小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良

小鼠血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)【摘要】目的建立一種簡單方便但高效的血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。方法改進(jìn)酶消化法。結(jié)果用該法培養(yǎng)細(xì)胞傳代生長快，細(xì)胞純度達(dá)98%以上，足以滿足各種細(xì)胞試驗(yàn)需求。結(jié)論與傳統(tǒng)方法相比該法簡單經(jīng)濟(jì)，試驗(yàn)成功率高，節(jié)省材料和時(shí)間，而且可獲得更多純度較高的細(xì)胞。吳建芳〔1972～〕，女，漢族，青海籍，副教授，碩士【關(guān)鍵詞】小鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)AbstratbjetiveTreateasipleandeffetivepriaryultureethdsfrusevasularsthusleells(VS).ethdsRefredenzyatidigestin.ResultsVSasgrnellandfast,thepurityisrethan98%hihaneetvariuselltests.nlusinparingithtraditinalethds,thisapprahesansaveuhtieandreaterials,alshavebetterellquantitiesandpurity.KeyrdsuseArtaVSPriaryult在心血管疾病的根底研究中，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞生物特性的研究是極其重要的一局部，其對(duì)提醒血管病變機(jī)理至為關(guān)鍵。體外培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞是常用試驗(yàn)?zāi)Ｐ停陙黼S著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的開展，原代培養(yǎng)的成功率有所進(jìn)步，但仍然存在許多問題，經(jīng)歷缺乏者往往要花費(fèi)大量時(shí)間、精力去探索，不但影響試驗(yàn)進(jìn)程而且浪費(fèi)材料，而有些組織材料是極為昂貴且很難獲得的，所以為了進(jìn)步平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率，并在有限的材料下獲得好的結(jié)果，我們大膽采用了酶消化法〔常規(guī)采用組織塊培養(yǎng)法〕，從取材方法及消化步驟等方面進(jìn)展了改進(jìn)，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該法簡單經(jīng)濟(jì)，成功率高，細(xì)胞生長快，純度高，現(xiàn)介紹如下。1材料與試劑1．1組織來源：57BL/6J小鼠(鼠齡8周以后)主動(dòng)脈。1．2試劑：鼠抗S-α-atin,y2njugatedaffinitypurifiedanti-useIgG［H/L］，戊巴比妥鈉注射液。1．3培養(yǎng)基：在DE培養(yǎng)基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、鏈霉素、１％谷氨酰胺，過濾除菌備用〔不要超過四4周〕。1．4酶消化液：llagenaseTypeⅡ7g溶于5lDE培養(yǎng)基中(無血清)，過濾除菌即用。1．5７０％乙醇：用無菌蒸餾水配制。1．6器械、儀器：齒、平鑷，組織、眼科剪，無菌注射器，培養(yǎng)皿，解剖顯微鏡〔Paxa,Vistavisin〕，熒光顯微鏡(LEiADI6000B〕。2方法2．1常規(guī)麻醉小鼠，70％乙醇沖洗頸部和腹部,翻開胸、腹腔,暴露心臟。2．2５L注射器穿刺左心室，PBS緩沖液沖洗主動(dòng)脈。2．3完好別離主動(dòng)脈，放入100無菌平皿，滴1～2滴PBS緩沖液。2．4解剖顯微鏡下撕去血管外膜至血管光滑透明〔如粗糙不平說明外膜去除不干凈〕。2．5取出血管，放入另一有PBS緩沖液的平皿里，轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)操作。2．6眼科剪將血管快速剪成１～２2大小后用膠原酶消化３～４h〔組織塊變成細(xì)胞團(tuán)即可〕。2．7參加DE培養(yǎng)基終止消化并離心傾去上清液，離心管中參加1l新穎培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于１２孔培養(yǎng)板中的一孔，常規(guī)靜置培養(yǎng)。2．8第2天觀察是否有細(xì)菌污染，如有要更換新穎培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)。于第５、６天細(xì)胞生長達(dá)培養(yǎng)皿面積的８０％左右時(shí)可傳代，常規(guī)方法即可。3細(xì)胞鑒定免疫熒光法鑒定平滑肌細(xì)胞：常規(guī)消化，細(xì)胞接種于培養(yǎng)載玻片。第2天用PBS緩沖液輕緩洗滌，加3.7％福爾馬林液在室溫下固定30in后用PBS緩沖液洗滌３次，２in／次。然后用0.1％Tritn-x-100(PBS配制)室溫下浸透細(xì)胞10in，以便抗體更好的進(jìn)入細(xì)胞。用10％山羊血清(PBS配制)封閉非特異性抗原30in，鼠抗S-α-atin〔1:200PBS稀釋〕室溫下孵育細(xì)胞２h，PBS緩沖液洗滌３次，５in／次。以下步驟避光：用熒光標(biāo)記二抗〔1:200PBS稀釋〕在室溫下孵育細(xì)胞１h，PBS緩沖液洗滌３次，５in／次，然后用熒光封片劑封片后在熒光顯微鏡下檢測〔440/510n,Ex/E〕。4結(jié)果細(xì)胞于第2天游離出，第3天沿細(xì)胞團(tuán)成放射狀生長，成梭形，傳代后細(xì)胞生長較快，成典型的峰谷樣生長，細(xì)胞形態(tài)多呈寬大的長梭形，核大一只小鼠的主動(dòng)脈用該法培養(yǎng)，１０天左右即可獲得１０6個(gè)細(xì)胞，傳代生長快，可滿足任何細(xì)胞試驗(yàn)要求。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度達(dá)98%以上，免疫熒光檢測顯示細(xì)胞S-α-atin染色呈陽性，綠色熒光呈束狀，顯示肌絲特征。5討論傳統(tǒng)的原代培養(yǎng)方法［１,２］有兩種，一種是酶消化法，將組織用適宜的酶消化后培養(yǎng)，因除去了阻礙細(xì)胞生長的間質(zhì)，所以產(chǎn)量高，但因步驟繁瑣，易發(fā)生污染且材料消耗較多，只合適培養(yǎng)大塊組織。另一種是組織塊培養(yǎng)法，將組織活體取出后剪切成小塊，貼于瓶壁等待細(xì)胞從組織四周游離出，該法細(xì)胞生長較慢且不一定每塊都長出細(xì)胞，所以成功率不高,但合適組織量少的細(xì)胞培養(yǎng)。目前國內(nèi)平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)多采用組織塊貼壁法［３～６］，因此也存在上述弊端。如何簡化操作、進(jìn)步細(xì)胞培養(yǎng)的成功率？在試驗(yàn)中我們反復(fù)比擬，發(fā)如今傳統(tǒng)的酶消化方法上進(jìn)展改進(jìn)可獲得很好的效果，從而建立了上述改進(jìn)的血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)。該方法將以往復(fù)雜的酶消化過程簡化，大大減少了組織損失及污染時(shí)機(jī)，并簡化了血管別離技術(shù)，使操作容易掌握，可重復(fù)性強(qiáng)，并且所培養(yǎng)的細(xì)胞活力強(qiáng)、生長快。在試驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)如注意以下幾點(diǎn)可大大進(jìn)步培養(yǎng)成功率：第一，要強(qiáng)調(diào)無菌觀念，所用器械要高壓消毒，翻開胸、腹腔時(shí)所用的剪刀和鑷子不再重復(fù)使用，其他器械在使用中要不斷浸到70%乙醇中消毒滅菌，這樣做根本可防止污染。第二，選用鼠齡８以上完全成年的小鼠〔幼小的鼠細(xì)胞含量少〕。第三，使用解剖顯微鏡去除外膜，由于視野放大更能完好干凈的去掉血管外膜。第四，小鼠動(dòng)脈細(xì)小而薄，內(nèi)膜無須刮除。第五，掌握好消化時(shí)間，假如用新穎的膠原酶，消化３h或略長即可，太長的時(shí)間可致細(xì)胞活力喪失。第六，在最初兩天盡可能不要?jiǎng)蛹?xì)胞，以免干擾細(xì)胞貼壁。【參考文獻(xiàn)】［1］司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)［］.第二版.北京:世界圖書出版社，2022［2］盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［］.第二版.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999.439-441［3］王敏,崔連群.動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的改進(jìn)及應(yīng)用［J］.山東醫(yī)藥，2022,44(14)：17-18［4］馮大明,萬載陽.組織塊法培養(yǎng)大鼠腸系膜小動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞［J