細(xì)胞凋亡與細(xì)胞衰老

關(guān)于細(xì)胞凋亡與細(xì)胞衰老第1頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡單細(xì)胞生物而言，細(xì)胞死亡既是個(gè)體死亡。多細(xì)胞生物細(xì)胞死亡并非意味著個(gè)體死亡。相反在多細(xì)胞生物發(fā)育中，必須通過細(xì)胞死亡進(jìn)行形態(tài)建成。正常的組織中也發(fā)生細(xì)胞死亡，它是維持組織機(jī)能和形態(tài)所必需的。第2頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五溫和式：細(xì)胞凋亡（apoptosis）、細(xì)胞自噬（autophagy）。激烈式：細(xì)胞壞死（necrosis）（一）細(xì)胞壞死概念——細(xì)胞受到環(huán)境因素的嚴(yán)重傷害，如極端的物理化學(xué)因素和眼中的病理性刺激引起細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。壞死原因——蛋白變性，DNA嚴(yán)重?fù)p傷，ATP缺乏，溶酶體破裂等。細(xì)胞死亡的方式第3頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五細(xì)胞壞死初期，胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核發(fā)生固縮或斷裂。隨壞死進(jìn)程，細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜酸性，蘇木精/伊紅染色呈均一紅色。細(xì)胞膜不完整，臺(tái)盼藍(lán)染色陽性(活細(xì)胞不著色)。DNA隨機(jī)降解，細(xì)胞內(nèi)容物流出，引起炎癥。第4頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五通過形成自噬泡與胞內(nèi)溶酶體融合，消化細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)，自噬一般是細(xì)胞維持存活的手段，但過多自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞自噬是正常的生理過程。也發(fā)生在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)匱乏及個(gè)體發(fā)育過程中，如昆蟲變態(tài)。細(xì)胞自噬可能與細(xì)胞凋亡一樣在動(dòng)物發(fā)育過程中形態(tài)建成中扮演重要角色。是由細(xì)胞自身基因控制的程序性死亡。（二）細(xì)胞自噬第5頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五（三）細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物正常的過程，是一種由基因控制的主動(dòng)的細(xì)胞生理性自殺行為。第6頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡（programmedcelldeath,PCD）程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)——指在生長(zhǎng)發(fā)育過程中細(xì)胞在基因調(diào)控下，按照一定時(shí)空順序發(fā)生的生理性死亡。細(xì)胞凋亡是形態(tài)學(xué)的概念，程序性細(xì)胞死亡是功能上的概念。第7頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五一、動(dòng)物細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡（一）細(xì)胞凋亡（apoptosis）1動(dòng)物細(xì)胞凋亡形態(tài)特征1)凋亡的起始細(xì)胞膜：完整，表面特化結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞間接觸消失細(xì)胞質(zhì)：線粒體形態(tài)變化不大，核糖體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，溶酶體活性不增加。細(xì)胞核：染色質(zhì)靠邊、固縮，細(xì)胞核變型突出，染色質(zhì)斷裂。2）凋亡小體的形成整個(gè)細(xì)胞：通過出芽（發(fā)泡）的方式形成許多凋亡小體，凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器；3）凋亡小體被臨近細(xì)胞或體內(nèi)吞噬細(xì)胞吞噬消化第8頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五2凋亡的生化特征①無細(xì)胞質(zhì)外泄，不引起炎癥反應(yīng)；②核酸內(nèi)切酶活化，DNA有控降解，凝膠電泳圖呈梯狀；③tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達(dá)到較高的水平；④質(zhì)膜PS（磷酯酰絲氨酸，phosphatidylserine)外翻。

凋亡通常是生理性變化，壞死是病理性變化。第9頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五壞死凋亡第10頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五第11頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五第12頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五第13頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五1.形態(tài)學(xué)，電鏡，光鏡；2.DNA凝膠電泳——ladder；3.流式細(xì)胞計(jì)；4.核酸內(nèi)切酶活力檢測(cè)；5.彗星電泳法；6.AnnexinV檢測(cè)細(xì)胞膜外表面PS；7.TUNEL技術(shù)（末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法）。3細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法第14頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五常用檢測(cè)細(xì)胞凋亡的染料：二乙酸熒光素（FDA），綠色熒光，活細(xì)胞染色。Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的細(xì)胞熒光較強(qiáng)。溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放線菌素D（7‐AAD），不通透，正常和凋亡細(xì)胞拒染。各種堿性染料。固定后染細(xì)胞核。可用不同性質(zhì)的染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色。第15頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五A：人類白血病T細(xì)胞經(jīng)1微升喜樹堿處理，早期凋亡特異性的特征被熒光標(biāo)記的Annexin－5(Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白)檢測(cè)到(產(chǎn)生凋亡小體的黃色綠色細(xì)胞)。晚期凋亡和壞死細(xì)胞被pi染色（橙紅色細(xì)胞核）。細(xì)胞凋亡的發(fā)生伴有細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸移位酶的激活，提示細(xì)胞膜膜脂雙層的某些成分由胞漿面向細(xì)胞質(zhì)面外翻，可能是細(xì)胞凋亡的早期征象。B：人白血病細(xì)胞株HL-60cells（急性粒細(xì)胞白血病，p53缺陷）被喜樹堿誘導(dǎo)3小時(shí)。DNA段端被熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記。

AB第16頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五（1）生理學(xué)意義

①確保正常發(fā)育、生長(zhǎng)：清除多余的、失去功能價(jià)值的細(xì)胞（指趾間組織細(xì)胞）；

②維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定：清除受損突變細(xì)胞，自身反應(yīng)細(xì)胞，衰老細(xì)胞；

③發(fā)揮積極的防御功能：感染病毒細(xì)胞凋亡，阻止病毒復(fù)制。4細(xì)胞凋亡的生理和病理學(xué)意義第17頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五發(fā)育中的小鼠趾間細(xì)胞凋亡第18頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五神經(jīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞聯(lián)系建立的過程中多余的神經(jīng)細(xì)胞凋亡第19頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五（2）病理學(xué)意義①病原體侵染；–誘導(dǎo)凋亡——HIV–抑制凋亡——天花病毒②細(xì)胞凋亡不足–腫瘤，自身免疫疾??；③細(xì)胞凋亡過度–神經(jīng)退行性疾?。ˋD，帕金森癥）、心肌梗塞、再生障礙性貧血、骨組織壞死。第20頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五（二）細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制1誘發(fā)凋亡的因素細(xì)胞之所以凋亡是因?yàn)榧?xì)胞受到溫和脅迫、衰老、其他細(xì)胞的刺激或者細(xì)胞接受不到外界生長(zhǎng)存活信號(hào)。誘導(dǎo)凋亡的因素分兩大類：

物理因素：射線、溫和的熱激、冷激、滲透脅迫。

化學(xué)因素：活性氧、鈣離子、視黃醛、細(xì)胞毒素、凋亡細(xì)胞因子等。細(xì)胞接受死亡信號(hào)后主要通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡——蛋白酶Caspase依賴型細(xì)胞凋亡：激活的Caspase切割靶蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；非Caspase依賴型細(xì)胞凋亡：可同時(shí)激活。第21頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五2Caspase依賴性細(xì)胞凋亡Caspase的發(fā)現(xiàn)和秀麗隱桿線蟲程序性細(xì)胞死亡研究有關(guān)。秀麗隱桿線蟲是研究PCD的理想材料（1mm長(zhǎng)，透明，3.5天即可有合子發(fā)育成熟，細(xì)胞總共產(chǎn)生1090個(gè)細(xì)胞，其中131個(gè)凋亡）?？刂凭€蟲PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9等。哺乳動(dòng)物中線蟲相關(guān)基因（蛋白）研究發(fā)現(xiàn)10多種Caspase。–Ced-3和Ced-4誘發(fā)凋亡；–Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。其中Caspase1與線蟲Ced-3同源。負(fù)責(zé)白介素活化，調(diào)節(jié)免疫，亦有促使細(xì)胞凋亡功能。第22頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五植物氣孔Caspase的性質(zhì)Caspase（天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶）——是存在于細(xì)胞質(zhì)中結(jié)構(gòu)類似的一類蛋白酶，具有有限切割靶蛋白的功能，切割位點(diǎn)在靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。Caspase激活——自身切割或其他Caspase切割，產(chǎn)生兩段肽段形成有蛋白酶活性的二聚體。Caspase家族——可分為起始Caspase、執(zhí)行Caspase和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)因子。結(jié)構(gòu)：起始Caspase多含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）或Caspase募集結(jié)構(gòu)域（CARD)。

起始Caspase——負(fù)責(zé)接受死亡信號(hào)，激活執(zhí)行Caspase。同性活化。

執(zhí)行Caspase——激活后切割靶蛋白，引起凋亡效應(yīng)。異性活化。第23頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五同性活化（homo‐activation)——即酶原分子聚集成復(fù)合物達(dá)到一定濃度時(shí)，就彼此切割或者構(gòu)象改變產(chǎn)生有活性的二聚體形式。起始Caspase中，Caspase‐8和10具有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，而Caspase‐2和9具有募集結(jié)構(gòu)域，通過結(jié)構(gòu)域之間的聚合，Caspase能夠彼此結(jié)合或與接頭蛋白（adaptor）結(jié)合，被招募到上游信號(hào)復(fù)合物中發(fā)生同性活化。異性活化（hetero‐activation）——即起始Caspase招募執(zhí)行Caspase酶原分子后，對(duì)其進(jìn)行切割，產(chǎn)生具有活性的執(zhí)行Caspase，切割細(xì)胞內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第24頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五Caspase家族第25頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五Caspase活化Caspase在正常的狀態(tài)下，它們以無活性的原酶（proenzymes）形式存在。Caspase被同一Caspase特異性的在兩個(gè)亞基連接處的天冬氨酸位點(diǎn)剪切，同時(shí)釋放N-端結(jié)構(gòu)域后被激活。激活的上游的Caspase能依次地激活其它下游的Caspase，形成Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將凋亡信號(hào)一級(jí)級(jí)傳至凋亡底物。第26頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五死亡受體起始的外源途徑——死亡信號(hào)來自細(xì)胞外促調(diào)亡細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）等與細(xì)胞表面死亡受體（TNF-R、Fas）的結(jié)合。線粒體起始的內(nèi)源途徑——細(xì)胞內(nèi)部或外部死亡信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體游離出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，觸發(fā)內(nèi)源凋亡途徑。3Caspas依賴性細(xì)胞凋亡的外源途徑和內(nèi)源途徑第27頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起始于死亡配體與受體的結(jié)合。死亡配體主要是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員。TNF是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，能夠使腫瘤組織出血壞死。死亡配體的生物學(xué)功能是通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的，TNFR1和Fas是死亡受體家族的典型代表。死亡受體起始的外源途徑Fas又稱作APO-1，屬TNF受體家族。?1993年人白細(xì)胞分型國(guó)際會(huì)議統(tǒng)一命名為CD95。?Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。?Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合激活Caspase。第28頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡外源途徑（細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路）①死亡信號(hào)（腫瘤壞死因子）與死亡受體結(jié)合（TNF的受體Fas）三聚化；②死亡受體結(jié)合胞內(nèi)的DD區(qū)（Deathdomain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合③FADDN端通過DED區(qū)（deatheffectordomain）與原Caspase-8蛋白結(jié)合，促進(jìn)Caspase-8聚集形成死亡信號(hào)誘導(dǎo)復(fù)合體。④Caspase-8自剪切活化，激活Caspase-3、Caspase-7；Caspase-3激活Caspase-6。⑤Caspase切割降解關(guān)鍵性蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和周期蛋白、核纖層蛋白等等）。Caspase還可降解Dnase的抑制蛋白，釋放Dnase，降解DNA。⑥細(xì)胞凋亡第29頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五①信號(hào)激發(fā)活化了Bax凋亡基因，凋亡基因與抗凋亡基因BCL-2結(jié)合抑制了抗凋亡基因的作用，引起線粒體電壓依賴性陰離子通道（VDAC）打開，細(xì)胞色素C被釋放到胞質(zhì)中；②釋放的細(xì)胞色素C與Apaf-1（凋亡蛋白酶激活因子,是線蟲Ced-4基因哺乳細(xì)胞中的同源物）結(jié)合激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3、6等，引起細(xì)胞凋亡。線粒體起始的內(nèi)源途徑：（線粒體為核心的細(xì)胞凋亡通路）第30頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五第31頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五含有1-4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（Bcl-2homology）（BH1-4）。分兩類：抗凋亡蛋白（anti-apoptoticprotein)和促凋亡蛋白（pro-apoptoticprotein)。?促凋亡蛋白能引起線粒體外膜通透性改變，導(dǎo)致cytc釋放，引起凋亡。?Bcl-2相當(dāng)于線蟲的ced9。主要定位于線粒體膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Bcl-2基因家族（B-celllymphomagene2family)第32頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1，Apaf-1）：線蟲的同源物為ced-4。?作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育。?Apaf-1與cytc、ATP/dATP結(jié)合后，召集caspase-9，形成凋亡復(fù)合體（apoptosome），激活caspase-3，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。第33頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五途徑：（1）細(xì)胞接受調(diào)亡信號(hào)后，Bax,Bak形成二聚體從細(xì)胞質(zhì)移到線粒體外膜，打開一種陰離子通道，細(xì)胞色素C從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。（2）細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合，使Apaf-1聚合并通過其N端CARD結(jié)構(gòu)域募集Caspase9形成凋亡復(fù)合體，Caspase9同性活化。（3）活化的Caspase9進(jìn)一步活化執(zhí)行Caspase引起細(xì)胞凋亡。第34頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五4Caspase非依賴型細(xì)胞凋亡細(xì)胞剔除Caspase基因仍能凋亡，推測(cè)細(xì)胞內(nèi)存在不依賴于Caspase的凋亡途徑，但機(jī)制尚不清楚。線粒體在Caspase非依賴型細(xì)胞凋亡中可能也發(fā)揮關(guān)鍵性作用，除CytC，線粒體能夠向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放多個(gè)凋亡相關(guān)因子，引發(fā)Caspase非依賴的細(xì)胞凋亡。凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）：位于線粒體外膜。凋亡時(shí)移到核中，激活某種核酸內(nèi)切酶引起染色質(zhì)凝集斷裂。限制性核酸內(nèi)切酶G（EndoG）：位于線粒體內(nèi)，修復(fù)線粒體DNA。凋亡時(shí)進(jìn)入核中剪切DNA產(chǎn)生200bp單位片段。第35頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducingfactor，AIF）是一類存在于線粒體內(nèi)外膜間隙的保守的黃素蛋白，具有雙重功能。在細(xì)胞正常的生理狀態(tài)下，AIF作為線粒體氧化還原酶，能催化細(xì)胞色素c（Cyt-c）和NAD之間的電子傳遞，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡的刺激時(shí)，線粒體膜通透性改變，AIF從線粒體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，引起細(xì)胞染色體的凝聚和DNA50kb的片段化。核酸內(nèi)切酶G(endoG)是一種線粒體特異的核酸酶，負(fù)責(zé)線粒體DNA的修復(fù)與復(fù)制，在細(xì)胞凋亡時(shí)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。核酸內(nèi)切酶G能不依賴于將DNA切割成核小體片段。第36頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五5細(xì)胞凋亡調(diào)控凋亡相關(guān)的基因和蛋白——Caspase抑制因子：抑制凋亡。IAP家族（inhibitorofapoptosis,凋亡抑制子）：有BIR結(jié)構(gòu)域，可直接與Caspase結(jié)合，抑制其活性。有7個(gè)成員，如：c-IAP1等。c-FLIP(FADD樣Caspase抑制蛋白）、BAR、ARC（含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡抑制子）：可與接頭蛋白等相互作用阻斷死亡信號(hào)傳遞到Caspase。病毒編碼c-FLIP同源蛋白v-FLIP：結(jié)構(gòu)作用類似c-FLIP。含有的DED結(jié)構(gòu)域與FADD結(jié)合，阻止Caspase與FADD結(jié)合。Caspase抑制因子的抑制因子：促進(jìn)調(diào)亡。IAP抑制蛋白：結(jié)合IAP，釋放Caspase。如線粒體釋放的Smac、Omi。第37頁，共42頁，2022年，5月20日，18點(diǎn)58分，星期五細(xì)胞存活因子：包括多種有絲分裂原和生長(zhǎng)因子他們與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)途徑，抑制凋亡的發(fā)生。與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對(duì)細(xì)胞凋亡的凋控，研究較多的有NF-κB、p53、ATM等：NF-κB（nuclearfactorκB）：凋亡抑制因子。多種生長(zhǎng)因子通過磷脂酶C-PKC途徑磷酸化抑制因子IκB（inhibitorκB)從而激活NF-κB，NF-κB進(jìn)入核中激活