臨床病原微生物標(biāo)本及其耐藥機(jī)制檢測課件

臨床微生物及其耐藥機(jī)制檢測安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)控中心安徽醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教研室安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科徐元宏一、正確留取標(biāo)本是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的前提1.血液、骨髓、無菌體液：（1）嚴(yán)格消毒、避免體表正常菌群的污染。（2）應(yīng)在抗生素使用之前抽血。如果病人已使用抗生素，應(yīng)選擇含中和劑（活性炭、中性樹脂）的培養(yǎng)瓶，或在下次用藥前采血。（3）由于血液、骨髓、無菌體液含有極少量的病原體，就可以造成感染性疾病，而實(shí)驗(yàn)室檢出率與病原體數(shù)量有關(guān)，并非只要有病原體就能檢驗(yàn)出來，因此血液、骨髓、無菌體液等必須增菌才能獲得滿意結(jié)果。成人未使用抗生素治療采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水、關(guān)節(jié)液3-10毫升接種成人培養(yǎng)瓶（藍(lán)蓋）；成人已使用抗生素治療采集上述標(biāo)本接種加中性樹脂培養(yǎng)瓶（灰蓋）；兒童采集骨髓0.5-1毫升，血液、胸腹水，關(guān)節(jié)液1-3毫升接種兒童培養(yǎng)瓶（紅蓋）；厭氧培養(yǎng)接種上述標(biāo)本3-10毫升于厭氧培養(yǎng)瓶（黃蓋）。（4）由于菌血癥、敗血癥是間歇排菌，應(yīng)在發(fā)熱高峰時(shí)采血，對于感染性心內(nèi)膜炎患者增加采血次數(shù)，以提高陽性率。2.導(dǎo)管相關(guān)性的血流感染（CRBSI）血培養(yǎng)（1）第一采集方法經(jīng)外周靜脈穿刺采血》1套（送兩個(gè)培養(yǎng)瓶）；從導(dǎo)管中心或靜脈留置口隔膜采血1套，兩者的采血時(shí)間應(yīng)該接近（《5分鐘）。結(jié)果解釋：（a）依據(jù)細(xì)菌鑒定賀藥敏試驗(yàn)確認(rèn)，若兩套陽性血培養(yǎng)是同一種細(xì)菌，又沒有其它部位的感染，提示CRBSI；（b）若兩套陽性血培養(yǎng)瓶是同一種細(xì)菌，從導(dǎo)管采血血培養(yǎng)報(bào)告陽性時(shí)間比外周靜脈穿刺采血早》120分鐘，又沒有其它部位的感染，提示CRBSI；（e）若只有外周靜脈穿刺采血的血培養(yǎng)是陽性，但分離菌為金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位感染的證據(jù)，提示高度可疑為CRBSI；（f）若再次導(dǎo)管采血/外周采血，若培養(yǎng)陽性，且是同一種細(xì)菌，可定為CRBSI；（2）第二種采集方法：外周靜脈穿刺采血采集1～2套，同時(shí)拔出導(dǎo)管，用Maki導(dǎo)管平皿滾動(dòng)法，對導(dǎo)管尖片段進(jìn)行半定量培養(yǎng)。（c）若所有的血培養(yǎng)和導(dǎo)管片段培養(yǎng)是陰性，不太可能是CRBSI；（d）如果有》1套的血培養(yǎng)是陽性，導(dǎo)管片段的培養(yǎng)是陰性，但分離株是金黃色葡萄球菌或念珠菌，且沒有任何其它部位的感染證據(jù)，提示仍有可能是CRBSI。3.尿液：（1）導(dǎo)尿法：是一種較好的無菌采集法，主要適用于手術(shù)后患者，取10-15毫升尿液于無菌容器內(nèi)送檢，但留置導(dǎo)尿管易造成醫(yī)院內(nèi)感染。（2）中段尿采集法：是臨床上最多采用的方法，女性病人先以肥皂水或1：1000高錳酸鉀水溶液沖洗外陰及陰道口；男性病人應(yīng)翻轉(zhuǎn)包皮沖洗，用1：1000新潔爾滅消毒尿道口，在用無菌紗布擦干，讓病人排尿，棄去前段尿，收集中段尿10—20ml，盛于無菌容器內(nèi)，立即加蓋送檢。（3）腎盂尿采集法：為確定菌尿是否來自腎臟，可用導(dǎo)尿管采集腎盂尿。首先充分沖洗膀胱，以最后一次沖洗尿作對照，后用導(dǎo)尿管插入輸尿管，分別標(biāo)記左右側(cè)，收集3次尿；如果輸尿管菌數(shù)比對照尿菌數(shù)多或第3次尿中菌數(shù)比第1次多，該菌尿可能來自腎臟。反之，如果第1次尿菌數(shù)多于第3次尿菌數(shù)，則可能來自膀胱。腎盂尿采集法一般應(yīng)該請泌尿科醫(yī)師協(xié)助進(jìn)行，并確實(shí)做好標(biāo)記，以防左右側(cè)搞錯(cuò)。4.痰液：正常人下呼吸道是無菌的，上呼吸道有正常菌群寄居。下呼吸道的分泌物必須通過上呼吸道，常受上呼吸道的正常菌群的污染。因此對于下呼吸道分泌物培養(yǎng)出來的結(jié)果必須分析、判斷。一般要求病人清晨用無菌生理鹽水漱口6次，再用冷開水漱口一次，用力咳深部的痰液于無菌容器內(nèi)送檢，避免口水的污染。對于痰液不能自主咳出，可采用高滲鹽水霧化吸入排痰。

實(shí)驗(yàn)室在收到痰標(biāo)本，涂片革蘭染色（SEC<10/LPF，WBC>25/LPF）可做細(xì)菌培養(yǎng)，記錄涂片結(jié)果，SEC>25/LPF，WBC<10/LPF，視為污染，建議重留標(biāo)本；介于二者之間做細(xì)菌培養(yǎng)，記錄涂片結(jié)果，結(jié)合培養(yǎng)后細(xì)菌數(shù)量考慮是否是致病菌。合格的痰標(biāo)本用無菌生理鹽水約20毫升漂洗2次，用等量的sputosol作用20分鐘。用接種環(huán)四區(qū)劃線，從一區(qū)到另一區(qū)應(yīng)滅菌，接種直徑9厘米的血平板兩塊，巧克力平板一塊，沙包氏培養(yǎng)基。5.皮膚、創(chuàng)面：首先按常規(guī)消毒皮膚，然后用無菌注射器抽吸皮下病變部分，或用無菌棉簽取痂下膿性分泌物。6.生殖道分泌物：根據(jù)病人主述臨床癥狀，采用不同方式取材：若病人白帶呈淡黃色，稀水樣，考慮滴蟲感染，用無菌棉簽取陰道分泌物于1毫升生理鹽水內(nèi)送檢，注意保溫，因?yàn)槟壳暗蜗x的檢驗(yàn)主要看鞭毛擺動(dòng)的動(dòng)力。若病人白帶呈“豆腐渣”樣，燒癢癥狀，用無菌棉簽取“豆腐渣”樣白帶送檢，選擇不同的送檢方式和檢驗(yàn)方法可獲得不同的檢驗(yàn)結(jié)果，其方法有生理鹽水直接鏡檢、涂片加NaOH破壞上皮細(xì)胞鏡檢、革蘭氏染色鏡檢，一般認(rèn)為革蘭染色鏡檢是較為理想的方法。對于口腔、陰道等部位由于采用染色方法提高酵母菌檢驗(yàn)靈敏度，對于是定植還是致病，目前缺少診斷依據(jù)。若懷疑淋病患者，對于男性急性患者，用一支棉簽擦去尿道口膿液，輕輕擠壓尿道口，再用一支棉簽取其膿液；對于男性慢性患者或治療后復(fù)查的患者，用一支棉簽伸入尿道口2-4厘米，停留數(shù)秒鐘，旋轉(zhuǎn)取出，因?yàn)槟虻揽诩木拥氖趋[狀上皮細(xì)胞，尿道2-4厘米寄居的是柱狀上皮細(xì)胞，這是淋球菌寄居的地方。對于女性患者，用溫水濕潤的擴(kuò)陰器，取陰道分泌物或?qū)m頸分泌物，棉簽停留數(shù)秒鐘，讓棉簽充分吸附分泌物。從直腸取材時(shí)，應(yīng)將棉簽插入肛門2.5厘米以上，碰到糞便，應(yīng)換一個(gè)棉簽重取。檢查淋球菌性咽炎時(shí)，應(yīng)從扁桃體及扁桃體窩取材。支原體檢查：支原體是簡單的原核細(xì)胞，沒有細(xì)胞壁，缺乏許多細(xì)胞器，直接鏡檢沒有意義，只有通過培養(yǎng)，取材顯得重要，采集標(biāo)本時(shí)，男性患者可用尿道拭子或清晨中段尿培養(yǎng)，女性推薦陰道拭子。衣原體檢查：采取尿道標(biāo)本，至少在排尿1小時(shí)后采集，對于男性尿道取材，棉拭子應(yīng)伸入尿道2-4厘米（因?yàn)橐略w寄生在粘膜柱狀上皮細(xì)胞，而不是寄生在復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞中），轉(zhuǎn)動(dòng)拭子以獲得細(xì)胞；對于女性尿道取材，先用一個(gè)拭子擦凈尿道口，再用棉拭子（?。┥烊肽虻?厘米，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)拭子取出，對于女性宮頸取材，用溫水濕潤的擴(kuò)陰器擴(kuò)張陰道，先用一個(gè)拭子擦凈宮頸口，然后再用棉拭子（?。┥烊雽m頸內(nèi)1-2厘米，用力摩擦采取宮頸細(xì)胞，不采用膿液作培養(yǎng)。直腸取材，可將拭子插入肛門括約肌，在肛門和直腸結(jié)合處沿腸壁轉(zhuǎn)動(dòng)，持續(xù)10-30秒，以吸取微生物，并避免糞便的污染。尿液、精液、服過抗生素的病人標(biāo)本以及新近用過某些陰道制劑、清潔劑等病人標(biāo)本不宜作衣原體檢查。二、正確檢驗(yàn)病原體1.及時(shí)接種，選擇合適培養(yǎng)基：由于體外環(huán)境不是微生物生長的最適宜環(huán)境，微生物怕冷、熱、光、干燥、消毒劑，因此實(shí)驗(yàn)室接受標(biāo)本后，應(yīng)立即接種；不同微生物需要不同的營養(yǎng)要求和環(huán)境，選用不同的培養(yǎng)基，制備不同的環(huán)境，例如解脲支原體需要解脲支原體培養(yǎng)基，腦膜炎奈瑟氏菌需要營養(yǎng)豐富的巧克力血平板和5-10%CO2，淋球菌需要Thayer-Martin（T-M）、NYC培養(yǎng)基和5-10%CO2。除此之外，為了更好分離致病菌、抑制正常菌群和污染菌，需要加入一些營養(yǎng)因子和抑菌劑。例如淋球菌T-M培養(yǎng)加入血紅蛋白、萬古霉素、多粘菌素、制霉菌素、磺胺嘧啶。萬古霉素抑制葡萄球菌的生長，多粘菌素抑制銅綠假單胞菌的生長，制霉菌素抑制念珠菌的生長，磺胺嘧啶抑制變形桿菌的生長。有利的一面，利于淋球菌的的識別；不利的一面是遺漏可能的致病菌，患者易產(chǎn)生繼發(fā)感染：繼發(fā)霉菌性陰道炎、淋病治愈后葡萄球菌性尿道炎。3.如何從眾多的正常菌群中辨別致病菌？采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基和適宜的環(huán)境滿足致病菌的生長。采用含抑制劑的培養(yǎng)基篩選致病菌。如解脲支原體培養(yǎng)基除含小牛血清外，還含有青霉素；分離大腸埃希氏菌O157，H7所用培養(yǎng)基是山梨醇麥康凱培養(yǎng)基。運(yùn)用豐富、扎實(shí)的知識識別致病菌。對于痰液：致病菌是腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、奴卡氏菌；可能致病菌是念珠菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌（指除凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌之外的所有凝固酶陰性葡萄球菌統(tǒng)稱，目前包括31個(gè)種，是一種習(xí)慣稱法）、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、卡他粘膜炎奈瑟氏菌等。一般不是致病菌是指草綠色鏈球菌。對于尿液：分離到兩種以下的細(xì)菌，可能是病人寄居的細(xì)菌，若分離到三種或三種以上，可能是污染菌，建議病人重新留取標(biāo)本。在報(bào)告細(xì)菌的同時(shí)，應(yīng)報(bào)告菌落計(jì)數(shù)，過去認(rèn)為對于革蘭陰性桿菌≥105

CFU/ml有致病意義，革蘭陽性球菌≥104

CFU/ml有致病意義；現(xiàn)在認(rèn)為只要病人有主述癥狀，菌落計(jì)數(shù)≥100CFU/ml就有致病意義。通過墨汁染色可以直接判斷有無新型隱球菌感染。菌落特征有突起、凹陷、色澤、色素等表面特征：肺炎鏈球菌呈現(xiàn)肚臍樣凹陷，沙雷氏菌出現(xiàn)紅色色素，銅綠假單胞菌有綠色、無色色素，有姜味氣味，可呈現(xiàn)粘液型菌落、粗糙型菌落、光滑型菌落。5.正確鑒別病原菌對于細(xì)菌而言，主要依據(jù)表型特征，菌體、菌落形態(tài)，溶血性、生化反應(yīng)，血清凝集將細(xì)菌鑒定。革蘭陽性球菌中葡萄球菌主要依據(jù)凝固酶、新生霉素抑菌試驗(yàn)、生化反應(yīng)來判斷；腸球菌依據(jù)6.5%NaCL、膽汁七葉苷與葡萄球菌、鏈球菌鑒別，依據(jù)甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸、阿拉伯糖、棉子糖、動(dòng)力、黃色素、蔗糖、丙酮酸鹽來鑒別屬內(nèi)12個(gè)種；鏈球菌屬依據(jù)cAMP、DNA、桿菌肽、血清凝集來鑒別。革蘭陰性球菌主要依據(jù)氧化酶、DNA酶、生化反應(yīng)來鑒別，淋球菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陰性、甘露糖陰性、蔗糖陰性；腦膜炎奈瑟氏菌氧化酶陽性、DNA酶陰性、葡萄糖陽性、乳糖陰性、麥芽糖陽性、甘露糖陰性、蔗糖陰性。革蘭陽性桿菌主要依據(jù)菌體、菌落，特征性染色來鑒別，結(jié)核分枝桿菌抗酸染色陽性，白喉棒狀桿菌Albert染色出現(xiàn)異染顆粒，產(chǎn)單核李斯特菌溶血性和動(dòng)力。革蘭陰性桿菌主要依據(jù)氧化酶、氧化-發(fā)酵（O-F）試驗(yàn)來判斷。氧化酶陰性、氧化-發(fā)酵（O-F）發(fā)酵腸桿菌科編碼補(bǔ)充生化反應(yīng)鑒定到種。對于致病性大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌還需血清學(xué)凝集。氧化酶陰性、氧化-發(fā)酵（O-F）氧化

氧化酶陽性、氧化-發(fā)酵（O-F）氧化/-非發(fā)酵菌編碼補(bǔ)充生化反應(yīng)鑒定到種。氧化酶陽性、氧化-發(fā)酵（O-F）發(fā)酵弧菌科編碼補(bǔ)充生化反應(yīng)、血清學(xué)凝集鑒定到種，如霍亂弧菌O1、O139等。對于真菌而言，主要依據(jù)菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、色素，同化試驗(yàn)、發(fā)酵試驗(yàn)來鑒別至種屬。實(shí)驗(yàn)室人員困惑：由于上述細(xì)菌、真菌鑒定依靠表型特征，表型是受基因控制，同一基因型可能有不同種表型，同一表現(xiàn)型可能受不同基因型所控制。根據(jù)表現(xiàn)型判斷的菌體能代表真正的菌屬嗎？隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們能任意改造表現(xiàn)型。我們能有所作為嗎？三、恰如其分報(bào)告藥敏結(jié)果藥敏試驗(yàn)中藥敏紙片選用：臨床醫(yī)生經(jīng)常反映，實(shí)驗(yàn)室所報(bào)告的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，臨床根本或很少使用這類藥物，實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)中藥物是敏感，臨床使用無效。如何聯(lián)合用藥、合理用藥？實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)根據(jù)可能的細(xì)菌種類、細(xì)菌的菌屬，合理選用藥敏紙片，報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)美國FDA推薦臨床微生物實(shí)驗(yàn)室苛養(yǎng)菌和非苛養(yǎng)菌分組的藥物選用，它將藥物分為四組：A組，一級試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告的抗生素；B組，一級有選擇報(bào)告的抗生素；C組，補(bǔ)充試驗(yàn)，有選擇報(bào)告的抗生素；U組，用于泌尿道補(bǔ)充試驗(yàn)的藥物。例如對于腸桿菌科細(xì)菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素；選擇報(bào)告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢孟多或頭孢尼西或頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢美唑、頭孢哌酮、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢噻肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、環(huán)丙沙星或左氧氟沙星、亞胺培南或美羅培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。對于銅綠假單胞菌和不動(dòng)桿菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有頭孢他啶、慶大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，選擇報(bào)告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、頭孢哌酮、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南或美羅培南、妥布霉素。對于葡萄球菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，選擇報(bào)告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、萬古霉素。對于腸球菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有青霉素/氨芐西林，選擇報(bào)告的抗生素有萬古霉素。對于嗜血桿菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有氨芐西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報(bào)告的抗生素有頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢呋辛鈉（針劑）、氯霉素、美羅培南。對于肺炎鏈球菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有紅霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑，選擇報(bào)告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、萬古霉素。對于除肺炎鏈球菌以外其它鏈球菌常規(guī)報(bào)告的抗生素有紅霉素、青霉素、氨芐西林，選擇報(bào)告的抗生素有氯霉素、克林霉素、萬古霉素、頭孢吡肟或頭孢他啶或頭孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/達(dá)福普汀。對于淋球菌常規(guī)報(bào)告β-內(nèi)酰胺酶結(jié)果，如β-內(nèi)酰胺酶陽性提示青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥，但淋球菌更多的是染色體介導(dǎo)的耐藥，需要做補(bǔ)充藥敏試驗(yàn)，選擇報(bào)告的抗生素有頭孢克肟或頭孢噻肟或頭孢泊肟或頭孢唑肟或頭孢曲松、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大觀霉素、四環(huán)素。遵循嚴(yán)格的操作方法、施加質(zhì)量控制：紙片擴(kuò)散法（K-B））法、液體稀釋法必須遵循NCCLS（CLSI）規(guī)定，它對紙片厚度、藥物濃度、培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、孵育溫度、操作方法都有詳細(xì)規(guī)定。E-test必須按照其說明要求進(jìn)行。運(yùn)用豐富的理論知識，提示臨床用藥：對于腸道分離的沙門菌和志賀菌屬，常規(guī)僅測試氨芐西林、一種喹諾酮類藥物和TMP/SMZ藥物，1、2代頭孢菌素盡管體外敏感，但臨床治療無效，實(shí)驗(yàn)室不能做此藥敏試驗(yàn)。對于腸道外分離株，沙門氏菌屬還一定要測試并報(bào)告氯霉素和某一種三代頭孢菌素。對于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐慶大霉素腸球菌、AmpC-β-內(nèi)酰胺酶應(yīng)有所選擇性報(bào)告藥敏結(jié)果，有時(shí)體外藥敏結(jié)果是敏感的也要報(bào)告耐藥。1.藥敏試驗(yàn)種類和方法：（1）細(xì)菌藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法液體稀釋法E-test法（2）酵母樣真菌藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法液體稀釋法E-test法淺部真菌目前尚沒有標(biāo)準(zhǔn)方法。細(xì)菌藥敏試驗(yàn)-紙片擴(kuò)散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.細(xì)菌藥敏試驗(yàn)-液體稀釋法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu420mg/ml細(xì)菌藥敏試驗(yàn)-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.四、耐藥機(jī)制檢測1、耐甲氧西林葡萄球菌檢測（1）β-內(nèi)酰胺酶檢測試驗(yàn)方法：Nitrocefin試驗(yàn)孵育時(shí)間：Nitrocefin試驗(yàn)需1h或按產(chǎn)品說明進(jìn)行。結(jié)果：Nitrocefin試驗(yàn)：從黃色變成紅或粉紅色＝β-內(nèi)酰胺酶陽性QC建議：金黃色葡葡球菌ATCC29213-陽性；金黃色葡萄球菌ATCC25923-陰性報(bào)告：β-內(nèi)酰胺酶陽性葡萄球菌對青霉素，氨基-、羧基-、和脲基青霉素耐藥。（2）苯唑西林耐藥檢測金黃色葡萄球菌試驗(yàn)方法：瓊脂稀釋法培養(yǎng)基：含4%NaClMHA抗生素濃度：6μg/ml苯唑西林接種物：直接菌落懸液獲得0.5麥?zhǔn)蠞岫取Ｊ褂?μl接種環(huán)蘸取菌液，在平板上涂成直徑10到15mm斑點(diǎn)。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成類似大小斑點(diǎn)或劃滿四分之一區(qū)。孵育條件：33-35℃；空氣（試驗(yàn)溫度高于35℃不能檢出MRSA）。孵育時(shí)間：24h

結(jié)果：用透射光仔細(xì)檢查＞1個(gè)菌落或存在淡的膜狀生長。＞1個(gè)菌落＝苯唑西林耐藥。QC建議：金黃色葡葡球菌ATCC29213-敏感；金黃色葡萄球菌ATCC43300-耐藥。報(bào)告：苯唑西林耐藥葡萄球菌對所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥；其他β-內(nèi)酰胺類藥物應(yīng)被報(bào)告耐藥或不報(bào)告。（3）使用頭孢西丁測mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥－紙片擴(kuò)散法：適合所有葡萄球菌培養(yǎng)基：MHA抗生素濃度：30μg頭孢西丁紙片接種物：標(biāo)準(zhǔn)的紙片擴(kuò)散法推薦孵育條件：33-35℃；空氣（試驗(yàn)溫度高于35℃不能檢出MRSA）孵育時(shí)間：16-18h（金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌）；24h（凝固酶陰性葡萄球菌）結(jié)果：≤21mm=mecA陽性≥21mm＝mecA陰性－金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌；≤24mm=mecA陽性≥25mm＝mecA陰性－凝固酶陰性葡萄球菌。QC建議：金黃色葡萄球菌ATCC25923-mecA陰性(抑菌環(huán)直徑23-29mm)金黃色葡葡球菌ATCC43300-mecA陽性（抑菌環(huán)直徑≤21mm）報(bào)告：頭孢西丁被用于檢測mecA介導(dǎo)苯唑西林耐藥的替代品。mecA陽性菌株應(yīng)報(bào)告對苯唑西林（非頭孢西?。┠退?；其他β-內(nèi)酰胺類藥物應(yīng)被報(bào)告耐藥或不報(bào)告由于罕見非mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機(jī)制，對于凝固酶陰性葡萄球菌，mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥(MIC≥0.5μg/ml)菌株應(yīng)報(bào)告苯唑西林耐藥；對于金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌，mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥(MIC≥4μg/ml)菌株應(yīng)報(bào)告苯唑西林耐藥。（4）使用頭孢西丁測mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥－肉湯微量稀釋法：適合金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌培養(yǎng)基：CAMHB抗生素濃度：4μg/ml頭孢西丁接種物：標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法推薦孵育條件：33-35℃；空氣（試驗(yàn)溫度高于35℃不能檢出MRSA）孵育時(shí)間：16-20h結(jié)果：＞4μg/ml=mecA陽性；≤4μg/ml=mecA陰性QC建議：金黃色葡葡球菌ATCC29213-mecA陰性(MIC1-4μg/ml)金黃色葡萄球菌ATCC25923-mecA陰性(抑菌環(huán)直徑23-29mm)金黃色葡葡球菌ATCC43300-mecA陽性（MIC＞4μg/ml或抑菌環(huán)直徑≤21mm；報(bào)告：頭孢西丁被用于檢測mecA介導(dǎo)苯唑西林耐藥的替代品。mecA陽性菌株應(yīng)報(bào)告對苯唑西林（非頭孢西?。┠退?；其他β-內(nèi)酰胺類藥物應(yīng)被報(bào)告耐藥或不報(bào)告由于罕見非mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥機(jī)制，mecA陰性但苯唑西林MIC是耐藥(MIC≥4μg/ml)菌株應(yīng)報(bào)告苯唑西林耐藥。2、萬古霉素敏感性減低的金黃色葡萄球菌試驗(yàn)方法：瓊脂稀釋法培養(yǎng)基：BHI瓊脂抗生素濃度：6μg/ml萬古霉素接種物：直接菌落懸液獲得0.5麥?zhǔn)蠞岫?。使用微量吸管取菌?0μl，點(diǎn)種瓊脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，擠去多余菌液，在平板上涂成直徑10到15mm斑點(diǎn)或在部分區(qū)域劃線接種。孵育條件：35±2℃；空氣孵育時(shí)間：24h結(jié)果：用透射光仔細(xì)檢查＞1個(gè)菌落或存在淡的膜狀生長。＞1個(gè)菌落＝推測對萬古霉素敏感性減低QC建議：糞腸球菌ATCC29212－敏感糞腸球菌ATCC51299－耐藥3、誘導(dǎo)克林霉素耐藥－紅霉素耐藥、克林霉素敏感或中介葡萄球菌試驗(yàn)方法：紙片擴(kuò)散法培養(yǎng)基：MHA或用于MIC測試的血瓊脂平板抗生素濃度：15μg紅霉素紙片和克林霉素紙片間隔15mm距離接種物：標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法推薦或濃菌液接種平板表面孵育條件：35±2℃；空氣孵育時(shí)間：16-18h結(jié)果：與紅霉素相鄰側(cè)抑菌環(huán)邊緣出現(xiàn)“截平”(“D”抑菌環(huán))＝誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)方法：肉湯微量稀釋法培養(yǎng)基：CAMHB抗生素濃度：在同一孔加4μg/ml紅霉素和0.5μg/ml克林霉素接種物：標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法推薦孵育條件：35±2℃；空氣孵育時(shí)間：18-24h結(jié)果：任何生長＝誘導(dǎo)克林霉素耐藥；無生長＝無誘導(dǎo)克林霉素耐藥。報(bào)告：誘導(dǎo)克林霉素耐藥分離菌應(yīng)報(bào)告“克林霉素耐藥”在報(bào)告中可加入“通過誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)，推測此菌株對克林霉素耐藥，克林霉素對某些病人可能仍有效”注釋。QC建議：金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976或金黃黃色葡萄球菌ATCC29213-不生長金黃黃色葡萄球菌ATCCBAA-977-生長。4、超廣譜B內(nèi)酰胺酶檢測（1）ESBLs紙片法培養(yǎng)基：MH瓊脂抗菌藥物濃度：肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟10μg或頭孢他啶30μg或氨曲南30μg或頭孢噻肟30μg或頭孢曲松30μg；奇異變形桿菌：頭孢泊肟10μg或頭孢他啶30μg或頭孢噻肟30μg(使用一種以上的藥物進(jìn)行篩選將會(huì)提高檢測的敏感性)頭孢他啶30μg頭孢他啶/克拉維酸30/10μg和頭孢噻肟30μg頭孢噻肟/克拉維酸30/10μg(確證試驗(yàn)需要同時(shí)使用頭孢噻肟和頭孢他啶，單獨(dú)和聯(lián)合克拉維酸的復(fù)合制劑)孵育條件：35℃±2℃；空氣孵育時(shí)間：16-18h結(jié)果：肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm奇異變形桿菌：頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤22mm頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm上述抑菌環(huán)直徑提示菌株可能產(chǎn)生ESBLs。2個(gè)藥物中有任何一個(gè)，在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比，增大值≥5mm時(shí)，判定為產(chǎn)ESBLs（例如，頭孢他啶的抑菌環(huán)＝16mm；頭孢他啶/克拉維酸的抑菌環(huán)＝21mm）QC建議：大腸埃希菌ATCC25922；肺炎克雷伯菌ATCC700603（2）ESBLs肉湯稀釋法法培養(yǎng)基：CAMHB抗菌藥物濃度：肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和大腸埃希菌：頭孢泊肟4μg/ml或頭孢他啶1μg/ml或氨曲南1μg/ml或頭孢噻肟1μg/ml或頭孢曲松1μg/ml奇異變形