常用色譜和光譜分析方法和技術

常用色譜和光譜分析方法和技術色譜分析、光譜分析以及兩譜聯(lián)用技術，構成了藥物分析學科領域中最重要和最基本的研究手段和方法，應用日趨廣泛，發(fā)展十分迅速，新奇方法層出不窮。

新近常用的色譜分析方法：

一、膠囊色譜(MicellarChromatography,MC)又稱擬相液相色譜或假相液相色譜(PseudophaseLC)，是一種新型的液相色譜技術。特點是應用品有高于臨界膠囊（或稱膠束，微胞等）濃度的表面活性劑溶液作為流動相。所謂“膠囊”就是表面活性劑溶液的濃度超過其臨界膠囊濃度(CriticalMicelleConcentration,CMC)時形成的分子聚合體。通常每只膠囊由n個（一般為25～160個）表面活性劑單體分子組成，其形狀為球形或橢圓球形。在CMC值以上的一個較大濃度范圍內，膠囊溶液的某些物理性質（如表面張力、電導等等）以及膠囊自身的大小是不變的。構成膠囊的分子單體與溶液中自由的表面活性劑的分子單體之間存在著迅速的動態(tài)平衡。通常有正相與反相兩種膠囊溶液。前者是由表面活性劑溶于極性溶劑所形成的親水端位于外側而親脂端位于內部的膠囊；后者是指表面活性劑溶于非極性溶劑所形成的親水端位于核心而親脂基位于外面的膠囊。被分離組分與膠囊的互相作用和被分離組分與一般溶劑的作用方式不同，并且被分離組分和兩種膠囊的作用也有差別。改變膠囊的類型、濃度、電荷性質等對被分離組分的色譜行為、淋洗順序以及分離效果均有較大影響。膠囊色譜就是充足運用了被分離組分和膠囊之間存在的靜電作用、疏水作用、增溶作用和空間位阻作用以及其綜合性的協(xié)同作用可獲得一般液相色譜所不能達成的分離效果。合用于化學結構類似、性質差別細微的組分的分離和分析，是一種安全、無毒、經(jīng)濟的優(yōu)越技術。

（一）原理：膠囊溶液是一種微型非均相體系(Microheterogenoussystem)。在膠囊色譜中，分離組分在固定相與水之間、膠囊與水相之間以及固定相與膠囊之間存在著分派平衡。組分的洗脫得為取決于三相之間分派系數(shù)的綜合作用；同時定量地指出分離組分的容量因子k'的倒數(shù)值與膠囊濃度成正比，一般增長膠囊濃度即可獲得較佳的分離效果。

（二）方法特點：與傳統(tǒng)液相色譜的最大區(qū)別在于膠囊色譜流動相是由膠囊及其周邊溶劑介質組成的一種微型的非均相體系，而常規(guī)流動相是一種均相體系。特點：

1、高度的選擇性：因分離組分與膠囊之間存在著靜電、疏水以及空間效應的綜合作用，只要通過流動相中膠囊濃度的改變，就可使分離選擇性獲得改善和提高。此外，通過適當固定相以及表面活性劑的選擇也可提高分離選擇性。

2、便于梯度洗脫：由于表面活性劑的濃度高于CMC后再增大濃度時，溶液中僅膠囊的濃度發(fā)生改變，而表面活性劑單體分子的濃度不變，不影響流動相與固定相的平衡過程，因而比傳統(tǒng)的梯度洗脫技術大大縮短了分析時間，并減少了流動相的消耗，合用于常規(guī)。

3、提高檢測靈敏度：膠囊流動相可增長某些化合物的熒光強度，從而提高檢測靈敏度。還可穩(wěn)定某些化合物在室溫條件下發(fā)生的液體磷光。

4、因分離組分不易分出，故缺陷是柱效低且不適于制備分離。

（三）常用表面活性劑：常用的陽離子表面活性劑重要有：溴化或氯化十六烷基三甲銨(Cetyltrimethylammoniumbromideorchloride,CTMAD或CTMAC)；陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉(SDS)；非離子表面活性劑有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。二、手性分離色譜(ChiralSeparationChromatography,CSC)

是采用色譜技術(TLC、GC和HPLC)分離測定光學異構體藥物的有效方法。由于許多藥物的對映體(Enantiomer)之間在藥理、毒理乃至臨床性質方面存在著較大差異，有必要對某些手性藥物進行對映體的純度檢查。

（一）原理和方法：對映體化合物之間除了對偏振光的偏轉方向恰好相反外，其理化性質是完全相同的，因而難以分離。傳統(tǒng)方法（分步結晶法、酶消化法等）有很大局限性，特別是難以進行微量分離和測定。60年代前后，TLC、GC法逐漸用于對映體化合物的拆分。但這兩種方法只能拆分不多的化合物，且需要較復雜的樣品解決環(huán)節(jié)，制備分離也難以進行。80年代初HPLC法迅速成為藥物對映體分離和測定最為廣泛應用的方法。

HPLC用于手性分離概括起來可分為兩大途徑：間接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。

間接方法重要基于外消旋體混合物經(jīng)柱前衍生化形成一對非對映異構體(Diastereoisomers)。此法又稱為非對映體拆分法或柱前手性衍生化法。由于d-型和l-型對映體的物理性質完全相同，只能在手性固定相上才干獲得拆分；假如運用對映體分子中的反映基團與某一光學純試劑反映形成了非對映光學異構體混合物，其物理性質就有較大的差異，因而可在普通固定相（非手性固定相）上實現(xiàn)分離。本法需高光學純度的手性衍生化試劑(ChiralDerivatizationReagent,CDR)，衍生化反映往往比較繁瑣費時；各對映體衍生化反映的速率有時也不相同。由于可采用價格便宜、柱效較高的非手性柱和通過適當?shù)难苌从晨商岣邫z測的靈敏度，以及衍生化過程中可隨著樣品的純化等優(yōu)點，柱前手性衍生化的方法仍然是當前手性藥物拆分、特別是生物樣品中藥物對映體分離和測定的常用方法。

直接方法重要采用手性流動相添加劑(ChiralMobilePhaseAdditives,CMPA)法和手性固定相(CSP)法。CMPA法又可稱為手性流動相(CMP)拆分法或手性洗脫法。它不必事先將樣品制備成衍生物，而只須將手性劑加入流動相中。手性添加劑與樣品所形成的各種手性絡合物雖然不及CDR法所形成的衍生物那樣牢固，但它所依據(jù)的手性辨認作用和絡合物的非對映異構體性質卻基本相同。常用的CMPA有：環(huán)糊精(Cyclodextrins)類（重要是α-、β-和γ-環(huán)糊精及其衍生物）；手性離子對配合劑(ChiralIonPairComplex,CIPC)，如（+）-10-樟腦磺酸、奎寧和奎尼丁等；以及配位體互換型手性流動相添加劑(ChiralLigand-exchangeComplexes,CLEC)，其中手性配位體多為光活性氨基酸或其衍生物，再與二價金屬離子形成螯合的配位化合物，以適當?shù)臐舛确植加诹鲃酉嘀?，遇有藥物消旋體時即可形成相應的非對映體配位化合物對，然后在正相柱或反相柱上完畢拆分。近年來CSP法發(fā)展迅猛，應用日益廣泛。它是不經(jīng)轉變成非對映體而直接拆分的方法，優(yōu)點是：合用于不含活潑反映基團的化合物；除非必須衍生化，否則無需高光學純度試劑；樣品解決環(huán)節(jié)簡樸。但迄今為止，CSP柱商品已有40多種，價格大多昂貴，尚未有一種具有類似ODS柱的普遍合用性。根據(jù)分子結構選擇合適的CSP柱是非常重要的。常用的CSP有：手性電荷遷移配位體固定相，如Pirkle型HPLC-CSP；蛋白親和配體固定相，如Enantiopac(LKB)；內部配位化合固定相，如環(huán)糊精(Cydobond)和纖維素酯(Chiracel)等；以及配基互換固定相，如L-脯氨酸-Cu2+共價鍵合于聚苯乙烯等基質上。

CSP拆分對映體的理論概念：在HPLC的CSP柱上拆分對映體是運用藥物對映體和特制的、在硅膠上鍵合的對映體固定相（CSP）之間所形成的非對映體復合物。由于非對映體復合物穩(wěn)定性差異，可使兩個對映體的保存時間不一致，與CSP形成穩(wěn)定性較差的非對映體的藥物對映體可先洗脫，因之實現(xiàn)了拆分。CSP設計是基于Dalgliesh在1952年提出的“三點手性辨認模式”(Three-pointchiralrecognitionmodel)，認為要實現(xiàn)手性辨認，在手性化合物分子與CSP之間至少同時要有三個互相作用部位，其中之一必受空間影響，或是互相吸引或是互相排斥。生成的非對映體的相對強度，決定了兩個對映體的分離度和洗脫順序。

（二）三類手性分離方法的比較：CDR法的優(yōu)點是應用條件相對簡易，只需采用普通HPLC的固定相和流動相即可并且通過衍生化有助于增長檢測（紫外或熒光）靈敏度；缺陷是樣品中相關化合物須預先分離、衍生化手性試劑的光學純度的高規(guī)定以及異體對的衍生化反映速率不一。

CMPA法的優(yōu)點是不必作柱前手性衍生化；對固定相也無特殊規(guī)定；樣品的非對映異構化絡合具有可逆性并且利于制備。重要缺陷是可拆分的化合物范圍有限；某些添加劑不夠穩(wěn)定并且往往會干擾檢測。

CSP法的優(yōu)點較多，能廣泛合用于各類化合物，適于常規(guī)及生物樣品的分析測定，制備分離方便，定量分析的可靠性較高，采用此法研究考察的化合物已達數(shù)千種之多。缺陷是樣品有時也須作柱前衍生（但不一定是手性衍生化試劑），對樣品結構有一定限制，其合用性尚不及普通HPLC固定相（涉及正相和反相）那樣廣泛。三、離子色譜(IonChromatography,IC)

是由經(jīng)典的離子互換色譜發(fā)展開創(chuàng)而成的新的液相色譜分析技術，具有快速、靈敏、選擇性好、且可同時測定多組分的優(yōu)點；還能測定無機的或親水性的有機陰離子。IC已廣泛用于其他多個領域，但在醫(yī)藥研究中的應用尚處起始階段。它不僅可用于藥品的常規(guī)質量同時分析，也可有效地用于生產(chǎn)過程的質量控制和體內藥物分析，具有美好的應用前景。

（二）類型特點與原理：陽離子互換柱用于分離樣品陽離子；陰離子互換柱用作分離樣品陰離子。洗脫液為具有陽離子和陰離子的一種稀溶液，經(jīng)泵輸送入色譜柱后，其陽離子或陰離子最終將色譜柱中所有可互換的離子置換出來，同時由檢測器轉換為恒定的信號——基線。然后，進樣少量樣品，樣品離子即被樹脂柱所接受，并與等同數(shù)量的洗脫液離子互換。假如樣品中所有離子的濃度大于洗脫液的離子濃度，那么在柱頂端的總離子濃度就將增長，這就產(chǎn)生了一個脈動，當它沿著柱移動并通過電導檢測器時即得到一個正峰；反之，則獲得負峰。進樣后，洗脫液離子繼續(xù)不斷地經(jīng)泵輸入色譜柱，對樹脂的可互換部位與樣品離子進行競爭，并且使樣品離子沿著柱子移動。由于樣品離子對互換樹脂有不同的親和能力，因而不同的樣品離子沿柱以不同的速度移動，最后完畢了分離。

現(xiàn)代離子色譜的過程有所不同，重要有以下兩種：

1、克制型離子色譜法(SuppressedIC)：由于離子互換分離的洗脫液幾乎都是強電解質，其電導一般要較待測離子高二個數(shù)量級，簇會完全覆蓋了待測離子的信號。為提高檢測靈敏度，采用在分離柱后串聯(lián)克制柱的辦法，可使洗脫液轉變成低電導組分，以減少來自洗脫液的背景電導。此外可將樣品離子轉變成相應的酸或堿，以增長其電導?？酥蒲b置有柱型和離子互換膜管型兩種。

克制柱內填充與分離柱填料相反電荷的離子互換樹脂。當分析陰離子時，要用苯乙烯系列的強酸型（H+）樹脂裝柱；而分析陽離子時，則用苯乙烯系列的強堿型（OH-）樹脂裝柱?？酥浦毝ㄆ谠偕?。

離子互換膜管型克制系統(tǒng)可解決色譜上出現(xiàn)的水和碳酸離子的負峰。這是一種表面經(jīng)磺化解決的聚苯乙烯多孔纖維管，管內流過流動相，管外流過再生克制液，借助于離子互換作用來消除背景離子。

分析陰離子時，Na+穿出纖維管壁進入克制液(H2SO4)中，與硫酸反映生成硫酸鈉而被除去；同時，H+穿入管壁，與流動相的Na2CO3反映生成H2CO3。若流動相為NaOH時，則生成水。但是，CO32-和SO42-不能穿過管壁，而陽離子卻可穿過。在實際應用中，環(huán)境溫度超過40℃時，H2SO4有也許將管膜破壞。為此有人改用十二烷基苯磺酸(DodecylBenzeneSulfonicAcid,DBS)作再生克制液來取代硫酸液。DBS則較為安全，并且這種克制液能使HCO3-減少而使負峰變得更小，并且通常都出現(xiàn)于同一位置，使色譜的重現(xiàn)性提高，保存時間不變；但會出現(xiàn)F-峰的峰高變低和峰寬增長的問題。有人在膜管內裝填苯乙烯和二乙烯苯的共聚物小球，因而提高了互換效率和色譜峰的銳度，這種改良后的裝置稱為組合型多孔纖維管克制器，可使負峰現(xiàn)象大大改善，其效果最佳。

對于陽離子來說，分離柱裝有陽離子互換填料，克制單元則為羥基陰離子互換劑，洗脫液中典型的是H+或苯二銨[Ph(NH3)22+]，通過克制單元后分別轉變?yōu)镠2O或Ph(NH2)?？酥菩碗x子色譜柱因價格昂貴，使用也較復雜，限制了該裝置和操作的進一步發(fā)展。

2、單柱離子色譜法(SingleColumnIC,SCIC)：是一種不用克制柱，直接用電導等檢測器測定陰離子和陽離子的液相色譜法。特點是：采用足夠低互換容量的分離柱，以及很稀濃度的洗脫液。

進行陰離子分析時，樹脂的互換容量為0.005～0.10Meq/g，典型的洗脫液是1.0×10-4～4.0×10-4mol/L的苯甲酸、羥基苯甲酸或鄰苯二甲酸的鈉鹽或鉀鹽，這些洗脫液都足夠稀，從而使背景電導率相稱低；大部分樣品陰離子的當量電導比洗脫液陰離子要高，因此，樣品濃度即使低至ppm級也能測得。采用羧酸頁不是它的鹽作為洗脫液時，對大部分離子的檢測限可以擴大10倍。

進行陽離子分析時，采用低容量的陽離子互換柱，它能與電導檢測器或者其它類型的檢測器相連，一價陽離子的分離系數(shù)用稀硝酸溶液作為洗脫液和電導檢測器，而分離二價陽離子時則用乙二胺鹽溶液。二價過度金屬陽離子可以用弱的絡合試劑，如乙二胺酒石酸鹽進行分離。在強絡合離子(Fe3+和Al3+)的樣品溶液中加入絡合試劑（如EDTA或磺基水揚酸鹽）能獲得更好的先擇性。由于各種堿金屬離子的當量電導均比洗脫液中的H+的當量電導小，H+的極限當量電導為350S/當量，而Li+、Na+、K+分別為39、50、74。同樣，二價陽離子和過渡金屬離子也較乙二胺鹽陽離子的當量電導小，因此樣品峰相對于洗脫液的背景電導要小而呈負峰。由于兩者之間當量電導的差異是很大的，因此檢測靈敏度很好，特別是用酸作為洗脫液時更是如此。

（三）離子色譜中最常用的檢測器：IC中使用的檢測器有：電導檢測器、分光光度檢測器、熒光檢測器、折光率檢測器、電化學檢測器以及原子吸取或發(fā)射光譜檢測器。

1、電導檢測器：是IC中使用最廣泛的檢測器。其作用原理是用兩個相對電極測量水溶液中離子型溶質的電導，由電導的變化測定洗脫液中被分離組分的濃度。此檢測器的死體積小，若采用克制電導法，IC體系通常可獲得極低的背景電導，適于使用二極式電導檢測器，其敏感度可達10-9g/l，線性動態(tài)范圍達104；用SCIC體系時，洗脫液的背景電導常高達50s/cm以上，極化效應嚴重，必須用五極式電導檢測器或精心設計的二電極式電導檢測器，其敏感度達10-9g/l，線性動態(tài)范圍為103。

由于電導率大小與離子運動速度有關，溫度升高將減少液體的粘度，從而加速了離子的運動，這樣就會使電導率增長。通常，溫度每升高一度，電導率將增長22.5%，因此需采用絕熱恒重措施，以提高儀器對環(huán)境溫度變化的適應性。

2、紫外-可見分光光度檢測器：應用越來越受重視，特點：(1)選擇性好；(2)通用性好；(3)敏感度好，市售檢測器的噪聲水平可低至210-6吸光度單位，其敏感度達10-10g/ml，因之很易進行ppb級濃度的離子分析；(4)線性動態(tài)范圍達105；(5)與電導檢測器相比，受溫度影響較小等。四、高分辨氣相色譜(HighResolutionGasChromatography,HRGC)簡述

HRGC在分離分析復雜有機化合物、天然產(chǎn)物、醫(yī)藥、環(huán)保等方面具有顯著效果和特殊意義。與傳統(tǒng)GC柱的重要差別在于HRGC柱是不裝填充劑的空心柱，固定液相是涂漬或固定在柱管內壁上的。這種空心柱的滲透性很高，固定液量很少，這就使HRGC具有三大特點：分離效率高，一根20mm的色譜柱，總理論塔板數(shù)可達5萬以上；分析時間短，與填充柱相比，可縮短若干倍；薄而均勻的固定液液膜，使柱流失的絕對量減少，因而信噪比得以提高。

（一）HRGC的色譜柱：最初使用的材料是不銹鋼，操作方便，比較結實耐用，但對不少極性樣品會有吸附并發(fā)生分解，成本也高，因而限制了它的應用范圍。用玻璃作柱材料的螺旋形開管柱，可填補不銹鋼的一些局限性，但易于破碎。熔融石英開管柱(FusedSilicaOpenTubularColumn,FSOT柱)對若干極性大、分子量也較大的藥物也可不經(jīng)衍生化而直接就能進行分離。開管柱(Opentubularcolumn，Golay柱，空心柱)因柱管內徑在0.2～0.8mm間，也稱毛細管柱(Capillarycolumn)，但此名稱不對的，因開管柱的重要特點不只是內徑小，而是由于柱開口（即中空），因此通氣性佳，無渦流擴散，可使用長柱，因而分離效率高，可稱之為“高分辨”。此外，尚有填充毛細管柱(Packedcapillarycolumn)和微填充柱(Micropackedcolumn)它們的柱管內徑也很小，嚴格講，HRGC是指使用開管柱（涉及涂壁開管柱和涂擔體開管柱）的氣相色譜法。

常用的開管柱類型有：

涂壁開管柱(Wall-coatedopentubularcolumn,WCOT柱)：內徑為0.05mm～0.53mm，內壁涂布固定相（SE30、OV-1、OV-225、Carbowax20M等)，相膜厚0.1m～8.0m。缺陷是柱容量低，不適于在室溫下分析分子量很低的成分和永久氣體。涂擔體開管柱(Support-coatedopentubularcolumn,SCOT)：內裝10-3～10-4mm的固體擔體，厚度一般為0.1mm，樣品解決量大。多孔層開管柱(Porous-layeropentubularcolumn，PLOT柱)：似SCOT，但常分兩步制備，先是多孔層的沉積，然后再涂布固定相，多孔層常由重的晶性沉積或玻璃粉熔結而成。與SCOT相同，PLOT柱容量大而柱效較低。

固定化相開管柱(Immoblilizedphaseopentubularcolumn，IPOT柱)：也稱為不能提取相開管柱(Nonextractablephaseopentubularcolumn，NPOT柱)：是在WCOT柱涂布后，將固定相進一步用橫向交聯(lián)或鍵合的辦法，使之固化，形成更大、更穩(wěn)定的大分子薄膜。此種柱可分為兩大類：交聯(lián)柱(crosslinkingcolumn)是在固定液相分子間進行共價連結；鍵合相柱(bondingphasecolumn)是固定液相與支持物的表面連結。這兩種開管柱比WCOT柱的優(yōu)越之處在于：產(chǎn)生了穩(wěn)定的涂層；得到了不可提取的涂層；使用溫度往往要比未固化相柱的柱溫上限約高30℃也可用作超臨界流體色譜法或液相色譜法的固定相。

（二）開管柱的進樣方式：由于柱系統(tǒng)特性不同（如內徑、膜厚、樣品容量、載氣種類和線速度等）以及樣品性質的差異（如組分的濃度范圍、溫度范圍和穩(wěn)定性等），需采用不同的進樣方式和方法：

1、分流進樣(Splitinjection)：受柱容量限制，在分析很純或濃度很高的樣品時，對WCOT柱就須分流進樣，即樣品進入汽化室后被汽化樣品按一定比例提成兩部分，大部分放空，僅小部分進入色譜柱。入口分流器為最常用，優(yōu)點是使用方便；缺陷是不適于痕量分析和寬沸程樣品。

2、無分流進樣(Splitlessinjection)：有兩種形式：一種是直接無分流，所有樣品在最短時間內完全汽化均勻混合后直接進入色譜柱。進樣量能達1l。迄今這種進樣器為寬孔柱（內徑0.33mm，膜厚0.5m)和SCOT柱所廣泛使用。

另一種是Grob型分流（溶劑效應），注入的樣品在汽化室中汽化，但在開管柱入口端再度冷卻，以液體捕集，并保持冷卻；然后快速加熱色譜柱進行“再進樣”。此法的優(yōu)點是特別合用于痕量分析，對寬沸程樣品也能獲得滿意結果。缺陷是操作較難，必須運用溶劑效應或冷阱；溶劑的選擇和起始柱溫的限制；以及洗脫時間很嚴格、不能定量回收等等。

3、柱頭進樣(On-columninjection)：這是一種針對分流和無分流進樣的缺陷而設計的正在發(fā)展的進樣方法。特點是：（1）必須使用外徑為0.17～0.23mm的細針，而開管柱內徑又必須是大約0.32mm的；（2）不能通過隔墊進樣；（3）要緩慢進樣，以免倒流；（4）對熱敏感，稀的和寬沸程的樣品比較抱負；（5）能給出定量結果。

重要缺陷是：樣品中非揮發(fā)性物質在柱中積累，導致柱性變惰和柱效損失，為此，樣品應通過仔細的預解決才可直接注入柱中，否則將縮短柱的壽命。

（三）開管柱的選擇和性能評價：若供試品在填充柱上，經(jīng)反復實驗，對其組分的分辨率仍感不滿意時；或要想使分析更加快速；或者，需要較好的色譜柱以克服樣品峰的嚴重拖尾時；均可考慮選用開管柱進行分析。若缺少參考資料，可一方面考慮樣品組分的沸點和極性。一般，相差2℃或2℃以上的組分，采用非極性開管柱分離是合適的；若沸點相差在2℃以內，則需在極性較大的開管柱上進行分離為好。開管柱一般為柱長25m、內徑0.25mm、膜厚0.25～0.4m；但對低揮發(fā)性樣品，則宜使用10m左右柱長、膜厚不大于0.2m的開管柱為好。開管柱性能評價指標有：理論塔板數(shù)，容量因子，柱效率，涂漬情況，混合物的峰形以及峰的對稱因子的大小等等。還可采用Grob標準實驗混合物來進行綜合性的進樣考察。五、多維氣相色譜(MultidimensionalGC,MDGC)：

是用兩根或更多的柱連接起來，以達成單柱不也許達成的分離分析結果。最簡樸的MDGC是2DGC，先將樣品注入預柱（填充柱或開管柱），進行第一次分離。用中心切割(heartcut)選擇所需的流分，使之進入分析柱通常用FOST柱進行第二次發(fā)離。兩根柱可以在同一柱箱內或不同柱箱；切割用閥進行。所用預柱有：

1、高分辨柱：用于分離復雜混合物成為窄切割帶，然后再由分析柱進一步分離；

2、高容量柱：用于分離溶劑、主成分、衍生化試劑，以保護分析柱和檢測器。

3、樣品預柱：用于除去樣品中不需要的物質，只切割待分析組分進入分析柱。

4、濃集柱：用以從稀濃度的樣品中進行樣品富集。

MDGC并不是一種新技術，近年來得到發(fā)展的因素是：

1、采用了FSOT柱，不僅高效、惰性，并且操作方便；

2、采用大口徑、厚涂層的FSOT柱，樣品載量大，可取代填充柱作預柱，并且惰性、分辨率較高，易于使用，而填充柱一般對痕量組分來說，活性太高。

3、有關硬件（如微量閥、低死體積柱切換裝置）已經(jīng)商品化。六、常用的藥物色譜分離的優(yōu)化方法：

（一）色譜響應函數(shù)(ChromatographicResponseFunction,CRF)：盡管CRF還不能帖切地全面地反映出實際效能，但作為一個色譜系統(tǒng)效能的尺度和尋求抱負指標的起點，為色譜分離質量提供初步的數(shù)值性的描述，值得探討。CRF最初是作為兩相鄰色譜峰的分離參數(shù)的函數(shù)：

其中，i是k對色譜峰中(k為峰總數(shù)減1)相鄰峰間分離的尺度。后來擴展到實際分離參數(shù)()和理論分離參數(shù)()之間的比較以及實際分析時間(TL)和可接受的分析時間(TM)之間的比較：

式中，為加權因子。有了CRF值，即可通過調節(jié)一組實驗因子（如柱溫、流速等）達成最佳的響應。

（二）色譜優(yōu)化函數(shù)(ChromatographicOptimizationFunction,COF)：重要是CRF方程進行了改善，一方面用峰的分辨率R(Resolution)代替峰分離參數(shù)(),由于在色譜測量中兩者相比更習慣于采用分辨率，并且當峰的分離參數(shù)<0.75時，往往不太正常，這對非常難以分離的峰的優(yōu)化是不利的。COF的定義如下：

式中，Ri是第i對峰的分辨率，Rid是第i對峰的抱負分辨率，Ai和B都是加權因子。當所有Ai和Rid都相同時，COF非常相似于CRF。但對于色譜峰的重疊或出峰順序因條件改變而倒置時，上述兩種優(yōu)化指標就不能合用。有待繼續(xù)索。

（三）單純形法(SimplexMethods)：這是色譜分析最優(yōu)化中常用的一種方法。就是在一定的空間中最簡樸的圖形。如在二維空間，單純形為三角形，任何其它圖形都可分解為若干個三角形；在三維空間中，單純形為四周體；n維空間的單純形就是以n+1個頂點組成的圖形。在二維空間中，不在一條直線上的三個點可構成一個單純形。（見圖）在它的三個頂點G、H、L，按其中所處條件(X1,X2)，求得相應的響應值（如CRF值）RG、RH、RL，然后進行比較。若其中RH最差，RG次之，RL最佳，則可設想函數(shù)變化趨勢。一般來說，“好點”在“差點”的對稱位置的也許性較大。將G與L的中點F與H相連，沿HF方向延伸，使HF=FR而獲得R點。R點稱為H關于F的反射點，這種做法稱為反射，R即為新的考察點。按R所處條件依法取得其響應值，若比G點的響應好，則丟棄H點而與G、L構成新的單純形。若反射點R在新的單純形中也是響應最差的點，則會反射至H點（稱為“振蕩”）。為此規(guī)定，在新的單純形中尋求次差點的反射點構成新的單純形。以后有人提出了改善單純形法，除了“反射點”，還運用了“擴張”和“收縮”等規(guī)則。若RR比RL好，說明情況有了改善，可延伸得更遠一點（“擴張”至S點）。若R點響應比G好，比L差，則以GLR為新的單純形。若比G、L都差時，則“收縮”至U點。若R點比H點差時，則H“收縮”至T點。若HF方向上的所有點的響應值都比H點差，則將原單純形LGH中的最佳點L作為中心，按一定比例收縮或擴張，產(chǎn)生新的單純形。單純形過程一直進行到滿足給定的“收斂規(guī)定”為止。單純形過程即可結束。幾種頗有應用潛力的光譜分析方法：

一、差示分光光度法(DifferenceSpectrophotometry)：簡稱ΔA法。取兩份相等的供試液，一份加酸，另一份加堿或緩沖液或其他可以發(fā)生某種化學反映的試劑，有時也可不加任何溶液，然后將兩者分別稀釋至同樣濃度，一份置樣品池中，另一份置參比池中，于適當波長處，測其吸取度的差值（ΔA值），在供試溶液的一定濃度范圍內，ΔA值與濃度C之間呈線性關系。優(yōu)點：在不同pH介質中，或經(jīng)適當化學反映后，供試物發(fā)生了特性性的光譜變化，而賦形劑或其他共存物質不受pH條件或化學試劑的影響，未引起光譜變化，從而消除了它們的干擾。同時，參比池與樣品池中具有相同濃度的供試物與干擾物，這就為吸取度的測量提供了一個近似抱負的參比溶液。ΔA法重要有：

1、運用最大吸取波長進行藥物的測定：紫外光譜對pH十分敏感時，可測得ΔA（堿-酸）或ΔA（pH7-酸）。

2、運用最大吸取與最小吸取之差（即振幅）進行藥物測定：某些藥物共存物在某pH范圍內的光譜與pH無關（即吸取度不變）。而主藥有最大和最小吸取，兩者差值與主藥濃度成正比。

3、運用干擾雜質等吸取波長進行測定：于干擾物的等吸取波長處進行測量，如測得供試物的相應吸取度，即可消除共存物的干擾。

4、運用最小吸取波長(min)處的增色效應進行測定：某些藥物在堿性和酸性溶液中于處吸取重疊，但吸取值不同。但在堿性或酸性溶液中于max或min處可產(chǎn)生增色效應，運用此效應可測定藥物濃度。二、正交函數(shù)分光光度法(OrthogonalFunctionSpectrophotometry)：在分光光度法中，任何一條吸取曲線，都可由一組正交多項式來描述它：

f(x)=)+)+……+kk

其中系數(shù)iif／si,

式中：si為歸一化因數(shù)，i)可從“正交多項式表”查得，f為所選波長區(qū)間內等間隔的各點波長處的吸取度，N：為測式點數(shù)（須大于i+1）。N值越大，所得i值越精確。

i是吸取度A的函數(shù)，i∝C，則i=AjCA，Aj是常數(shù)，類似于經(jīng)典分光光度法中的比吸取系數(shù)，數(shù)值上等于光路長為1cm、CA=1%(w/v)時的i，常寫作：i(1%,1cm)，取樣品與對照品在同樣條件下測N點吸取度，計算i，根據(jù)式：i測=i(1%,1cm)×CA可求得CA。

在兩組分混合液測定期，i混=iA(1%,1cm)×CAiB(1%,1cm)×CB，可適當選擇其中的i和波長區(qū)間，就可使iB×CB小到可以忽略不計，從而可以如同測定單一組分同樣，由混合物的i和對照品的i(1%,1cm)，求出混合物中組分A的含量；反之，同理也可測定組分B的含量。三、近紅外光譜分析法(Nearintra-redspectrum,NIR)：

波長范圍800～2500nm(12500～4000cm-1)，優(yōu)點：

1、沒有中紅外光譜(Midintra-redspectrum,MIR,4000～400cm-1)吸取帶顯示出的邊沿干擾(fringeinterference)，故在一較大的吸取動態(tài)范圍內這些吸取帶強度與被測物濃度之間有線性關系；

2、和MIR不同，水分吸取不會覆蓋C-H、N-H和O-H的吸取帶，因此，NIRS(NIRSpectroscopy)可用于水溶液樣品、含水固體和泥漿狀樣品的分析；

3、樣品可不經(jīng)溶劑稀釋、制備溴化鉀片等解決而可直接測定，免去樣品制備時也許帶入的誤差，因而其定量效果優(yōu)于GC、HPLC和FTIR等法。

藥典中原料藥多用MIR作指紋分析，或以標準圖譜核對，或與參比標準對照，所得光譜質量多取決于樣品制備的準確性和重現(xiàn)性，并且操作繁瑣、影響因素很多。NIRS法則方便得多，僅需將樣品裝入樣品池內而不必作預解決。一般，液體樣品可直接裝入光路長1～30mm的石英池中。固體樣品可直接放入具有石英窗的反射樣品杯中；蓋上彈簧壓縮蓋即可。在1分鐘內即可完畢裝樣；取出樣品、清洗杯子的時間也不需1分鐘。通常將樣品杯置入NIR光譜儀內，每秒進行5次掃描；一般掃描50次求得平均值制得最后的光譜，繼之將光譜數(shù)據(jù)進行加工以作數(shù)據(jù)的定量或定性的解釋。通常一次NIR分析僅需2～3分鐘。

（一）用于鑒別：目前常用的是借助于計算機輔助的光譜匹配法(Spectralmatching)，就是將供試藥物的光譜和存貯于機內的參比光譜進行對比并計算出“匹配系數(shù)(Matchindex,M.I.)”。若M.I.越接近1.000，則這兩個光譜越是匹配；而當M.I.接近于0.000時，則為極不匹配。有時會出現(xiàn)負值。

式(1)中，X和Y是二個光譜的矢量表達(Vectorialrepresentation)；式(2)中Xi是光譜A在波長i處的振幅（吸取度）；Yi是光譜B在波長i處的振幅（吸取度）。矢量X和Y是由光譜A和B的N個波長處所得吸取度讀數(shù)總和而得到（在某波長范圍內每隔Mnm測一次吸取度，故有N個波長點）。在N維空間中這二個矢量具有不同的大小和方向。這二個矢量間可形成一個夾角（），夾角的cos即可擬定M.I.。若=0°，則cos=1.000；若為90°，則cos=0.000，二矢量正交，完全不重疊。若大于90°，則cos為負值，這種情況有時會出現(xiàn)。

（二）用于純度檢查：較純的樣品的M.I.等于或接近于1，而純度稍差的樣品的M.I.距1尚有一定的差距。

（三）用于含量測定：NIR漫反射(NIRdiffusereflectance)吸取度（-lgR；R代表漫反射）與樣品中待測組分濃度之間存在著一定的內在關系，樣品i中某一組分的濃度yi可用這個樣品在m個不同波長處的吸取度Xik(k=1、2、…、m)的線性組合來表達：

式中，F(xiàn)0為與儀器有關的校正常數(shù)；Fk(涉及F1、F2、…、Fm)為在波長1、2、…、m處待測組分或基質的校正系數(shù)；數(shù)值為正時表達這一波長為組分的特性波長；為負時表達系基質的干擾波長，應將此值扣除。上式也可改寫成具體公式：

組分%=F0+F1log(1/R)+F2log(1/R2)+…+Fmlog(1/Rm)

式中的校正常數(shù)(F0)和校正系數(shù)(Fk)通常是選用n個濃度已知的樣品作為校正集(Calibrationset)，分別測得校正集樣品在m個不同波長處的吸取度，再用多元線性回歸(MultipleLinearRegression,MLR)或偏最小二乘(PartialLeastSquare,PLS)算法，借助于電子計算機進行數(shù)據(jù)解決以求出校正常數(shù)和系數(shù)，同時選擇出校準的最佳波長，并獲得各相應組分的校準公式，之后用于實際樣品的測定，即得。校準公式一旦建立，實際測定期方法簡易、快速、精確。四、核磁共振光譜定量分析法(NMR)：

（一）特點：

1、對于擬定的核（質子），其信號強度與產(chǎn)生該信號的核（質子）的數(shù)目成正比，而與核的化學性質無關。

2、運用內標法或相對比較法，分析混合物中某一化合物時可無需該化合物的純品作對照。

3、信號峰的寬度很窄，遠小于各信號之間的化學位移的差值，因而混合物中不同組分的信號之間很少發(fā)生明顯的重疊。

4、方法簡易快速、專屬性高，可選擇性地測定復方藥物或藥物制劑中的組分乃至藥物的立體異構體；一般無需分離，且不破壞被測樣品。

（二）定量分析方法：NMR圖譜中，可獲得化學位移、偶合常數(shù)、共振峰面積或峰高?；瘜W位移和偶合常數(shù)是結構測定的重要參數(shù)；而共振峰面積或峰高是定量分析的依據(jù)。共振峰面積或峰高直接與被測組分的含量成正比。定量分析時，一般只對該化合物中某一指定基團上質子引起的峰面積或峰高與參比標準中某一指定基團上質子引起的峰面積進行比較，即可求出其絕對含量。當分析混合物時，也可采用其各個組分的各自指定基團上質子產(chǎn)生的吸取峰強度進行相對比較，然后求得相對含量。因此，在測量峰面積或峰高以前，必須了解化合物的各組成基團上質子所產(chǎn)生共振峰的相應位置，也就是它們的化學位移值（值），并選擇一個合適的峰作為分析測量峰。常用的NMR定量分析方法有：

1、內標法（絕對測量法）：在樣品溶液中，直接加入一定量內標物質后，進行NMR光譜測定。將樣品指定基團上的質子引起的共振峰（即吸取峰）面積與由內標物質指定基團上的質子引起的共振峰面積進行比較，當樣品與內標均經(jīng)精密稱重時，則樣品的絕對重量(Wu)可由下式求得：Wu/Ws=Au·EWu/As·EWs——Wu=Ws·Au·EWu/As·EWs式中：Au為樣品測得和峰面積（不少于5次測定的平均值）；As為內標物測得的峰面積（不少于5次測定的平均值）；EWu為樣品在該化學位移處的質子當量；EWs為內標在該化學位移處的質子當量。若樣品重為W，則百分含量=Wu/W×100%

對內標物規(guī)定：(1)最佳能產(chǎn)生單一的共振峰，在掃描的磁場區(qū)域中，參比共振峰與樣品峰的位置至少有30Hz的間隔；(2)應溶于分析溶劑中；(3)應有盡也許小的質子當量(EWs)；(4)不應與樣品中任何組分互相作用。常用的內標物有：苯或苯甲酸芐酯（在5.3ppm處，由C6H5COOCH2-C6H5中的-CH2所致），合用于非芳香化合物；馬來酸，合用于非鏈烯型化合物。

2、相對測量法：當不能獲得樣品的純品或合適的內標時，可用相對測量法進行分析。操作方法與內標法相同。計算相對含量是以樣品指定基團上一個質子引起的吸取峰面積(A1/n1)和雜質指定基團上一個質子引起的吸取峰面積(A2/n2)進行比較，然后按下式計算樣品與該雜質的相對百分含量：

樣品的相對百分含量={(A1/n1/[(A1/n1)+(A2/n2)]}×100%

式中，n1和n2是指定基團的質子數(shù)。本法合用于具有一、二種雜質的樣品的分析。

3、外標法：欲測樣品中某一組分的含量，可采用該組分的標準品做成一系列不同濃度的標準液，使樣品液濃度在其范圍內，然后進行NMR測定，由所得圖譜中某一指定基團上質子引起的峰面積對濃度作圖，即得標準品的校正曲線。在平行條件下，測定樣品溶液組分指定基團上質子的峰面積，即可由校正曲線求得樣品的濃度。

4、峰高或峰位測量法：結構相似的混合物樣品（如互為異構體），由于其NMR峰分離效果不好，用峰面積定量法不能精確測定，誤差較大，此時可考慮采用峰高測量法或峰位測量法。

(1)峰高測量法：是基于峰高與樣品中有關核的濃度成正比，各組分之間的峰高比只取決于樣品的百分組成，而與樣品的多少和儀器的性能無關。測定某一對異構體時，先用異構體I和II的純品配成溶液，再用質子快速互換簡化光譜。由簡化的NMR光譜可知兩異構體的吸取峰互不干擾；可測出各自峰高。兩者摩爾數(shù)MI+MII=1，若兩者的峰高為HI和HII，則：

HI=MI×CI=（1-MII）CI；HII=MII×CII；兩式中，CI和CII是異構體I和II的峰高系數(shù)，為已知，HI和HII可測得。據(jù)此可求得MI和MII。

(2)峰位測量法：當樣品中兩種組分之間具有可進行質子快速互換的基團時，經(jīng)質子快速互換后，本來兩種組分基團的信號合并，在NMR光譜上得到單一信號，此峰的化學位移與兩組分的摩爾分數(shù)有線性關系，因此，測出混合物的化學位移，可直接求出二組分的混合比例。如有機胺及其鹽的N-CHa上的質子可以進行質子快速互換，可用NMR法定量測定有機胺酸性水溶液的氯仿提取液中游離胺及其鹽的比例?；旌衔镏蠳-CHa的化學位移(m)可按下式計算：

m=b+(a-b)Xa式中b和a為純的游離胺及其鹽的化學位移，Xa為鹽的摩爾分數(shù)。以m對Xa或Xb（游離胺的摩爾分數(shù)）作圖，應呈直線關系。因此可先用純品配成已知組成比例的混合物，測得其m并作出校正曲線后，再測得未知混合物的m，即可由校正曲線求得Xa或Xb。五、質譜及其聯(lián)用技術：

（一）質譜(MS)法常用的離子化方式：基本原理是將供試物分子經(jīng)一定離子化方式，如電子轟擊或其它離子化方式，一般是把分子中的電子打掉一個成為M+，繼之裂解成一系列碎片離子，再通過磁場使不同質荷比(m/z)的正離子分離并記錄其相對強度，繪出MS圖。即可進行元素分析、分子量測定、分子式擬定和分子結構的解析和推斷等等。

1、電子轟擊離子化(ElectronImpactIonization,IC)：是最常用的一種，特點是可使分子引起相稱大的碎裂，所得分子離子峰往往并不很強甚至不能辨認。分子較大碎裂對供試藥物的鑒定和結構解析是十分有利的；但對混合組分的分析和藥物純度檢查是不利的。

2、化學離子化(ChemicalIonization,CI)：是極為有用的一種，由于其譜形簡樸，能提供較強的準分子離子峰[Quasi-molecular,(M±H)+離子]和很少的碎片峰，因之，用于混合組分的分析和純度檢查是十分有利的。

3、場致離子化(FieldIonization,FI)：非常合用于易變分子的離子化，如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺類藥物均宜采用；此法也能產(chǎn)生較強的分子離子峰和準分子離子峰。

4、場解吸離子化(FieldDesorptionIonization,FD)：擴大了MS的使用范圍，此法可用于極性大、難氣化以及對熱不穩(wěn)定的化合物，因而在生物活性組分、藥物及其代謝產(chǎn)物或分解產(chǎn)物的研究分析工作中是一種非常重要并且十分有效的分析工具。

5、負離子化學離子化(NegativeIonCI,NICI)：靈敏度較高，可以提高到fg(10-15)水平，只要供試藥物自身或通過衍生化后具有高電子親合能力者，就可選用此法，并且可給出特性的負離子峰。

6、快原子轟擊(FastAtomicBombardment,FAB)：是將樣品溶解于低揮發(fā)性的液體基質中，用高速的中性粒子，如氬、氙等原子來轟擊而解吸，因之稱為快原子轟擊離子化。特點：可直接進行分析，毋需做成衍生物；可合用于較大分子的MS分析，而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有機化合物的測定。如將FABMS與HPLC聯(lián)用將成為適應力更強的分析手段之一。

7、激光解吸(LaserDesorptionInoization,LD)：是新近發(fā)展起來的一種有效離子化技術，能量高、指向性強，因此具有其它能源難以達成的離子化成效，可獲得很強的準分子離子峰。

在MS分析中，究竟選用哪一種離子化方式，重要取決于供試物的穩(wěn)定性和揮發(fā)度。

（二）MS與分離環(huán)節(jié)的聯(lián)用：MS已具有較高的鑒識和解析有機化合物的能力；但是如將其與某些適當?shù)姆蛛x環(huán)節(jié)聯(lián)用，則會更有效地解決分析鑒定的難題。重要聯(lián)用方式有：

1、薄層色譜-質譜聯(lián)用(TLC-MS)：是一種最簡樸的聯(lián)用技術，目前多以“脫機”(off-line)形式進行，即將TLC分離出來的組分洗脫或連同少量吸附劑一并直接向MS儀中進樣。此法可用于混合藥物的組分鑒定、純度檢查和藥物穩(wěn)定性實驗以及其分解產(chǎn)物的鑒定。檢測水平一般低于g級。常采用TLC/EI-MS方式進行。

2、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)：是當前最為活躍的聯(lián)用技術，其檢測限可達10-9～10-12g水平。目前多用高分辨氣相色譜-質譜(HRGC-MS)聯(lián)用；其質量分析器部分，除了通常的磁鐵式單聚焦質譜儀外，尚有雙聚焦質譜儀。也有采用四極質譜儀的，并且可進行快速記錄，受到廣泛重視。一般，供試物經(jīng)GC分離為單一組分，按其不同保存時間，與載氣同時流杰出譜柱，再經(jīng)接口(Interface)，進入MS儀，然后可通過EI或其它方法產(chǎn)生一定的MS圖譜，由計算機自動檢索核對，即可迅速鑒識樣品。通常在規(guī)定條件下所得的MS碎片圖及其相應的強度，如同人的指紋圖同樣，易于辨識，方法專屬、靈敏，一般可檢知1g/1g的樣品，甚至檢知水平更微。常用方法有：

(1)總離子流色譜法(TotalIonizationChromatography,TIC)：是運用MS儀來記錄色譜流出物的總離子流；這時，MS儀僅作為GC的檢測器。因此，總離子流色譜圖一般是與GC色譜圖一致的。

(2)反復掃描法(RepetitiveScanningMethod,RSM)：在整個色譜分離過程中，MS儀可按一定間隔時間進行反復掃描，如每2～3秒掃描一次。在復雜的混合組分分析中，可得許多MS圖譜，繼之，用數(shù)據(jù)解決系統(tǒng)進行自動測量、記錄和運算，最后根據(jù)GC圖譜上的相應點，制得標準MS譜圖。

(3)質量色譜法(Masschromatography)：將上述反復掃描所得并已儲存在計算機中的MS圖中重新畫出一個或若干個碎片的洗脫過程圖，因而也稱之為重建離子流圖(ReconstructedIonCurrentProfile)。根據(jù)特性峰下的面積即可進行定量測定。優(yōu)點是：即使分譜過程中分離很差或有峰重疊時，也能對測定物作出鑒定，并可于g～pg范圍內進行定量。

(4)質量碎片圖譜法(MassFragmentography)：也稱多離子檢測(MultipleIonDetect