地中海貧血基因檢測(cè)-PCR擴(kuò)增DNA

地中海貧血基因檢測(cè)PCR擴(kuò)增DNA1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握PCR的原理2、熟悉PCR操作過(guò)程3、了解PCR的臨床應(yīng)用2實(shí)驗(yàn)原理PCR（PolymeraseChainReaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR過(guò)程類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，包括DNA雙鏈解開(kāi)，引物配對(duì)，合成三步；在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。3PCR1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍45α-地貧實(shí)驗(yàn)原理（四重Gap-PCR）根據(jù)α-地貧3種缺失范圍及斷裂點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)特異引物同時(shí)檢測(cè)，在3種缺失片段的共同區(qū)域還設(shè)計(jì)一對(duì)正常內(nèi)對(duì)照引物，當(dāng)發(fā)生任一種缺失純合子或雙重雜合子該正常對(duì)照不擴(kuò)增;根據(jù)陽(yáng)性擴(kuò)增片段組合結(jié)果診斷各種不同基因型。

6α-地貧基因缺失示意圖

a3.7

a4.2--SEAψα2ψα1α2α11ζψζ正常內(nèi)對(duì)照7β-地貧PCR實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)特異的PCR引物且其5‘端用生物素進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增獲得一定長(zhǎng)度的DNA片段，該片段包含了所要檢測(cè)的各個(gè)位點(diǎn)。

8What’sinthePCRTubeTargetDNA5’3’3’5’primersABFreenucleotidesTaqDNApolymeraseMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Buffercontainingmagnesium9PCR原理:實(shí)質(zhì)就是體外基因復(fù)制技術(shù)Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列.加熱變性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C10PCR擴(kuò)增（α-地中海貧血）PCR-Mix-I（藍(lán)色管）21μLDNA模板 4μLTotal25μL96℃5min98℃45sec65℃90sec72℃3min98℃30sec65℃45sec72℃3min72℃10min（25cycles）（10cycles）操作步驟11PCR擴(kuò)增（β-地中海貧血）用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增待測(cè)樣品DNA

PCR-Mix-I（紫色管）23μL DNA模板 2μL Total25μL50℃ 15min95℃ 10min 94℃1min50℃ 30s35cycles72℃ 30s72℃ 5min12試劑試劑盒組成：（1）PCR反應(yīng)液（已包含PCR擴(kuò)增所需的緩沖液、引物、dNTPs、DNA聚合酶等）（2）純水13儀器設(shè)備離心機(jī)加樣槍PCR擴(kuò)增儀（使用介紹）1、PCR擴(kuò)增循環(huán)條件的設(shè)置(PCR儀請(qǐng)使用熱蓋)：若用沒(méi)有熱蓋的PCR擴(kuò)增儀，則需在反應(yīng)體系中加入液體石蠟等礦物油封閉體系以防止反應(yīng)過(guò)程中液體的蒸發(fā)。2、擴(kuò)增結(jié)束后，不立刻電泳請(qǐng)取出放冰箱保存14操作步驟1取出凍存的DNA解凍2試劑準(zhǔn)備取所需的反應(yīng)管PCRMix-A,若管蓋上有液體附著的請(qǐng)低速離心數(shù)秒3、加樣在反應(yīng)管上做好標(biāo)記，分別加2-4ul已提取的待測(cè)樣品、陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控，終反應(yīng)體積為25ul，低速離心數(shù)秒。轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)15質(zhì)量控制1陰性質(zhì)控（滅菌雙蒸水

）2陽(yáng)性質(zhì)控（缺失型/突變型）隨病人標(biāo)本檢測(cè),不同缺失/突變類型可以依次輪流循環(huán)作為質(zhì)控檢測(cè)

16PCR常見(jiàn)問(wèn)題之一

假陽(yáng)性

現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物M+-1217PCR常見(jiàn)問(wèn)題之二無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物

現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無(wú)；M樣品樣品正對(duì)照18注意事項(xiàng)1、在運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)有PCR反應(yīng)液附著在管壁/蓋上，因此請(qǐng)?jiān)谑褂们跋入x心，以保證PCR反應(yīng)體系的體積及防止?jié)撛诘奈廴尽?、PCR反應(yīng)的加樣量多數(shù)是微量的，所以加樣時(shí)應(yīng)把槍頭伸進(jìn)液面下加樣，并注意確保試劑確實(shí)加進(jìn)去了！3、加樣過(guò)程中注意防止污染樣品及試劑。4、置PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)前