細(xì)菌性病害檢測的海水養(yǎng)殖研究論文

細(xì)菌性病害檢測的海水養(yǎng)殖研究論文1國內(nèi)外海水養(yǎng)殖品種主要病害檢測方法針對以上養(yǎng)殖魚種主要細(xì)菌性病害，各國研究人員為開發(fā)快速、準(zhǔn)確、有效的診斷方法廣泛開展工作。筆者等將目前已報道的國內(nèi)、國外主要海水養(yǎng)殖細(xì)菌性病害檢測方法總結(jié)為下面幾種類型進(jìn)行敘述。1.1基于微生物生理生化檢測的方法針對養(yǎng)殖魚種細(xì)菌性病原的檢測，最經(jīng)典的鑒定方法是對病原進(jìn)行分離純化，基于形態(tài)學(xué)檢測、生理學(xué)和通過一系列的生理生化實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)對微生物的初步鑒定。然而，這種方法耗時長、操作繁瑣，不利于細(xì)菌性病害的快速診斷。法國生物梅里埃公司于1970年開發(fā)出一系列微生物鑒定用生理生化檢測試劑盒，使細(xì)菌鑒定更簡單快速。該系列試劑盒已成為國際公認(rèn)的鑒定細(xì)菌的參考標(biāo)準(zhǔn)，目前在海水養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性病害的診斷中，已將API系列試紙條檢測結(jié)果作為鑒定的輔助手段之一。Abdel-Aziz等采用API20NE生理生化檢測試劑盒與分子鑒定相結(jié)合，對導(dǎo)致埃及沿海養(yǎng)殖金頭鯛和歐洲海鱸大量死亡的病原進(jìn)行了鑒定，確定了溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種造成病害的主要病原。潘曉藝等根據(jù)API20E結(jié)果結(jié)合16SrDNA和gyrB基因序列比對，確定從發(fā)病養(yǎng)殖中華鱉肝臟分離得到的一株致病菌為遲鈍愛德華氏菌。除了API系列檢測試劑盒，針對一些特殊的細(xì)菌性病原還能夠采取更為簡便的顯色培養(yǎng)技術(shù)[20]。該技術(shù)在培養(yǎng)基中參加細(xì)菌特異性酶的顯色底物，使菌落出現(xiàn)不同顏色而到達(dá)分離鑒定的目的，如硫檸膽蔗瓊脂〔thiosulfatecitratebilesaltssucroseagar，TCBSagar〕已經(jīng)被廣泛用于霍亂弧菌和副溶血弧菌的分離鑒定。近年來還有很多新型顯色培養(yǎng)基被開發(fā)出來，如選擇性顯色弧菌培養(yǎng)基〔vibrio-biochromemedium，BCVM〕，副溶血弧菌在其上生長構(gòu)成的菌落呈紫色，而其他弧菌則呈藍(lán)綠色，能夠更有效的將副溶血弧菌與其他致病性弧菌區(qū)分開來。目前這種方法不僅被廣泛用于人類病原菌的初步分離鑒定，也越來越多地被應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害檢測中。1.2基于分子生物學(xué)技術(shù)的檢測方法基于分子生物學(xué)技術(shù)的養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性病害的檢測方法在已有報道文獻(xiàn)中占到50%以上，該方法與傳統(tǒng)的生理生化檢測方法相比簡潔、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于細(xì)菌性病害疾病的預(yù)警和診斷。1.2.1聚合酶鏈反響技術(shù)聚合酶鏈反響或稱多聚酶鏈反響(polymerasechainreaction，PCR)，是根據(jù)生物信息學(xué)等方法尋找特定病原菌特異性基因序列設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增后產(chǎn)生特異性片段進(jìn)而到達(dá)檢測病原菌的目的。目前多數(shù)文獻(xiàn)針對不同細(xì)菌性病害的特異性基因序列設(shè)計引物，建立了靈敏有效的檢測方法。Pinto等以toxR，tlh，tdh和trh作為目的基因?qū)崿F(xiàn)了副溶血弧菌的檢測；Lee等以創(chuàng)傷弧菌溶血素為靶標(biāo)，設(shè)計特異性引物建立其PCR檢測方法。隨著PCR技術(shù)的成熟，基于多種病菌的同時檢測的多重PCR技術(shù)逐步發(fā)展起來。Kong等建立了一種以嗜水氣單胞菌的氣單胞菌溶素基因、弗氏志賀菌ipaH基因、鼠傷寒沙門氏菌ipaB基因、霍亂弧菌epsM基因和副溶血弧菌16S-23SrDNA為目的基因，設(shè)計六對擴(kuò)增后可產(chǎn)生6種不同長度的片段的特異性引物來快速同時檢測水產(chǎn)品中這6種致病菌。此檢測方法可在12h內(nèi)完成，檢測限能夠到達(dá)100~102CFU/mL。1.2.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)〔loop-mediatedisother-malamplification，LAMP〕由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)需要準(zhǔn)確控制擴(kuò)增反響各階段溫度，一定程度上限制了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。Notomi等于2000年提出的一種只需在恒溫條件下就能夠進(jìn)行核酸擴(kuò)增的LAMP技術(shù)。LAMP通過設(shè)計兩對十分的引物〔內(nèi)引物和外引物〕在一種有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下進(jìn)行的一種自動鏈置換DNA合成反響。由于DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離成為單鏈，所以該技術(shù)在恒溫下就能夠進(jìn)行核酸擴(kuò)增，已被用于多種水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害的檢測。Yeh等根據(jù)鯰魚愛德華氏菌eip18基因設(shè)計引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，在65℃反響60min后可得到鯰魚愛德華氏菌基因特異性條帶，檢測限可到達(dá)20CFU/mL，能夠從養(yǎng)殖水體樣本中實(shí)現(xiàn)鯰魚愛德華氏菌的檢出。Surasilp等將LAMP與橫向流動試紙條分析相結(jié)合，以rpoS基由于靶基因建立了一種LAMP-LFD方法來檢測創(chuàng)傷弧菌，對于純培養(yǎng)檢測限可到達(dá)1.5×103CFU/mL。1.2.3實(shí)時定量PCR技術(shù)〔quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR〕qRT-PCR目前也被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的定量檢測。該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可同時檢測同一樣本中不同靶序列。Blackstone等以TaqMan探針為基礎(chǔ)，采用qRT-PCR技術(shù)以副溶血弧菌特異性tdh基因來檢測副溶血弧菌，檢測限可到達(dá)每PCR體系1CFU。Panicker等針對vvh基因設(shè)計寡核苷酸引物，建立了以SYBRGreenI染料為基礎(chǔ)的qRT-PCR快速、特異性地檢測牡蠣組織勻漿和墨西哥灣水體中的創(chuàng)傷弧菌。該方法對于純基因組DNA的最低檢測量為1pg，水體中檢測限可達(dá)10CFU/mL。許龍巖等根據(jù)副溶血弧菌toxR基因和tdh基因設(shè)計引物對副溶血弧菌建立了一種基于TaqMan探針的雙重?zé)晒釶CR檢測法。該方法具有良好的特異性，水體中常見非副溶血弧菌細(xì)菌均呈陰性，副溶血弧菌的菌濃度與Ct值的反向線性關(guān)系良好，檢測限為3.6×102CFU/mL。1.2.4基因探針技術(shù)自1975年DNA探針雜交技術(shù)被初次提出，基因探針技術(shù)已得到了很大的進(jìn)步和發(fā)展。該技術(shù)的基本根據(jù)是核酸雜交，針對決定病原菌生物體特性的DNA序列設(shè)計特異性標(biāo)記的DNA或RNA探針，就能夠通過樣品與探針雜交能否構(gòu)成雜交分子來檢測能否存在目的病原菌?；蛱结樀臉?biāo)記方法主要有放射性標(biāo)記法和非放射性標(biāo)記法兩種。目前常用的標(biāo)記物為堿性磷酸酶〔AP〕和地高辛〔DIG〕。該技術(shù)除用于人類病原診斷，也被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病原檢測中。周鳳麗等針對溶藻弧菌膠原蛋白酶基因和外膜蛋白基因設(shè)計了兩對引物對溶藻弧菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物以DIG標(biāo)記制備基因探針用于檢測溶藻弧菌，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白酶基因探針有較高特異性，可用于對溶藻弧菌的檢測鑒定分析。Raghunath等用AP來標(biāo)記基因探針檢測海洋食品中的trh+副溶血弧菌，對40株副溶血弧菌、45株其他弧菌和55株非弧菌進(jìn)行探針雜交，特異性達(dá)100%，檢測限到達(dá)5.0×102~3.4×103CFU/g。1.3基于免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)的檢測方法除分子生物學(xué)技術(shù)外，免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)也被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖品種病害診斷?；诿庖邔W(xué)相關(guān)的檢測方法利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，目前應(yīng)用較多的有酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析技術(shù)。1.3.1酶聯(lián)免疫吸附法〔enzyme-linkedimmuno-sorbentassay，ELISA〕ELISA技術(shù)最早出現(xiàn)于1971年，該技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原抗體特異性反響，常用的ELISA方法有競爭法測抗原、間接法測抗體和雙抗體夾心法，其特異性取決于抗體的特異性。Smith等最早將ELI-SA應(yīng)用于魚癤病的診斷，靈敏度達(dá)102CFU/mL。Kumar等建立了快速檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的ELISA方法。吳曉春等以魚腸道弧菌為抗原制備多克隆抗體，用ELISA法來檢測對海水魚造成危害的弧菌屬致病菌，靈敏度可到達(dá)每孔105CFU/mL。1.3.2免疫層析技術(shù)傳統(tǒng)ELISA技術(shù)操作繁瑣、耗時長，限制了其在養(yǎng)殖場現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。目前，研究工作者將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于快速檢測，如側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)(lateral-flowtechnology，LFT)被用于快速檢測試紙條的研發(fā)。與傳統(tǒng)檢測方法相比，該檢測技術(shù)具有快速、簡便、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)。LFT的原理與ELISA類似，以固定了捕獲蛋白(通常為抗體或抗原)的硝酸纖維素膜作為基板，采用乳膠、膠體金、碳以及新型材料(上轉(zhuǎn)磷光或量子點(diǎn))作為標(biāo)記物對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記，其檢測結(jié)果能夠用肉眼直接觀測。目前已商業(yè)化用于診斷的免疫層析試紙產(chǎn)品大多為以納米級膠體金顆粒為標(biāo)記材料。此技術(shù)操作簡便，一般5~15min就可得到結(jié)果，已廣泛用于藥殘檢測、食品安全、臨床診斷中，也有用于水產(chǎn)養(yǎng)殖品種病害檢測的報道。Sithigorngul等制備了抗哈維氏弧菌的鼠單克隆抗體和羊多克隆抗體，將這兩種抗體用于膠體金免疫層析試紙條的制備，結(jié)果表明樣品檢測量只需100μL，針對哈維氏弧菌的檢測限可達(dá)106CFU/mL以上，而檢測時間小于15min。秦璞等利用膠體金免疫層析技術(shù)研制了一種快速檢測遲鈍愛德華氏菌的試紙條，該試紙條對遲鈍愛德華氏菌有良好特異性，5~10min就能夠得到檢測結(jié)果，敏感度到達(dá)105CFU/mL。近年來，出現(xiàn)了基于新型材料和免疫層析技術(shù)，如目前報道較多的有量子點(diǎn)〔quantumdots，QDs〕、上轉(zhuǎn)磷光〔up-convertingphosphor，UCP〕、納米磁珠、熒光微球等標(biāo)記抗體的免疫層析。其中量子點(diǎn)與抗體偶聯(lián)后用于免疫層析顯示出良好的穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度，在人類病原菌檢測上已經(jīng)有所應(yīng)用。Tully等初步建立了一種以量子點(diǎn)標(biāo)記抗體檢測李斯特單增桿菌〔Listeriamonocytogenes〕外表蛋白InlB，檢測限能夠到達(dá)12ng/mL。上轉(zhuǎn)磷光材料則因其背景干擾小、靈敏度高等特點(diǎn)，被應(yīng)用于耶爾森氏菌和布魯氏菌的檢測中，其靈敏度是膠體金免疫層析技術(shù)的10倍。目前，以上新型材料還未見用于魚類病原菌檢測的報道，但這些材料在將來檢測試紙條研制中顯示出良好的應(yīng)用前景。1.4芯片技術(shù)隨著近年來生物芯片技術(shù)的發(fā)展，以及病害檢測對大規(guī)模、高通量的要求，芯片技術(shù)越來越多被用到病原菌的檢測中。其中，應(yīng)用最多的是基因芯片和蛋白芯片技術(shù)。基因芯片技術(shù)能夠高通量、平行化對多種靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為菌種鑒定提供了技術(shù)平臺。Panicker等也通太多重PCR與DNA芯片相結(jié)合建立了一種主要針對創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌檢測沿海水域和甲殼類動物中的致病弧菌的方法，檢測靈敏度為102~103CFU/mL。蛋白芯片又稱蛋白微陣列，蛋白芯片是將各蛋白有序排列固定在載體上，之后用特異性標(biāo)記的抗體或抗原蛋白與微陣列作用，經(jīng)過掃描后確定蛋白間能否有互相作用。與基因芯片相比，蛋白芯片的研究仍處于探索階段。究其原因是由于蛋白質(zhì)分子本身構(gòu)造功能的復(fù)雜性與特殊性造成的。目前蛋白芯片用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害檢測的報道較少。2現(xiàn)有海水養(yǎng)殖細(xì)菌性病害檢測方法的利弊及發(fā)展方向綜上所述，目前已報道多種海水養(yǎng)殖細(xì)菌性病害的檢測方法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，相比擬而言，基于細(xì)菌富集培養(yǎng)及生理生化指標(biāo)檢測的方法耗時、費(fèi)力、精度和可靠性有限；基于分子生物學(xué)技術(shù)的檢測方法固然靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確，能夠檢測出樣品中的微量核酸，但是需要特定儀器設(shè)備并由專業(yè)技術(shù)人員操作，無法應(yīng)用于基層養(yǎng)殖單位；基于免疫學(xué)技術(shù)ELISA檢測方法操作流程耗時繁瑣，無法實(shí)現(xiàn)對樣品的實(shí)時檢測。目前廣泛采用的膠體金免疫層析技術(shù)固然操作簡便、耗時短、不需要專業(yè)技術(shù)人