL,1mol/LHCl1mL，5%NaNO21mLABSE-交聯(lián)瓊脂3g冰水浴，15min，洗去NO2-4℃?zhèn)溆?mol/LNa2CO3調(diào)節(jié)pH7.0，冰水浴2hABSE-交聯(lián)瓊脂固定化堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶約300u，BSA20mg，NaCl，MgSO4，ZnSO4溶液重氮鹽ABSE：對氨基苯磺酰乙基蒸餾水1mL,1mol/LHCl1mL，5%N114(3)包埋法不涉及化學修飾，條件溫和，酶活力回收率高凝膠包埋法：酶分子包在高聚物格子中(3)包埋法不涉及化學修飾，條件凝膠包埋法：115i.天然凝膠包埋法海藻酸鈉+細胞+酶CaCl2溶液其他天然凝膠：明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等i.天然凝膠包埋法海藻酸鈉CaCl2溶液其他天然凝膠：116噴射切割器噴射切割器117注射方法得藻酸鹽球珠噴射切割器得藻酸鹽球珠注射方法得藻酸鹽球珠噴射切割器得藻酸鹽球珠118ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠的合成與酶的包埋——

網(wǎng)格型丙烯酰胺BISBIS：N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠的合成與酶的包埋119美國Altus公司已上市10個產(chǎn)品，年利潤百萬美元。影響因素：交聯(lián)劑、介質(zhì)、溫度，pH，離子強度，緩沖液種類，添加劑等酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸緩沖液（pH7.Corning，Valio，Suminoto，SnamProgettiExamples：甜味劑工業(yè)酶分子包在高聚物格子中界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜將酶包埋。異麥芽酮糖：蔗糖變位酶用于固定酪氨酸含量較高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶n-丁醇4200m3D-間隔臂如：疏水的酰亞胺酯修飾酵母醇脫氫酶，可定量吸附在XAD-7多聚體小珠上。1.酶2.單體+交聯(lián)劑3.起始劑4.攪拌分散1.酵母乳糖酶（100mg）溶于56mL磷酸緩沖液（pH7.3）2.丙烯酰胺單體15~30%BIS交聯(lián)劑5%3.起始劑：0.6mLTEMED，200mg過硫酸銨緩沖液4.1mL失水山梨醇半油酸酯，400mL甲苯-氯仿固定化酶顆粒100~200μm珠狀聚丙烯酰胺包埋β-半乳糖苷酶ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法氮氣，4℃，30minBIS：N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺；TEMED：四甲基乙二胺攪拌分散美國Altus公司已上市10個產(chǎn)品，年利潤百萬美元。1.酶1201.酶2.單體+交聯(lián)劑3.起始劑1.1kg濕重E.coli懸浮于2L0.9%NaCl，8℃2.丙烯酰胺單體750g，BIS交聯(lián)劑2.4L，8℃聚丙烯酰胺包埋大腸桿菌（天冬氨酸酶）3.100mLβ-二甲基氨基丙腈，500mL，1%過硫酸鉀（起始劑）20~25℃到30℃時冰水迅速冷卻凝膠切成3~4mm3的立方體ii.聚丙烯酰胺凝膠包埋法15~20min1.酶1.1kg濕重E.2.丙烯酰胺單體750g，121來自小牛腸黏膜的純堿性磷酸酶（ALP）被四甲氧基硅烷（TMOS）溶膠-凝膠固定化后活力回收30%，與溶液酶相比，穩(wěn)定性提高。iii.溶膠-凝膠包埋法將無機硅源前驅(qū)體與酶混合，水解、縮合反應(yīng)，得透明溶膠，經(jīng)陳化、聚合形成多孔凝膠，即得固定化酶來自小牛腸黏膜的純堿性磷酸酶（ALP）被四甲氧基iii.溶122B.微囊化：以物理方式將酶包封于半透膜內(nèi)微囊內(nèi)徑幾微米-幾百微米，酶關(guān)在不同構(gòu)型半透膜外殼內(nèi)，小分子自由進出，避免酶失活。酶被膠囊膜限制在內(nèi)部，底物或產(chǎn)物可以自由擴散。微膠囊材料：聚酰胺膜、火棉膠膜等B.微囊化：以物理方式將酶包封于半透膜內(nèi)酶被膠囊膜限制在內(nèi)123界面沉淀法制備微膠囊乳化油包水的微滴加入高聚物高聚物在油水界面上沉淀、析出，將酶包埋界面沉淀法制備微膠囊乳化油包水加入高聚物高聚物在油水界124微膠囊制備方法界面沉淀法：某些聚合物在油水界面上溶解度降低而形成的薄膜將酶包埋。界面聚合法：親水性單體+疏水性單體在界面發(fā)生聚合將酶包埋。二級乳化法：酶先在聚合物相中分散乳化，再分散于水中形成次級乳化液，而后將聚合物溶液固化。脂質(zhì)體包埋法：類似于“細胞質(zhì)膜”式的結(jié)構(gòu)。聚電解質(zhì)絡(luò)合法：如海藻酸鈉與聚賴氨酸通過靜電作用結(jié)合。微膠囊制備方法125(4)交聯(lián)法利用雙功能試劑進行酶之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能試劑間形成共價鍵，得到三維交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。常用的交聯(lián)試劑戊二醛（glutaraldehyde）己二胺（hexamethylenediamine順丁烯二酸酐（maleicanhydride）(4)交聯(lián)法利用雙功能試劑進行酶之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功126A.酶分子之間的交聯(lián)B.酶與水不溶性載體交聯(lián)A.酶分子之間的交聯(lián)B.酶與水不溶性載體交聯(lián)127A.酶分子間的戊二醛交聯(lián)：氨基的交聯(lián)反應(yīng)交聯(lián)時的pH值一般與酶的等電點pI相同A.酶分子間的戊二醛交聯(lián)：128交聯(lián)酶晶體CLEC：將純酶晶體進行交聯(lián)，底物和產(chǎn)物擴散通過2-5nm微孔通道進行。高純度、高活性、高生產(chǎn)效率如：核糖核酸酶A、枯草芽孢桿菌蛋白酶、羧肽酶B以及醇脫氫酶的交聯(lián)酶晶體。美國Altus公司已上市10個產(chǎn)品，年利潤百萬美元。交聯(lián)酶聚集體CLEA：通過合適的沉淀劑，如：硫酸銨、叔丁醇和PEG將酶沉淀，同時保留活性可達100%，然后用戊二醛交聯(lián)。交聯(lián)酶晶體CLEC：將純酶晶體進行交聯(lián)，底物交聯(lián)酶聚集體CL1292.5%戊二醛溶液2mL胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.2mol/LpH6醋酸緩沖液攪拌1~3h凝膠在勻漿器內(nèi)粉碎檢測A280水洗去游離戊二醛和酶戊二醛交聯(lián)胰凝乳蛋白酶戊二醛終濃度0.3~0.6%得最好的活力回收2.5%戊二醛溶液胰凝乳蛋白酶500mg溶于5mL0.2130B.酶與載體交聯(lián)：采用交聯(lián)劑將酶分子偶聯(lián)到水不溶性載體上，形成水不溶性的固定化酶。B.酶與載體交聯(lián)：131交聯(lián)酶的特性：a.交聯(lián)得到的固定化酶/固定化菌體結(jié)合牢固，酶很難脫落，可長期使用。b.交聯(lián)反應(yīng)條件劇烈，而且交聯(lián)需酶分子中的多個基團同時參與，致使酶活力損失較大c.制成的固定化酶/菌體顆粒較小雙重固定化法包埋+交聯(lián)吸附+交聯(lián)交聯(lián)酶的特性：132傳統(tǒng)固定化方法的比較特征載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法離子吸附法物理吸附法共價結(jié)合法制備易易難中較難結(jié)合力中弱強強強酶活性高高中或低低高載體再生性較容易容易難不能再生不能再生底物專一性不變不變可變可變不變穩(wěn)定性中低高高高固定化成本低低高中中或高抗微生物能力無無無可能較強傳統(tǒng)固定化方法的比較特征載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法離子吸附法物理133(5)非傳統(tǒng)固定化方法修飾-吸附法如：單甲氧基PEG(1900)以NPCF（氯甲酸對硝基苯酯）活化，使玫瑰假絲酵母脂酶PEG化，增加酶活。To：酶難以吸附在載體，或吸附量低(5)非傳統(tǒng)固定化方法修飾-吸附法如：單甲氧基PEG(19134吸附-包埋法如：兩步法來自放線菌的青霉素V酰基轉(zhuǎn)移酶固定：a.酶吸附于硅藻土，b.包埋于聚丙烯酰胺凝膠如：來自黑曲霉的葡糖淀粉酶固定化（可穩(wěn)定21天）：a.吸附于糊化的玉米淀粉上，b.包埋于藻酸鹽纖維中。To：酶容易從載體表面脫離吸附-包埋法如：兩步法來自放線菌的青霉素V?；D(zhuǎn)移酶固定：T135吸附-交聯(lián)法如：青霉素G?；D(zhuǎn)移酶吸附固定在殼聚糖、瓊脂糖、苯氧乙酰纖維素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等不同載體上，再用戊二醛交聯(lián)。在60℃下穩(wěn)定性比自由酶提高10倍以上。To：酶容易流失，穩(wěn)定性差吸附-交聯(lián)法如：青霉素G?；D(zhuǎn)移酶吸附固定在殼聚糖、瓊脂糖、1364mL堿性蛋白酶液離子交換樹脂DowerMWA-11g,用多種緩沖液洗滌pH6.51%戊二醛溶液活力回收率27%過濾，磷酸鉀緩沖液洗滌吸附交聯(lián)法固定堿性蛋白酶0℃，1h4mL堿性蛋白酶液離子交換樹脂DowerMWA-1pH137修飾-包埋法酶先共價結(jié)合明膠、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共軛物再被包埋進凝膠基質(zhì)中。如：天然牛血清胺氧化酶PEG化，再與水凝膠作用

To：包埋酶流失修飾-包埋法酶先共價結(jié)合明膠、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共138修飾后固定化額外電荷的引入氨基酸殘基的互換疏水性的改變不飽和鍵的引入提高有機溶劑中溶解度環(huán)節(jié)支持物表面的毒性如：疏水的酰亞胺酯修飾酵母醇脫氫酶，可定量吸附在XAD-7多聚體小珠上。修飾后固定化額外電荷的引入如：疏水的酰亞胺酯修飾酵母醇脫氫139固定化酶化學后處理如：固定在CNBr活化瓊脂糖上的黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性，在經(jīng)該酶的糖鏈氨烷化后，借助戊二醛的交聯(lián)，得到明顯改進。固定化酶化學后處理如：固定在CNBr活化瓊脂糖上的黑曲霉的β1404.3固定化酶的性質(zhì)4.3固定化酶的性質(zhì)141Properties固定化酶活力固定化酶穩(wěn)定性固定化酶底物特異性最適溫度最適pH值Properties固定化酶固定化酶固定化酶最適溫度最適pH142固定化酶的活力固定化酶活力一般低于天然酶固定化載體與酶的相互作用引起酶活性中心或調(diào)解中心的構(gòu)象發(fā)生了改變，甚至影響了活性中心的氨基酸，從而導致酶活力下降；固定化載體增加了酶分子的活性中心與反應(yīng)底物之間的阻力（載體空隙太小或固定化方式與位置不當），使得底物無法和酶接觸，影響對底物的定位作用，從而降低酶活力；固定化酶的活力固定化酶活力固定化載體與酶的相互作用引起酶活性143固定化酶的穩(wěn)定性固定化后酶分子與載體多點連接，防止酶分子伸展變形；酶分子失去了

分子間相互作用的機會，

抑制了降解，提高了酶的穩(wěn)定性，保存時間延長。固定化酶穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性）一般高于天然酶c.影響因素：交聯(lián)劑、介質(zhì)、溫度，pH，離子強度，緩沖液種類，添加劑等b.對蛋白酶抵抗性增強，對變性劑（如尿素、有機溶劑、鹽酸胍等）耐受性提高，保留較高酶活力；對酶抑制劑、對不同pH值的穩(wěn)定性提高固定化酶的穩(wěn)