食品微生物綜合實(shí)訓(xùn)-酸奶生產(chǎn)中微生物檢驗(yàn)與控制

食品微生物綜合實(shí)訓(xùn)-酸奶生產(chǎn)中微生物檢驗(yàn)與控制食品微生物綜合實(shí)訓(xùn)-酸奶生產(chǎn)中微生物檢驗(yàn)與控制食品微生物綜合實(shí)訓(xùn)-酸奶生產(chǎn)中微生物檢驗(yàn)與控制V:1.0精細(xì)整理，僅供參考食品微生物綜合實(shí)訓(xùn)-酸奶生產(chǎn)中微生物檢驗(yàn)與控制日期：20xx年X月酸奶生產(chǎn)系統(tǒng)中微生物檢驗(yàn)點(diǎn)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（以酸奶生產(chǎn)為例）3.1產(chǎn)品生產(chǎn)工藝描述酸奶是以新鮮的牛奶為原料經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后再向牛奶中添加有益菌（發(fā)酵劑），經(jīng)發(fā)酵后，再冷卻灌裝的一種牛奶制品。按照是否加糖，酸奶可分為淡酸奶和加糖酸奶兩種，我國(guó)常見(jiàn)的酸奶制品是加糖酸奶，即在制作酸奶的原料乳中加入一定量的白糖進(jìn)行發(fā)酵得到的酸奶產(chǎn)品。酸奶營(yíng)養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)和鈣質(zhì)較鮮乳更易消化吸收，抑制腐敗細(xì)菌的繁殖，降低腸道內(nèi)毒素濃度。酸奶內(nèi)含乳酸菌并在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸及族維生素等,能增強(qiáng)消化，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和機(jī)體物質(zhì)的代謝，提高人的免疫力,長(zhǎng)期飲用即可保證鈣質(zhì)的需求,又可健腸胃,是一種對(duì)人體腸胃非常有益的保健食品。3.1.1酸奶的生產(chǎn)工藝1）凝固型酸奶生產(chǎn)工藝流程原料奶驗(yàn)收→標(biāo)準(zhǔn)化→均質(zhì)→殺菌→冷卻→接種→攪拌→灌裝封口→發(fā)酵→冷卻→后熟→凝固型酸乳2）攪拌型酸奶生產(chǎn)工藝流程原料奶驗(yàn)收→標(biāo)準(zhǔn)化→均質(zhì)→殺菌→冷卻→發(fā)酵→攪拌→灌裝封口→冷藏后熟→攪拌型酸乳↑果料、香精前者先冷卻，分裝后培養(yǎng)發(fā)酵。后者先冷卻接種，發(fā)酵后分裝。凝固型酸乳用于純酸奶的生產(chǎn)，攪拌型酸乳還可用于果味、果料等花色品種酸奶的生產(chǎn)。一般凝固型純酸奶要有良好的組織狀態(tài)，要防止有裂紋出現(xiàn)，因此要先攪拌分裝再發(fā)酵。帶有果料的酸奶影響乳酸菌的發(fā)酵，不能保持良好的組織狀態(tài)，故采用先發(fā)酵后攪拌加果料的方式。3.1.2操作要點(diǎn)1）原輔料驗(yàn)收（1）原料乳驗(yàn)收原料奶必須符合GB19301—2010《食品安全標(biāo)準(zhǔn)生乳》規(guī)定的各項(xiàng)要求，嚴(yán)格進(jìn)行感官、理化、微生物等指標(biāo)的檢驗(yàn)，驗(yàn)收原料奶單位必須具備《生鮮乳收購(gòu)許可證》，每批原料驗(yàn)收包括：感官、酒精、密度、脂肪、蛋白質(zhì)、冰點(diǎn)、非脂乳固體、抗生素以及摻假檢測(cè)。定期監(jiān)測(cè)致病菌、重金屬、黃曲霉等指標(biāo)。（2）凈乳收購(gòu)站對(duì)驗(yàn)收合格的生乳用180目雙聯(lián)過(guò)濾器可去除生乳中的細(xì)小污物，操作簡(jiǎn)單方便。（3）冷藏若不能及時(shí)加工，采用板式換熱器將過(guò)濾后的牛乳冷至2～4℃，泵入儲(chǔ)奶罐暫存，但不得超過(guò)24h。（4）輔料驗(yàn)收根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)輔料進(jìn)行驗(yàn)收，驗(yàn)收項(xiàng)目可包括：感官、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、查驗(yàn)供方檢驗(yàn)報(bào)告、生產(chǎn)許可標(biāo)識(shí)、微生物等指標(biāo)。2）配料選擇符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的各種原輔料如牛乳、乳粉、砂糖和穩(wěn)定劑等。稱(chēng)料、拌料、配料必須準(zhǔn)確計(jì)量，與原料攪拌均勻，實(shí)現(xiàn)溫度和時(shí)間的良好控制。乳粉、砂糖混合后加50～60℃溫水溶解。瓊脂、明膠等穩(wěn)定劑可與少量糖混合，加水、加熱充分溶解后添加。2）均質(zhì)均質(zhì)的目的是防止脂肪上浮使脂肪微?；纳瓶诟?。一般采用高壓均質(zhì)機(jī)，均質(zhì)工藝條件：均質(zhì)前應(yīng)先將混合料預(yù)熱至50～60℃，均質(zhì)壓力為9.8124.5MPa.3）殺菌、冷卻殺菌的目的：①除去原料乳中的氧，降低氧化還原反應(yīng)，能夠明顯促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)。②由于蛋白質(zhì)的變性改善了牛乳的硬度與組織狀態(tài)，能夠有效防止乳清分離。殺菌及冷卻的條件：殺菌條件90℃、15min。經(jīng)殺菌后的混合料冷卻到40～45℃?zhèn)溆谩＿€可以采用高溫瞬時(shí)殺菌，即135～140℃加熱2～3秒左右。這樣有利于營(yíng)養(yǎng)成分的保存，又減少了煮沸氣味。4）乳酸菌發(fā)酵劑的制備①酸奶常用的乳酸菌發(fā)酵劑常將菌種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合用作發(fā)酵劑，二者的菌株配比為2:1～1:1。②發(fā)酵劑的制備首先將購(gòu)買(mǎi)的發(fā)酵劑或保藏的菌種活化，制成母發(fā)酵劑，檢驗(yàn)合格后，將母發(fā)酵劑放大培養(yǎng)，制作中間發(fā)酵劑，檢驗(yàn)合格后，進(jìn)一步放大培養(yǎng)制成工作發(fā)酵劑。③工藝條件及接種量選用處于對(duì)數(shù)期的種子液接種，一般接種量為2.0～3.0%。主發(fā)酵溫度為42～45℃，時(shí)間為2.5～3.5h。通常，低產(chǎn)酸力的發(fā)酵劑接種量要多，高產(chǎn)酸力的發(fā)酵劑接種量要少。一般低接種量按0.5～1.0%，高接種量按5.0%以上，最適接種量為2.0～3.0%。主發(fā)酵溫度采用42～45℃，這是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合后的最適生長(zhǎng)溫度。生產(chǎn)中，我們要注意控制好三個(gè)因素：接種量、發(fā)酵劑活性和培養(yǎng)溫度。5）發(fā)酵條件的控制灌裝或分裝完成后，應(yīng)迅速入發(fā)酵室發(fā)酵，在42～43℃條件下發(fā)酵2.5～4h，以奶液達(dá)到凝固狀態(tài)為準(zhǔn)。此時(shí)酸度0.7～0.8，pH低于4.6。此時(shí)，需迅速轉(zhuǎn)移至2～6℃的冷庫(kù)中存放12h防止過(guò)酸，促進(jìn)芳香物質(zhì)產(chǎn)生，并增加制品的粘稠度。6）發(fā)酵終點(diǎn)的判斷酸奶發(fā)酵時(shí)，指示終點(diǎn)的條件是組織狀態(tài)為凝固狀態(tài)，沒(méi)有過(guò)多乳清分離現(xiàn)象。7）冷卻灌裝發(fā)酵好的酸奶通過(guò)冷卻系統(tǒng)將產(chǎn)品冷卻至25℃以下，組織狀態(tài)正常即可進(jìn)行灌裝。果料、花瓣酸奶可在灌裝前加入果料、果汁或花瓣。灌裝前要對(duì)灌裝機(jī)、輸送帶清洗殺菌、包裝材料必須衛(wèi)生無(wú)污染。灌裝過(guò)程中要防止交叉污染，確保灌裝過(guò)程衛(wèi)生。8）冷藏與后熟在2～6℃冷藏，48～72h產(chǎn)品后熟后即可銷(xiāo)售。3.2產(chǎn)品生產(chǎn)系統(tǒng)中微生物檢驗(yàn)點(diǎn)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)3.2.1原料奶1）收購(gòu)原料奶中菌落總數(shù)的檢測(cè)根據(jù)發(fā)達(dá)國(guó)家的調(diào)查，一般鮮奶中不可避免的細(xì)菌數(shù)是102～103cfu/mL；在極其嚴(yán)格的無(wú)菌操作下，用機(jī)器擠出的奶的細(xì)菌總數(shù)為104cfu/mL，對(duì)鮮奶的影響較??；但原料奶受到污染，細(xì)菌總數(shù)達(dá)到106～107cfu/mL時(shí)，鮮奶就會(huì)出現(xiàn)令人覺(jué)察或檢出的缺陷。這是導(dǎo)致奶產(chǎn)品變質(zhì)的直接原因。變質(zhì)產(chǎn)品表現(xiàn)為產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、變粘或同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣、蛋白熱穩(wěn)定性下降或呈粥樣，帶苦味、嚴(yán)重異味，不論對(duì)消費(fèi)者的健康還是產(chǎn)品的市場(chǎng)形象都是危害最大的。同時(shí)，細(xì)菌總數(shù)高，其中的致病菌可產(chǎn)生非常耐熱的毒素，這些毒素經(jīng)超高溫處理后仍有少量殘留，消費(fèi)者飲用后，會(huì)導(dǎo)致中毒。大量細(xì)菌繁殖會(huì)加速產(chǎn)酸，從而引起原料奶酸度增加，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性下降。國(guó)外對(duì)原料奶細(xì)菌總數(shù)衛(wèi)生指標(biāo)控制十分嚴(yán)格，荷蘭鮮奶的收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)中要求細(xì)菌總數(shù)小于2.5×105cfu/mL；在瑞士細(xì)菌總數(shù)超過(guò)105cfu/mL將被降低奶款，甚至拒付奶款；歐共體1993年規(guī)定液態(tài)奶制品的原料奶細(xì)菌總數(shù)不能超過(guò)105cfu/mL。因此，在酸奶生產(chǎn)中，原料乳中微生物總數(shù)的測(cè)定對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制尤為重要。本文參照GB設(shè)計(jì)了原料奶中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法。（1）實(shí)訓(xùn)目的掌握原料奶中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法；熟悉原料奶驗(yàn)收時(shí)微生物的指標(biāo)的檢測(cè)與控制。（2）實(shí)訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、平皿、無(wú)菌刀、三角瓶、大試管、吸量管、酒精燈（3）實(shí)訓(xùn)步驟①培養(yǎng)基制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏1g、酵母膏2g、蛋白胨5g、NaCL5g，加水定容至1000ml，調(diào)PH為7.4。分裝后按照1.5～1.8%的添加量加入瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基，于121℃高壓滅菌20min。②樣品采集與預(yù)處理a.樣品采集以無(wú)菌刀、勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，放入滅菌容器內(nèi)，立即送檢，如條件不許可時(shí)，最好不超過(guò)4h，送檢樣時(shí)應(yīng)注意冷藏。b.樣品的預(yù)處理無(wú)菌條件下打開(kāi)采樣容器的瓶口，將樣品充分混勻，且瓶口經(jīng)火焰滅菌后，稱(chēng)取25g（或吸取25ml）檢樣，放入裝有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶?jī)?nèi)，振搖混勻，得10-1的樣品稀釋液。再按照?qǐng)D3-1所示進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e制得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液。圖3-1樣品梯度稀釋液的制備③傾注平板根據(jù)原料奶的污染情況，分別吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀釋梯度的樣品稀釋液各1mL，加到已滅菌的平皿中，再將融化后已經(jīng)冷卻至45℃左右但尚未冷凝的固體培養(yǎng)基傾注入平皿，然后迅速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，將培養(yǎng)基和菌液混合均勻。④菌落計(jì)數(shù)待傾注好的平板完全凝固后，倒置，于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72±2h。培養(yǎng)完成后，取出培養(yǎng)皿，肉眼觀(guān)察，必要時(shí)可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)。以菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）表示。選取菌落數(shù)在10CFU～150CFU的平板，作為有效梯度的記錄數(shù)，當(dāng)菌落蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平板的可記錄為多不可計(jì)。菌落數(shù)應(yīng)采用三個(gè)平板的平均數(shù)。（4）實(shí)訓(xùn)結(jié)果與報(bào)告計(jì)算三個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)的計(jì)算結(jié)果。若所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算；如為原液，則以小于1計(jì)數(shù)。菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)時(shí)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100時(shí)，前3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來(lái)表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，此時(shí)也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。（5）實(shí)訓(xùn)注意事項(xiàng)①營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基一般按照1.5%的添加量加入瓊脂粉，若在夏天或環(huán)境溫度較高時(shí)也可適當(dāng)增加至1.8%。若用瓊脂條代替瓊脂粉，一定要將瓊脂條充分融溶后再分裝，否則，瓊脂分散不均勻?qū)⒂绊懢w生長(zhǎng)以及菌落分布。②樣品梯度稀釋時(shí)，要用0.85%的生理鹽水或者PBS緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)粲脽o(wú)菌水代替，易使菌體細(xì)胞滲透壓急速下降而造成細(xì)胞破裂，使計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。③傾注平板時(shí)，一定要等熔融的培養(yǎng)基溫度降至45℃以下（不燙手）時(shí)，方可傾注，否則，培養(yǎng)基溫度過(guò)高易將菌體熱致死，也將使計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。④傾注平板后要迅速轉(zhuǎn)動(dòng)平板，在培養(yǎng)基凝固前趁機(jī)將菌液和培養(yǎng)基充分混勻，否則，菌落生長(zhǎng)成片，影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。⑤計(jì)數(shù)時(shí)，平板上的大小菌落均要計(jì)算在內(nèi)。2）原料奶中的芽孢總數(shù)及耐熱芽孢總數(shù)原料奶中通常既含有細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，也含細(xì)菌的芽孢。形成芽孢的有芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、芽孢乳桿菌、脫硫胎狀菌和芽孢八疊球菌5個(gè)屬。原料奶中常見(jiàn)的芽孢桿菌屬有：枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等。它們的適宜生長(zhǎng)溫度為20℃～40℃，最高生長(zhǎng)溫度可達(dá)55℃。這類(lèi)細(xì)菌廣泛存在于牛舍和飼料中，其芽孢體對(duì)熱和干燥具有較強(qiáng)的抵抗力。原料奶中芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌和嗜冷菌等細(xì)菌所產(chǎn)生的芽孢在超高溫滅菌后仍能存活，并導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗，所以，雖然國(guó)標(biāo)并未將芽孢總數(shù)檢測(cè)規(guī)定為必檢項(xiàng)目，它卻是酸奶生產(chǎn)企業(yè)在原料奶驗(yàn)收時(shí)嚴(yán)格保障產(chǎn)品質(zhì)量的一項(xiàng)重要檢測(cè)項(xiàng)目。將原料奶在80℃條件下加熱10min,可殺死絕大多數(shù)微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,僅有少數(shù)耐熱細(xì)菌的芽孢存活。使用熱處理的原料奶直接作細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定就可測(cè)出原料奶的芽胞總數(shù)。（1）實(shí)訓(xùn)目的掌握原料奶中芽孢及耐熱芽孢總數(shù)的檢測(cè)方法；明確原料奶中芽孢及耐熱芽孢總數(shù)檢驗(yàn)的意義。（2）實(shí)訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、平皿、無(wú)菌刀、三角瓶、大試管、吸量管、酒精燈、恒溫水浴鍋、穩(wěn)定計(jì)（3）實(shí)訓(xùn)步驟①培養(yǎng)基制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏1g、酵母膏2g、蛋白胨5g、NaCL5g，加水定容至1000ml，調(diào)PH為7.4。分裝后按照2%的添加量加入瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基，于121℃高壓滅菌20min。②芽孢總數(shù)測(cè)定a.以無(wú)菌刀、勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，放入滅菌容器內(nèi)，立即送檢。b.用10ml滅菌吸管吸取5ml奶樣加入滅菌試管中。在另一支試管加入與奶樣等量的水。在裝水的試管中插一支溫度計(jì)。c.將裝有奶樣和水的試管同時(shí)放入熱水中（在電爐上用白瓷缸把水煮至有小氣泡時(shí)）。直至“裝水試管”的溫度達(dá)到80℃，計(jì)時(shí)10分鐘。d.10分鐘后，取出試管，用冷水沖，使含奶樣的試管冷卻。用1ml滅菌吸管分別吸1ml冷卻后的奶樣于兩個(gè)滅菌平皿中。e.及時(shí)將冷卻至46℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混勻；同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂分別注入加有1ml滅菌生理鹽水的平皿和另一個(gè)滅菌的空白平皿內(nèi)，做空白對(duì)照。f.待營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板。置于36±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72±2h，取出計(jì)數(shù)。③耐熱芽孢總數(shù)測(cè)定a.用10ml滅菌吸管吸取5ml奶樣加入滅菌試管中。在另一支試管加入與奶樣等量的水，在裝水的試管中插一支溫度計(jì)。b.將裝有奶樣和水的試管同時(shí)放入沸水浴中（在電爐上用白瓷缸把水煮沸，并保持沸騰）。直至“裝水試管”的溫度達(dá)到100℃，計(jì)時(shí)10分鐘。c.10分鐘后，取出試管，用冷水沖，使含奶樣的試管冷卻。用1ml滅菌吸管分別吸1ml冷卻后的奶樣于兩個(gè)滅菌平皿中。d.及時(shí)將冷卻至46℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使之混勻?qū)I(yíng)；同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂分別注入加有1ml滅菌生理鹽水的平皿和另一個(gè)滅菌的空白平皿內(nèi)，做空白對(duì)照。e.待營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板。置于55±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48～72h，取出計(jì)數(shù)。（4）實(shí)訓(xùn)結(jié)果與報(bào)告計(jì)算三個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算；如為原液，則以小于1計(jì)數(shù)。（5）實(shí)訓(xùn)注意事項(xiàng)①若用瓊脂條代替瓊脂粉，一定要將瓊脂條充分融溶后再分裝，否則，瓊脂分散不均勻?qū)⒂绊懢w生長(zhǎng)以及菌落分布。②耐熱芽孢總數(shù)測(cè)定時(shí)，樣品需在沸水浴中達(dá)到100℃，如果水不到100℃就沸騰，則等候時(shí)間需延長(zhǎng)；或在水中加入鹽以提供高沸點(diǎn)溫度，但要避免奶樣沸騰。③傾注平板時(shí)，培養(yǎng)基溫度也不宜過(guò)低，否則培養(yǎng)基凝固太快，菌體不易分散均勻，使長(zhǎng)出的菌落不能均勻散開(kāi)。④傾注平板后要迅速轉(zhuǎn)動(dòng)平板，在培養(yǎng)基凝固前趁機(jī)將菌液和培養(yǎng)基充分混勻，否則，菌落生長(zhǎng)成片，影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.2.2發(fā)酵劑活力的測(cè)定1）以產(chǎn)酸率確定發(fā)酵劑活力向滅菌脫脂乳中加3%發(fā)酵劑，在適宜溫度下（42℃）培養(yǎng)3.5小時(shí)，滴定其酸度。以乳酸酸度值來(lái)表示發(fā)酵劑活力稱(chēng)取10g（精確到0.001g）已混勻的試樣，置于150mL錐形瓶中，加20mL新煮沸冷卻至室溫的水，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液電位滴定至pH8.3為終點(diǎn)；或于溶解混勻后的試樣中加入2.0mL酚酞指示液，混勻后用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，并在30s內(nèi)不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)，代入下面公式中進(jìn)行計(jì)算。試樣中的酸度數(shù)值以（oT）表示，按下式計(jì)算：c×V×100X=——————————×0.009m×0.1式中：X——試樣的酸度，單位為度（oT）；c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；V——滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mL）；m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；0.1——酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）。0.009——相當(dāng)于乳酸（90%）的量在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。并非活力越強(qiáng)發(fā)酵劑質(zhì)量越好，酸度應(yīng)控制在0.65～1.15范圍內(nèi)，其中0.8～0.95最佳，發(fā)酵劑活力與最佳接種量的關(guān)系可參考如下參數(shù)：活力大于0.9時(shí)，接種量2.0-2.5%活力在0.8-0.9時(shí)，接種量3.0-3.5%活力在0.7-0.8時(shí)，接種量3.5-4.0%活力在0.6-0.7時(shí)，接種量5.0%活力小于0.6的發(fā)酵劑不適于在酸奶生產(chǎn)中使用。2）刃天青還原法將1毫升發(fā)酵劑加入9毫升滅菌脫脂乳中，并加0.005%刃天青溶液1毫長(zhǎng)，36.7℃保溫30分鐘后開(kāi)始檢查，其后每5分鐘觀(guān)察一次結(jié)果，淡粉紅色為終點(diǎn)?；盍玫陌l(fā)酵劑應(yīng)在35分鐘內(nèi)還原丸天青。50~60分鐘還原的發(fā)酵劑3）以凝乳時(shí)間判斷發(fā)酵劑活力稱(chēng)取一定量的脫脂乳粉，配制成12%的復(fù)原乳，然后蒸煮15min，或者118℃、15min進(jìn)行高壓滅菌處理。復(fù)原乳冷卻至接種溫度后，按照2%的接種量接入待測(cè)發(fā)酵劑，混合后在待測(cè)菌種的最適溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，觀(guān)察并記錄凝乳時(shí)間。凝乳時(shí)間越長(zhǎng)，表明發(fā)酵劑的活力越差，凝乳越快，表明發(fā)酵劑活力越強(qiáng)。酸奶生產(chǎn)監(jiān)測(cè)中，性能優(yōu)良的發(fā)酵劑按照一定的接種量，凝乳時(shí)間一般控制在2.5～3h，可據(jù)此判斷新的一批發(fā)酵劑的活力是否能夠達(dá)到實(shí)際投產(chǎn)的要求。該法簡(jiǎn)便易行，不需試劑與繁瑣的檢測(cè)設(shè)備，也不破壞樣品的組織結(jié)構(gòu)，但需要連續(xù)觀(guān)察，較費(fèi)時(shí)，且有一定的主觀(guān)差異性。3.2.3發(fā)酵劑純度的測(cè)定（1）實(shí)訓(xùn)目的熟練掌握鏡檢法簡(jiǎn)單快速地判斷酸奶發(fā)酵劑的純度；進(jìn)一步熟悉革蘭氏染色的操作過(guò)程及顯微鏡的使用。（2）實(shí)訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種針、滴瓶（帶膠頭滴管）、三角瓶、棉塞、滴管、大試管（3）實(shí)訓(xùn)步驟①種子發(fā)酵劑的采樣與預(yù)處理以無(wú)菌勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，無(wú)菌條件下將樣品充分混勻，且瓶口經(jīng)火焰滅菌后，稱(chēng)取10g（或吸取10ml）檢樣，放入裝有90ml滅菌生理鹽水的三角瓶?jī)?nèi)，振搖混勻，得10-1的樣品稀釋液。②樣品的革蘭氏染色a.涂片用移液槍吸取10ul已稀釋好的樣品液滴在載玻片的中央，用燒紅冷卻后的接種環(huán)將液滴涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過(guò)大。b.干燥與固定將涂布樣品面向上，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)完全后，在酒精燈火焰處盡快的來(lái)回通過(guò)2-3次，共約2-3秒種，不覺(jué)過(guò)燙為宜（不超過(guò)60℃），放置待冷后，進(jìn)行染色。c.初染在涂片薄膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min后，水洗去除表面的結(jié)晶紫，至洗下的水呈無(wú)色為止。d.媒染用移液槍吸取約300ul碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約1min后，再次水洗。e.脫色斜置載玻片，滴加95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時(shí)20-30S，隨即水洗。f.復(fù)染在涂片薄膜上滴加番紅染液1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min后水洗至洗下的水呈無(wú)色。③鏡檢取制好的玻片用吸水紙吸掉水滴，將載玻片晾干或吹干后置顯微鏡下觀(guān)察，先用低倍鏡觀(guān)察，確定染色區(qū)及目標(biāo)視野后滴一滴香柏油在玻片上，再用油鏡觀(guān)察細(xì)菌的顏色及細(xì)胞形態(tài)。（4）實(shí)訓(xùn)結(jié)果與報(bào)告酸奶發(fā)酵劑中正常的乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，鏡檢為紫色，呈球狀或桿狀，若有其他形態(tài)的菌株，可疑似為污染的雜菌，需進(jìn)一步鑒定，方可投產(chǎn)。（5）實(shí)訓(xùn)注意事項(xiàng)①涂片時(shí)，不宜取樣過(guò)多，且不可涂布面積過(guò)大，否則，菌樣過(guò)于分散，不易觀(guān)察。②將菌樣蒸干與固定時(shí)，切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形，影響菌體形態(tài)的觀(guān)察與判斷。③脫色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則可能使菌體脫色過(guò)度，鏡檢時(shí)看不到明顯的紫色菌體。3.2.41）乳酸菌活菌計(jì)數(shù)酸奶中乳酸菌的含量是評(píng)價(jià)產(chǎn)品對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)與健康作用的重要指標(biāo)，新的酸奶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中（GB/T4789.35-2003）規(guī)定市售酸奶中的乳酸菌活菌數(shù)不得低于1×106cfu/mL。作為保健食品的酸奶，應(yīng)突出乳酸菌并保持一定的活菌數(shù)，若成品中乳酸菌活菌數(shù)較少，則達(dá)不到酸奶制品應(yīng)有的功效。由于酸奶中乳酸菌活菌的數(shù)量直接影響著產(chǎn)品的質(zhì)量，所有乳酸菌活菌計(jì)數(shù)成為判斷產(chǎn)品是否合格的重要指標(biāo)，也是生產(chǎn)中成品檢驗(yàn)必不可少的一項(xiàng)。乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)：采用MRS培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)法，于42℃厭氧條件下培養(yǎng)2-3d后計(jì)數(shù)。（1）實(shí)訓(xùn)目的掌握酸奶中乳酸菌活菌數(shù)的檢測(cè)方法；了解酸奶中乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定的意義。（2）實(shí)訓(xùn)器材高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、平皿、無(wú)菌刀、三角瓶、大試管、吸量管、酒精燈（3）實(shí)訓(xùn)步驟①培養(yǎng)基制備MRS培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸氫二銨2g、磷酸氫二鉀2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.2g、吐溫801mL，加水定容至1000ml，PH自然。分裝后按照2%的添加量加入瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基，于121℃高壓滅菌20min。②樣品預(yù)處理a.樣品采集以無(wú)菌刀、勺取樣，采取不同部位具有代表性的檢樣，放入滅菌容器內(nèi)，立即送檢，如條件不許可時(shí)，最好不超過(guò)4h，送檢樣時(shí)應(yīng)注意冷藏。b.樣品的預(yù)處理無(wú)菌條件下打開(kāi)采樣容器的瓶口，將樣品充分混勻，且瓶口經(jīng)火焰滅菌后，稱(chēng)取25g（或吸取25ml）檢樣，放入裝有225ml滅菌生理鹽水的三角瓶?jī)?nèi)，振搖混勻，得10-1的樣品稀釋液。再按照?qǐng)D3-1所示進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)謩e制得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液。③傾注平板根據(jù)原料奶的污染情況，分別吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀釋梯度的樣品稀釋液各1mL，加到已滅菌的平皿中，再將融化后已經(jīng)冷卻至45℃左右但尚未冷凝的固體培養(yǎng)基傾注入平皿，然后迅