DB37-T 3894-2020 大白菜蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程-（高清版）

ICS 65.020B01

DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3894—2020術(shù)規(guī)程DetectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusinDetectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusinChinesecabbage2020033120200501山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳斌、辛相啟、王升吉、姜珊珊、張眉、辛志梅。大白菜蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍ELISADot-ELISART-PCR本標(biāo)準(zhǔn)適用于山東省蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒在傳播介體蚜蟲(chóng)和大白菜中的檢測(cè)。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法用直徑33cm的35目紗網(wǎng)在田間隨機(jī)進(jìn)行掃撲，分揀裝入試劑瓶中，100%乙醇浸泡，-20℃以下冰箱保存?zhèn)溆谩?.2葉片樣品采集TuMVCMV2°C～8°C-80℃4主要儀器設(shè)備、用具和試劑儀器設(shè)備主要有：0.001g）；PCRj)樣品冷藏柜；k)低溫冰箱（-20°C）；（-80°C）；（10μL100μL200μL、1000μL）用具用具主要有：RNase（10μL、100μL、200μL1000μL）；（NCRNasePCRTuMVCMVTuMVCMVTrizolM-MLVRTRNATaqDNADNAGelred試驗(yàn)用水為無(wú)菌超純水或去離子水，均符合GB/T6682-2008。血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)試劑配制見(jiàn)附錄A。檢測(cè)RNAELISA、Dot-ELISA和RT-PCR300μL4h～5h8000r/min3minCMVRT-PCR加樣100μL，4°C12h～16h洗板孵育結(jié)束后，用PBST清洗酶標(biāo)板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min～2min。用抗體稀釋緩沖液按照相應(yīng)病毒抗血清的使用濃度進(jìn)行稀釋，每孔加入稀釋好的抗體液100μL，加蓋，37°C孵育1.5h。洗板同5.2.3。1.5h洗板同5.2.3。將現(xiàn)配的底物緩沖液按100μL/孔，加入到酶聯(lián)板中，室溫避光孵育1h。讀數(shù)100μL3mol/LNaOH405nm（OD405）NC剪裁7cm×7cm大小的NC膜，用鉛筆在保護(hù)紙外劃成7mm×7mm大小的方格，劃好后去掉保護(hù)紙備用。300μLPBS0.1g1：PBS8000r/minCMVRT-PCR加樣分別取2μL制備好的待檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照，點(diǎn)到NC膜的相應(yīng)格子中，室溫干燥10min。每個(gè)樣品平行在膜上重復(fù)一次。封閉在平皿（F9cm）中加入20mL封閉液，并將干燥好的NC膜浸入，室溫下封閉30min。用封閉液按照相應(yīng)病毒抗血清的工作濃度進(jìn)行稀釋，并將NC膜浸入，室溫孵育30min～60min。洗膜將平皿中抗體液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。用抗體稀釋緩沖液按說(shuō)明將酶標(biāo)抗體稀釋至工作濃度，并將NC膜浸入，室溫孵育30min～60min。洗膜同5.3.6。顯色顯色底物NBT66μL和BCIP33μL加到10mL底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)，待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)終止反應(yīng)（顯色5min～20min），即在蒸餾水中漂洗，肉眼觀察并記錄結(jié)果。RNA0.1gRNase1.5mL1mL的Trizol5min；4°C，12000g10min離心約離心1m74C700離心5i5mi～1mi，溶于30μLRNase的ddH2O-80°CTuMV或CMVRT-PCR委托引物合成公司進(jìn)行引物合成，引物配制成10μmol/L儲(chǔ)存液備用，引物序列見(jiàn)表1。表1檢測(cè)引物序列檢測(cè)病毒引物名稱及序列擴(kuò)增片段大小蕪菁花葉病毒TuMV-F:5′-GTAACCAAGACCGACCATAC-3′228bpTuMV-R:5′-TATGCCTCTCCGTGTTCT-3′黃瓜花葉病毒CMV-F:5′-AACCACCCAACCTTTGTAG-3′460bpCMV-R:5′-GCTCGACGTCAACATGAA-3′逆轉(zhuǎn)錄總體積為20μL。在無(wú)RNase的PCR管中依次加入3μL待檢測(cè)RNA，1μL相應(yīng)病毒下游擴(kuò)增引物無(wú)RNase的65°C5min5minPCRM-MLVRT（200U/μL）1μL、RNasin（40U/μL）1μL、5×RT4μL、dNTP（10mmol/L）2μLPCR儀中42°C反應(yīng)1h，70°C反應(yīng)5min。同樣處理陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，合成的cDNA置于-20°C以PCR依次在滅菌的PCR管中加入ddH2O14.8μL、10×PCR緩沖液2.5μL、MgCl2（25mmol/L）2.5μL、dNTP（10mmol/L）2μL、10pmol/μL上游引物1μL、10pmol/μL下游引物1μL、Taq酶（5U/μL）0.2μL、cDNA模板1μLPCR95°C5min，95°C30s，56°C30s，72°C1min，35制備1%的瓊脂糖凝膠。取上述PCR產(chǎn)物10μL，加入1μL上樣緩沖液，混勻后移入膠孔，并在樣品孔DNA30minOD405值）OD405值<0.15；OD405OD405>2；以上同時(shí)具備則本批次檢測(cè)有效，否則判定本批次檢測(cè)無(wú)效，需重新檢測(cè)。OD405值OD405值>2OD405值OD405值=2OD405值OD405<2肉眼觀察，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)棕紅色或深褐色圓形斑點(diǎn)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)顯色斑點(diǎn)。重復(fù)孔結(jié)果不一致時(shí)，視此次結(jié)果無(wú)效，需進(jìn)行重新驗(yàn)證。陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照正確，且樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，判定結(jié)果為陰性。檢測(cè)結(jié)果表述如下：附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制（pH9.6）碳酸鈉（Na2CO3）1.59g，碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.6，用蒸餾水定容至1000mL。PBST（pH7.4）氯化鈉（NaCl）8.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15g，氯化鉀（KCl）0.2g，0.5mLTween-20，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，蒸餾水定容至1000mL。PVP（MW24～4000）（聚乙烯吡絡(luò)烷酮）2g，脫脂奶粉1g，溶解于100mLPBST中。（pH9.8）容至100mL。）1mgPNPP（對(duì)-硝基苯磷酸二鈉）溶于1mL底物緩沖液中。容至100mL。）1mgPNPP（對(duì)-硝基苯磷酸二鈉）溶于1mL底物緩沖液中?？寡鍓A性磷酸酶標(biāo)記抗體。A.2斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定PBS（pH7.2）氯化鈉（NaCl）8.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15g，氯化鉀（KCl）0.2g，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，蒸餾水定容至1000mL。PBST（pH7.4）氯化鈉（NaCl）8.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15g，氯化鉀（KCl）0.2g，0.5mLTween-20，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，蒸餾水定容至1000mL。封閉液取脫脂奶粉5g加入到100mLPBST，充分溶解，4°C保存。（pH9.5）Tris·Cl12.11g，氯化鎂（MgCl2）2.38g，氯化鈉（NaCl）5.85g，溶解于900mL蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.5，用蒸餾水定容至1000mL。）BCIP(50mg/mL)溶于100%二甲基甲酰胺；NBT(50mg/mLl)溶于70%二甲基甲酰胺。每5mL底物稀釋緩沖液中先加入33μL的NBT，混勻后再加入16.5μL的BCIP，該試劑配制好后，應(yīng)在1h內(nèi)使用?？寡?