實(shí)驗(yàn)五富營(yíng)養(yǎng)化湖中葉綠素含量的測(cè)定

NPtCHO（葉綠索。寸CHa（葉綠葉綠醉實(shí)驗(yàn)五富營(yíng)養(yǎng)化湖中葉綠素含量的測(cè)定NPtCHO（葉綠索。寸CHa（葉綠葉綠醉姓名：葉素芬學(xué)號(hào)：22320102201142同組人：徐凱芳班級(jí)：10環(huán)科實(shí)驗(yàn)日期：2012.11.29實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆杖~綠素的測(cè)定原理及方法評(píng)價(jià)水體的富營(yíng)養(yǎng)化狀況實(shí)驗(yàn)方法原理關(guān)于水體富營(yíng)養(yǎng)化富營(yíng)養(yǎng)化：富營(yíng)養(yǎng)化是指生物所需的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量進(jìn)入湖泊、河口、海灣等緩流水體，引起藻類及其它浮游生物迅速繁殖，水體溶氧量下降，魚類及其它生物大量死亡的現(xiàn)象。大量水華死亡的水生生物沉積到湖底，被微生物分解，消耗大量的溶解氧，使水體溶解氧含量急劇降低，水質(zhì)惡化，以致影響到魚類的生存，大大加速了水體的富營(yíng)養(yǎng)化過程。水體出現(xiàn)富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象時(shí)，由于浮游生物大量繁殖，往往使水體呈現(xiàn)藍(lán)色、紅色、棕色、乳白色等，這種現(xiàn)象在江河湖泊中叫水華（水花），在海中叫赤潮。關(guān)于葉綠素含量的測(cè)定許多參數(shù)可用作水體富營(yíng)養(yǎng)化的指標(biāo)，常用的是總磷、葉綠素-a含量和初級(jí)生產(chǎn)率的大小。測(cè)定水體中葉綠素的含量，可將色素用丙酮萃取，根據(jù)葉綠素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A=aCL,式中：a為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b、c的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)（663、645、630nm）下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b、c在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。附表：表1：湖汩富營(yíng)養(yǎng)化的葉綠素a評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)類型貧營(yíng)養(yǎng)型中營(yíng)養(yǎng)型富營(yíng)養(yǎng)型葉綠素2濃度（口g/L）<44-1010-150實(shí)驗(yàn)試劑和儀器試劑：MgCO3懸液（已配制），90%的丙酮溶液（已配制）MgCO3粉末水樣（采樣時(shí)間：2012年11月29日采樣地點(diǎn)：廈門大學(xué)校本部芙蓉湖）儀器：V-1100D可見分光光度計(jì)（廠家：MAPADA），比色杯（2cm,2個(gè)），馬頭牌架盤藥物天平BP-II型（上海醫(yī)用激光儀器廠）TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘異儀器開發(fā)有限公司），TMTD-8222三用恒溫水箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，MIKRO22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（廠家：HETTICH塑料離心管（6支），刻度離心管（1支），量筒（100mL,1支，10mL,1支），具塞試管（25mL,1支），移液管（1mL,1支），藥匙（1把），黑色塑料薄膜，橡皮筋，燒杯（500mL,1個(gè)），膠頭滴管（數(shù)根）、洗瓶（1個(gè)）實(shí)驗(yàn)步驟清洗玻璃儀器（已由老師完成）2、離心水樣：用量筒取水樣210mL倒入燒杯中，用1mL移液管移取1.00mLMgCO懸液，將水樣分別裝入6支大的塑料離心管中，每支離心管加入35mL。衡重后在4000r/min的離心機(jī)內(nèi)離心10分鐘。3、提?。喝サ羯锨逡簳r(shí)注意要用膠頭滴管小心地取出上清液，最下層的液體中仍含有較多的葉綠素,要保留。將沉淀物及殘留的上清液轉(zhuǎn)移全具塞試管，加少量碳酸鎂粉末和10mL已水浴加熱至50C的90儷酮溶液（用90%勺丙酮溶液洗滌塑料離心管，盡量轉(zhuǎn)移完全）。塞緊塞子并在管子外部罩上遮光物（黑色塑料薄膜），充分振蕩，置于恒溫箱內(nèi)避光提取4小時(shí)。4、離心：提取完畢后，轉(zhuǎn)移至離心管（注意要轉(zhuǎn)移完全，減少葉綠素的損失），衡重，置于臺(tái)式離心機(jī)上4000r/min離心20min。取出離心管，用移液管將上清液移入刻度離心管中，塞緊塞子，4000r/min再離心10min。正確記錄提取液的體積V。5、測(cè)定光密度：采用分光光度法測(cè)定葉綠素a的含量。將提取液倒入2cm比色杯中，以90%勺丙酮溶液作為空白，分別在750、663、645、630nm波長(zhǎng)下測(cè)提取液的光密度值（OD。在每次改變波長(zhǎng)測(cè)定前都要進(jìn)行調(diào)零。在本次實(shí)驗(yàn)中，第一次測(cè)得的OD）為0.012,不符合標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了第三次離心，4000r/min，再次離心10min。注意：樣品提取液的OD。的值應(yīng)小于0.01，如不在此范圍內(nèi)，應(yīng)再次進(jìn)行離心，OD63值要求在0.2與1.0之間，，或調(diào)換比色杯，或改變過濾水樣量。OD63小于0.2時(shí)，應(yīng)該改用較寬的比色杯或增加水樣量；ODh大于1.0時(shí)，可稀釋提取液或減少水樣濾過量，使用1cm比色杯比色。6、葉綠素含量的計(jì)算：根據(jù)公式分別計(jì)算葉綠素a、b、c含量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄及計(jì)算表:2測(cè)定結(jié)果OQOOD63OD45OD3o葉綠素a濃度（3g/L）葉綠素b濃度（3g/L）葉綠素c濃度（3g/L）胡蓉湖水樣0.0090.2030.0600.04645.093.283.75丙酮提取液的體積：V1=8.80mL葉綠素濃度計(jì)算公式如下：1、樣品提取液中的葉綠素濃度為：Ca(3g/L)=11-64(OD-OD)-2-16(OD-OD)+0-1(OD-OD)'663750’'645750''6307507Cb(3g/L)=20.97(OD645-OD750)-3-94(OD663-OD75()-3-66(OD630-OD750)Cc(3g/L)=54.22(OD-OD)-14.8(OD-OD)-5.53(OD-OD)630750645750663750說明：將樣品提取液在663、645、630nm波長(zhǎng)下的光密度值(OD%’、OD#OD))分別減去750nm下的光密度值(OD)),此值為非選擇性本底物光吸收校正值。水樣中葉綠素濃度為：葉綠素a(3g/L)=(CaxV1)/(V2XL)葉綠素b(Pg/L)=(CbxV)/(V2XL)葉綠素c(Pg/L)=(CcxV)/(V2XL)式中，Ca-樣品提取液中葉綠素a濃度(Pg/L)V-90%丙酮提取液的體積(mL)V2—離心水樣的體積(L)L—比色杯寬度(cm),因此，樣品提取液中的葉綠素濃度為：TOC\o"1-5"\h\zCa(g/L)=11.64(OD-OD)-2.16(OD-OD)+0.1(OD-OD)=11.64x(0.203-0.009)-2.16X3'66375o''64575o''63075o'(0.060-0.009)+0.1X(0.046-0.009)=2.152Cb(1g/L)=20.97(OD-OD)-3.94(OD-OD)-3.66(OD-OD)=20.97X(0.060-0.009)-3.94645750663750630750X(0.203-0.009)-3.66X(0.046-0.009)=0.170Cc(1g/L)=54.22(OD-OD)-14.8(OD-OD)-5.53(OD-OD)=54.22X(0.046-0.009)-14.8'63075°64575°66375°X(0.060-0.009)-5.53X(0.203-0.009)=0.179水樣中葉綠素濃度為：葉綠素a(ig/L)=(CaXV1)/(V2XL)=(2.152X8.80)/(0.21X2)=45.09葉綠素b(ig/L)=(CbXV1)/(V2XL)=(0.170X8.80)/(0.21X2)=3.28葉綠素c(ig/L)=(CcXV1)/(V2XL)=(0.179X8.80)/(0.21X2)=3.75其中，L=2cm,V2=35mLX6=210mL=0.21L,M=8.80mL實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1思考題根據(jù)你的計(jì)算結(jié)果判斷湖水富營(yíng)養(yǎng)化程度答：實(shí)驗(yàn)測(cè)得的葉綠素a濃度為45.09ig/L,根據(jù)湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的葉綠素a評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，該值落在10-150中，因此初步判定該湖泊屬于富營(yíng)養(yǎng)型。即廈門大學(xué)校本部芙蓉湖的湖水是富營(yíng)養(yǎng)型湖水。由于45.09ig/L的值不是特別高，因此認(rèn)為湖水的富營(yíng)養(yǎng)化程度不是很嚴(yán)重。b）如何保證水樣中葉綠素a濃度測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性？主要應(yīng)該注意哪幾個(gè)方面的問題？答：從葉綠素a濃度測(cè)定的計(jì)算公式以及實(shí)驗(yàn)操作兩個(gè)方面上看，為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要注意幾個(gè)方面的問題：1、光密度值測(cè)定的準(zhǔn)確性2、準(zhǔn)確讀取丙酮提取液體積3、離心水樣體積要準(zhǔn)確4、玻璃儀器是否清洗干凈，實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性，是否引入雜質(zhì)或者其他物質(zhì)與葉綠素發(fā)生反應(yīng)，注重細(xì)節(jié)等具體來說，因?yàn)樵跇悠诽崛∫褐腥~綠素a濃度計(jì)算時(shí)關(guān)鍵點(diǎn)在于樣品在各波長(zhǎng)下所測(cè)定的光密度值是否準(zhǔn)確，因此，本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵的地方也因包括光密度值的測(cè)定，為了保證得到準(zhǔn)確的光密度值，需要注意幾個(gè)問題：1、實(shí)驗(yàn)儀器具有良好的靈敏度、精確度和準(zhǔn)確度。2、所用的兩個(gè)比色杯使用之前要進(jìn)行校準(zhǔn)。3.每次改變波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定前都要重新調(diào)零。另外，準(zhǔn)確的丙酮提取液體積也是實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的保證。因?yàn)殡x心后得到的提取液體積較少，但提取液溶有需測(cè)定的葉綠素，故應(yīng)準(zhǔn)確記錄體積，這就要求離心后要小心抓取離心管，不能有大的晃動(dòng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)要盡可能保證所有的提取液都吸取出來并準(zhǔn)確讀取體積。同時(shí)，離心水樣體積的準(zhǔn)確性也是需要保證的，因?yàn)橛须x心水樣體積才能計(jì)算出樣品中的葉綠素濃度。本實(shí)驗(yàn)中的水樣是用量筒取的，精確度相對(duì)較低。為盡可能減少誤差，在讀數(shù)時(shí)姿勢(shì)要標(biāo)準(zhǔn)，視線要與凹液面平行。由于在酸性條件下葉綠素a會(huì)分解，因此為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要特別注意整個(gè)實(shí)驗(yàn)中所使用玻璃儀器都是干凈的。實(shí)驗(yàn)操作過程中，要注意細(xì)節(jié)，如用黑色塑料薄膜包裹具塞試管時(shí)要注意包裹完全，不要透光。2、實(shí)驗(yàn)誤差來源a）儀器本身帶來的誤差，此誤差不可避免，但由于較小，一般可以忽略不計(jì)。b）由于操作方法不當(dāng)帶來的誤差，如玻璃儀器沒有清洗干凈，最終可能造成葉綠素a有所損失。使實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低。C）本實(shí)驗(yàn)中在第一次離心后倒去上清液的步驟中將上清液的下層全部倒掉，造成了較多的葉綠素a的損失，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果偏低。d）本實(shí)驗(yàn)中所使用的刻度離心管的刻度精度較差，讀取提取液的體積時(shí)會(huì)有較大的偏差，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了一定影響。e）本實(shí)驗(yàn)過程中存在多次的轉(zhuǎn)移，由于未能完全洗滌干凈也會(huì)造成葉綠素a的損失，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果偏低。3、其他方面的思考a）用丙酮溶液避光提取時(shí)，實(shí)驗(yàn)講義上的時(shí)間是4小時(shí)，此時(shí)間不是硬性要求，而是為了保證提取充分，因此適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間可能對(duì)提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有幫助。b）將提取完畢后的試液進(jìn)行離心兩