抗生素類藥物的鑒別與測定

第十六章抗生素類藥物的分析第一節(jié)概述一、抗生素藥物的特點（一）抗生素是指“在低微濃度下即可對某些生物的生命活動有特異抑制作用的化學物質(zhì)的總稱”。多數(shù)由微生物發(fā)酵、經(jīng)化學純化、精制和化學修飾，制成適當制劑

與合成藥物相比：結(jié)構(gòu)、組成復雜

1、化學純度低——三多（1）、同系物多——慶大霉素含四個主要組分（2）、異構(gòu)體多——半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素均存在光學異構(gòu)體（3）、降解物多——四環(huán)素類存在脫水、差向異構(gòu)體

2、活性組分易發(fā)生變異——微生物菌株、發(fā)酵條件的改變均導致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化(組分的組成或比例)3、穩(wěn)定性差——通常含活潑基團，基團往往是活性中心（青霉素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)）二、抗生素藥物的質(zhì)量分析

抗生素質(zhì)控與化藥一樣—鑒別、檢查、含量（效價）測定由于抗生素類的特點，其分析方法——生物學法和理化方法兩大類（一）、鑒別試驗鑒別試驗——理化為主要方法1、官能團的顯色反應

β-內(nèi)酰胺環(huán)——羥肟酸鐵反應鏈霉素——麥芽酚反應等抗生素鹽類——通常鑒別酸根或金屬離子或有機堿（二）、檢查

1、影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的指標——結(jié)晶性、酸堿度、水分或干燥失重

2、控制有機和無機雜質(zhì)的指標——溶液的澄清度與顏色、有關物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘渣、重金屬等

3、與臨床安全性密切相關的指標—異常毒性、熱源或細菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等

4、其它指標（1）、多組分——組分分析（硫酸慶大霉素C組分的測定）（2）、懸浮時間與抽針試驗（3）、聚合物（4）、雜質(zhì)吸收度（三）、含量測定或效價測定

1、微生物學法——抗生素對微生物的殺傷或抑制程度來衡量抗生素效價（potency）方法的設計——量反應平行線原理,在實驗所用的劑量范圍內(nèi),對數(shù)劑量和反應呈直線關系，供試品和標準品的直線應平行。

測定方法——管碟法和濁度法管碟法——抗生素在攤布特定試驗菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū),抑制了試驗菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈通過比較標準品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小來測定供試品的效價濁度法——抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑止作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品和供試品對試驗菌生長抑止的程度。優(yōu)點——靈敏度高、需用量小，測定結(jié)果較直觀；測定原理與臨床應用的要求一致，更能確定抗生素的醫(yī)療價值；適用范圍廣——較純的精制品、純度較差的制品、已知的或新發(fā)現(xiàn)的抗生素均能應用；

同一類型的抗生素——不需分離，一次測定其總效價（效價測定的最基本的方法）目前理化方法逐漸取代了生物學法分子結(jié)構(gòu)復雜、多組分的抗生素—生物學法是首選的效價測定方法

2、理化方法——根據(jù)分子結(jié)構(gòu)特點，利用其特有的化學或物理化學性質(zhì)及反應而進行對于提純的產(chǎn)品以及化學結(jié)構(gòu)已確定的抗生素——較迅速、準確地測定其效價，并具有較高的專屬性

化學方法——運用結(jié)構(gòu)上官能團的特殊化學反應（含有具同樣官能團就不適用，或需采取適當方法加以校正如果利用某一類型抗生素的共同結(jié)構(gòu)部分的反應——測得的結(jié)果代表總的含量，并不一定能代表抗生素的生物效價。

理化方法測定必須與生物效價吻合目前各國藥典所收載的理化方法—HPLC法，如-內(nèi)酰胺類、四環(huán)類、大環(huán)內(nèi)酯類大多采用HPLC法測含量

3、活性——效價單位表示指每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少.用單位(u)或微克（g）表示。一種抗生素有一個效價基準，同一種抗生素的各種鹽類的效價可根據(jù)其分子量與標準鹽類進行換算。

如1毫克青霉素G鈉鹽定為1667單位；

1mg青霉素G鉀鹽的單位（u）=1667×356.4/372.5=1595u/mg。理論效價（實際樣品往往低于理論效價）

三、抗生素的分類（p.406）（一）、根據(jù)作用對象分類——對病原體的最大敏感度為主抗革蘭氏陽性菌抗革蘭氏陰性菌廣譜抗生素抗真菌抗生素抗腫瘤抗生素抗病毒及抗原蟲殺昆蟲的抗生素抗結(jié)核分枝桿菌的抗生素。三、抗生素的分類（二）、根據(jù)化學結(jié)構(gòu)分類——局限于化學結(jié)構(gòu)明確的抗生素β-內(nèi)酰胺類、氨基苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、多烯大環(huán)類、多肽類、苯烴胺類、蒽環(huán)類其他抗生素（不屬于上述類型）第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素一、化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）化學結(jié)構(gòu)青霉素和頭孢菌素的母核1、游離羧基和酰胺側(cè)鏈2、氫化噻唑環(huán)或氫化噻嗪環(huán)與β-內(nèi)酰胺并合的雜環(huán)

青霉素族的母核——6-氨基青霉烷酸（簡稱6-APA）

頭孢菌素族的母核——7-氨基頭孢菌烷酸（簡稱7-ACA）。青霉素族——側(cè)鏈RCO-與母核6-APA結(jié)合；三個手性C原子C2、C5、C6頭孢菌素族——側(cè)鏈RCO-與母核7-ACA組成；含兩個手性C原子C6、C7

酰胺基上R以及R1的不同，構(gòu)成各種不同的青霉素和頭孢菌素表16－1P.411（二）、性質(zhì)（1）酸性與溶解度——游離羧基，具強酸性，大多數(shù)pKa2.5～2.8之間,能與無機堿或某些有機堿成鹽堿金屬鹽易溶于水、有機堿鹽難溶于水，易溶于甲醇等有機溶劑堿金屬鹽水溶液遇酸——析出游離基的白色沉淀（2）旋光性——青霉素族含三個手性碳原子，頭孢菌素族含兩個手性碳原子（定性和定量）

（3）紫外吸收特性頭孢菌素族母核——具有O＝C－N－C＝C結(jié)構(gòu)R取代基——苯環(huán)等共軛系統(tǒng)青霉素族母核——無共軛系統(tǒng)側(cè)鏈酰胺基上R取代基——苯環(huán)等共軛系統(tǒng)（4）β－內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性β-內(nèi)酰胺環(huán)——活性中心，性質(zhì)活潑，最不穩(wěn)定部分穩(wěn)定性——含水量和純度有關干燥——較穩(wěn)定，室溫條件下密封保存，貯存3年以上水溶液——很不穩(wěn)定，隨pH和溫度而有很大變化

青霉素水溶液——pH6～6.8較穩(wěn)定酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子（銅、鉛、汞和銀）或氧化劑等——水解和分子重排，β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失活性青霉素降解反應頭孢噻吩降解反應二、鑒別試驗（一）呈色反應1、羥肟酸鐵反應——堿性中與羥胺作用，β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。

羥肟酸鐵反應式2、類似肽鍵的反應(茚三酮反應)具有-CONH-結(jié)構(gòu)(取代基有α－氨基酸)——顯雙縮脲和茚三酮反應頭孢氨芐,頭孢羥氨芐，頭孢拉定，頭孢克洛側(cè)鏈均為氨芐基，中國藥典采用TLC鑒別、檢查時,以茚三酮為顯色劑

3、其它呈色反應（1）、側(cè)鏈含有-C6H5-OH——與重氮苯磺酸試液產(chǎn)生偶合（2）、可與變色酸-硫酸、硫酸-硝酸、銅鹽等試劑反應（二）各種鹽的反應許多制成鉀鹽或鈉鹽供臨床使用—鉀、鈉離子的火焰反應（三）、光譜法1、紅外吸收光譜（IR）IR——反映分子的結(jié)構(gòu)特征，各國藥典收載的β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進行鑒別

2、紫外分光光度法（UV）（1）λmax——供試品配成適當濃度的溶液，直接測定UV光譜，根據(jù)λmax或λmin處的吸收度鑒定（2）水解產(chǎn)物的最大吸收波長—供試品在一定條件下水解，測定水解產(chǎn)物的λmax（四）、色譜法

HPLC和TLC——各國藥典廣泛用于鑒別試驗HPLC——供試品與對照品主峰的保留時間（tR）（在含量測定項下的色譜圖中）TLC——供試品與對照品斑點的保留值（Rf）是否一致三、特殊雜質(zhì)的檢查

主要有高分子聚合物，有關物質(zhì)，異構(gòu)體等HPLC法——主成分自身對照法或?qū)φ掌穼φ辗║V法——測定雜質(zhì)的吸收度有效性試驗—結(jié)晶性、吸碘物質(zhì)、抽針與懸浮時間（一）、聚合物

主要——反相高效液相色譜，凝膠色譜和離子交換色譜凝膠色譜的分離原理——利用分子篩作用，藥物分子自由地進入凝膠顆粒內(nèi)部，高分子雜質(zhì)被排阻，不能進入顆粒內(nèi)部

高分子雜質(zhì)定量測定法1、主成分自身對照法——用于高分子雜質(zhì)含量較低的品種。2、面積歸一法3、限量法——用于混合物中高分子物質(zhì)的控制。通常規(guī)定不得檢出保留時間小于對照品保留時間的組分。4、自身對照外標法——按外標法計算（二）、有關物質(zhì)和異構(gòu)體

通常采用色譜法——自身對照法或?qū)φ掌穼φ辗?/p>

（三）、吸收度（兩個波長處測A）Amax——控制主藥含量

Aλ——控制雜質(zhì)的量四、含量測定

各國藥典大多采用理化測定方法主要討論中國藥典收載的方法，如高效液相色譜法、碘量法、電位絡合滴定法、可見-紫外分光光度法等

（一）、HPLC法較好地分離可能存在的降解產(chǎn)物、未除盡的原料及中間體等雜質(zhì)而準確定量——適用于原料、各種制劑及生物樣本的分析測定

第三節(jié)氨基糖苷類抗生素

氨基苷類抗生素——堿性環(huán)已多元醇為苷元，與氨基縮合而成的苷主要——鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龍霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等

一、化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）、化學結(jié)構(gòu)鏈霉素——一分子鏈霉胍和一分子鏈霉雙糖胺結(jié)合而成的堿性苷鏈霉雙糖胺——鏈霉糖與N-甲基L-葡萄糖胺所組成鏈霉胍與鏈霉雙糖胺間的苷鍵結(jié)合較弱，鏈霉糖與N-甲基-L-葡萄糖胺間的苷鍵結(jié)合較牢

鏈霉素

慶大霉素——是由絳紅糖胺、脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮合而成的苷它是慶大霉素C復合物,主要組分為C1、C2、C1a及C2a,尚有少量次要成分(如慶大霉素A1、A2、A3、A4、B、B1、X……)

慶大霉素主要組分C1、C2、C1a及C2a的結(jié)構(gòu)

慶大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7

C2CH3HHC20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7（二）、性質(zhì)（1）、溶解度與堿性含有多個羥基和堿性基團—堿性、水溶性抗生素，能與礦酸或有機酸成鹽，臨床上應用的主要為硫酸鹽硫酸鹽易溶于水，不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有機溶劑

（2）、旋光性含有多個氨基糖——具有旋光性（3）、苷的水解與穩(wěn)定性含有二糖胺結(jié)構(gòu)氨基葡萄糖與鏈霉糖或D-核糖之間的苷鍵較強鏈霉胍與鏈霉雙糖胺（苷元與二糖胺）間的苷鍵結(jié)合較弱

酸性條件下鏈霉素水解：鏈霉胍和鏈霉雙糖胺進一步水解：N-甲基-L-葡萄糖胺堿性條件下鏈霉素水解：鏈霉胍及鏈霉雙糖胺并使鏈霉糖部分發(fā)生分子重排，生成麥芽酚（maltol）,（鏈霉素特有,用于鑒別和定量）（4）、紫外吸收鏈霉素在230nm處有紫外吸收慶大霉素、奈替米星等無UV吸收

二、鑒別試驗

（一）、茚三酮反應

氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具有羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，與茚三酮縮合成藍紫色化合物

（二）、Molisch試驗具五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)的，經(jīng)酸性水解，在鹽酸（或硫酸）作用下脫水生成糠醛（五碳糖）或羥甲基糠醛（六碳糖）——這些產(chǎn)物遇-萘酚或蒽酮顯色

1、-萘酚顯色原理——自學

2、蒽酮的顯色原理——自學

（三）、N-甲基葡萄糖胺反應

水解產(chǎn)物葡萄糖胺衍生物，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物

（I），再與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液（Ehrlich試劑）反應,生成櫻桃紅色縮合物（II）

（四）、麥芽酚（Maltol）反應—鏈霉素的特征反應堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚，麥芽酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物

反應原理

（五）、坂口（Sakaguchi）反應—水解產(chǎn)物鏈霉胍的特有反應堿水解產(chǎn)物鏈霉胍和8-羥基喹啉（或α-萘酚）分別同次溴酸鈉反應,其各自產(chǎn)物再相互作用生成橙紅色化合物

反應原理（六）、硫酸鹽反應本類多為硫酸鹽，各國藥典都將硫酸根的鑒定作為鑒別這類抗生素

（七）、色譜法

1、薄層色譜法薄層板——硅膠展開劑——氯仿-甲醇-濃氨水顯色劑——茚三酮或碘蒸氣

2、高效液相色譜法BP——用HPLC法鑒別慶大霉素

比較供試液和標準品溶液的色譜圖,慶大霉素C1、C2、C1a及C2a四組分的保留時間應一致

（八）、光譜法1、紅外光譜法2、紫外分光光度法慶大霉素分子中無共軛雙鍵系統(tǒng)，故在紫外區(qū)無吸收（BP）三、特殊雜質(zhì)檢查及組分分析（一）、鏈霉素中鏈霉素B的檢查鏈霉素B（活性低）——發(fā)酵中由菌種產(chǎn)生的，能被甘露糖鏈霉素B苷酶水解成甘露糖和鏈霉素提取、精制不徹底，可能殘存活性較低的鏈霉素B（二）、慶大霉素C組分測定發(fā)酵工藝基本一致，提煉工藝各有特點。由于發(fā)酵菌種不同或工藝略有差別，各廠產(chǎn)品C組分含量比例不完全一致慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，各組分的多少影響產(chǎn)品的效價和臨床療效藥典——以標準曲線法（標準品對照）C1—25~50％C1a－15~40％C2＋C2a－20~50％（四）、硫酸鹽測定——自學臨床應用主要為硫酸鹽，各國藥典規(guī)定EDTA絡合滴定法測定硫酸鹽含量

四、含量測定

效價測定——各國藥典主要采用微生物檢定法。但其理化分析方法近年來國內(nèi)外發(fā)表的論文很多

微生物法、色譜法是本類抗生素的定量分析的主要方法

第四節(jié)四環(huán)素類抗生素

一、化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）、化學結(jié)構(gòu)四駢苯或萘駢萘的衍生物基本結(jié)構(gòu)（二）、性質(zhì)1、酸堿性與溶解度

C4－二甲氨基——弱堿性；

C10－ph-OH和兩個含有酮基和烯醇基的共軛雙鍵系統(tǒng)——弱酸性四環(huán)素類——兩性化合物；遇酸及堿生成相應的鹽，臨床多鹽酸鹽

結(jié)晶性物質(zhì)——具引濕性鹽酸鹽——易溶于水，并溶于堿或酸性溶液中，而不溶于氯仿、乙醚等有機溶劑四環(huán)類抗生素的游離堿——在水中的溶解度很小，溶解度與溶液的pH值有關

2、旋光性具不對稱碳原子,用于定性、定量

3、紫外吸收和熒光性質(zhì)含共軛雙鍵，在紫外光區(qū)有吸收4、穩(wěn)定性對各種氧化劑、酸、堿都不穩(wěn)定的干燥的四環(huán)類游離堿及其鹽類避光條件下保存均較穩(wěn)定，水溶液隨pH的不同會發(fā)生差向異構(gòu)化、降解等反應，尤其是堿性水溶液特別容易氧化，顏色很快變深，形成色素

（1）、差向異構(gòu)化性質(zhì)（一）

弱酸性（pH2.0~6.0）溶液中會發(fā)生差向異構(gòu)化A環(huán)上手性碳原子C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素類（ETC），其抗菌性能極弱或完全消失

（1）、差向異構(gòu)化性質(zhì)四環(huán)類的差向異構(gòu)化反應

（2）降解性質(zhì)A、酸性降解在酸性條件下（pH﹤2），特別是在加熱情況下，四環(huán)類抗生素C6上的醇羥基和C5a上的氫發(fā)生反式