細(xì)胞融合與單克隆抗體

關(guān)于細(xì)胞融合與單克隆抗體第1頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五蔬菜水果雜交新品種第2頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五第3頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五第4頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五第5頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五第6頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五雜交水稻之父第7頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五動(dòng)物雜交——斑馬驢第8頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五獅虎獸第9頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五野牛和黃牛雜交第10頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合的方法病毒融合：副粘病毒最有效，副流感病毒、仙臺(tái)病毒等PEG融合：PEG導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定，降低細(xì)胞膜極性，促進(jìn)細(xì)胞膜融合。電融合法：細(xì)胞膜出現(xiàn)微孔，通透性升高，繼發(fā)細(xì)胞融合。神經(jīng)氨酸酶第11頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合是雜交瘤抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。第12頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五二、鼠源性單克隆抗體制備歷史：

KohlerandMilstein“ContinuousCultureofFusedCellsSecretingAntibodyofPredefinedSpecificity”,Nature,1975.骨髓瘤細(xì)胞+小鼠脾細(xì)胞（經(jīng)羊紅細(xì)胞免疫）NobelPrizein1984持續(xù)分泌抗羊紅細(xì)胞抗體的雜交瘤細(xì)胞第13頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五Ab的產(chǎn)生和單克隆抗體：多克隆抗體單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）：針對(duì)一種抗原決定簇的抗體。第14頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五Burnet選擇學(xué)說(shuō)：一個(gè)淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞）只接受一個(gè)抗原決定簇刺激，刺激后擴(kuò)增的淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生均一的同質(zhì)抗體，即單克隆抗體。體外要獲得某種抗原的單克隆抗體，需要有體外持續(xù)分泌抗體的單一B淋巴細(xì)胞克隆。第15頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五如何獲得體外持續(xù)分泌抗體的細(xì)胞

細(xì)胞融合和融合細(xì)胞的篩選是雜交瘤制備抗體的技術(shù)基礎(chǔ)。能分泌抗體，不能長(zhǎng)期在體外培養(yǎng)survive第16頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五雜交瘤細(xì)胞的篩選——HAT培養(yǎng)基細(xì)胞DNA合成有兩條途徑：

主要途徑：糖、氨基酸合成核苷酸，葉酸作為重要的輔酶參與。

另一輔助途徑是在H、T存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的作用合成DNA。第17頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五HAT培養(yǎng)基：

次黃嘌呤（hypoxanthine，H）

氨基蝶呤（aminopterin，A）:葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA。

胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）第18頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五融合后五種細(xì)胞的命運(yùn)：B，瘤細(xì)胞（HGPRT缺陷），B-B，瘤-瘤（HGPRT缺陷），瘤-BB，B-B細(xì)胞能分泌抗體，含有HGPRT，能在HAT培養(yǎng)基短期存活，但不能長(zhǎng)期體外存活。瘤細(xì)胞，瘤-瘤細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期存活，但不含有HGPRT，不能在HAT培養(yǎng)基存活，不能分泌抗體。只有瘤-B融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，在HAT培養(yǎng)基存活，且能在體外長(zhǎng)期存活，能分泌抗體。第19頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五雜交瘤技術(shù)制備McAb的原理克隆選擇學(xué)說(shuō)將抗原免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在體外進(jìn)行細(xì)胞融合用HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤細(xì)胞的原理以及各種細(xì)胞的命運(yùn)第20頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五McAb制備主要流程克隆化抗體特異性篩選擴(kuò)大培養(yǎng)制備大量McAb動(dòng)物免疫細(xì)胞融合第21頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五McAb制備主要步驟動(dòng)物免疫細(xì)胞融合和篩選抗體特異性篩選克隆化擴(kuò)大培養(yǎng)第22頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五動(dòng)物免疫：獲得產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗體的B細(xì)胞抗原：可溶性抗原（蛋白質(zhì)、核酸、多肽、多糖）、顆粒性抗原（細(xì)胞、細(xì)菌、真菌）。可溶性抗原+佐劑動(dòng)物：6周齡的雌性Balb/c小鼠第23頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五免疫途徑：腹腔注射、靜脈注射、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。腹腔內(nèi)注射尤其適合于顆粒性抗原；對(duì)于可溶性抗原來(lái)講，初次免疫一般選用弗氏佐劑和抗原的混合乳化物進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫在首次免疫后10～14天，一般是靜脈或腹腔內(nèi)注射，融合前還要進(jìn)行抗原沖擊。脾內(nèi)免疫法可獲得更滿意的免疫效果，此法免疫周期短、抗原用量少。免疫劑量：初次免疫10~20μg，可達(dá)50μg，一般不超過(guò)200μg。第24頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五舉例：動(dòng)物免疫：將純化的CysC蛋白（0.5mg/ml）從-86℃冰箱取出，冰上融解，抗原乳化采用三通管雙注射器互推法。第25頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五免疫方案：0天首次免疫，100μgCysC/只（0.2ml）+等體積弗氏完全佐劑，背部、大腿肌肉皮內(nèi)多點(diǎn)注射；14天，100μgCysC/只（0.2ml）+等體積弗氏不完全佐劑，大腿肌肉皮內(nèi)多點(diǎn)注射；21天，100μgCysC/只（0.2ml），于小鼠腹腔注射；第25天眼眶取血，分離血清，用ELISA試測(cè)定效價(jià)；28天，選擇效價(jià)達(dá)到要求（1：32000）的小鼠進(jìn)行尾靜脈注射50μgCysC/只（0.05ml），加強(qiáng)免疫。第26頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合——主要細(xì)胞系和培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞：SP2/0，NS-1，均自Balb/c小鼠。最好每隔3~6月將細(xì)胞置于含8-AG（8-雜氮鳥(niǎo)嘌呤）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一次，已去除HGPRT+的細(xì)胞。培養(yǎng)基：高糖DMEM，RPMI-1640第27頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五血清：

10%胎牛血清用于親代細(xì)胞培養(yǎng)，融合、篩選、克隆用20%胎牛血清；不同商家、不同批次血清對(duì)細(xì)胞支持作用明顯不同，應(yīng)篩選出能促進(jìn)克隆細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的優(yōu)質(zhì)血清，購(gòu)置足夠數(shù)量分裝保存。第28頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合——融合前的準(zhǔn)備（1）PEG的配制：PEG1000、1500、4000均可用于融合，濃度為40%～50%。50％聚乙二醇（PEG，MW4000）配制：

稱取2gPEG4000，放入青霉素小瓶?jī)?nèi)，蓋上橡皮塞，插上9號(hào)針頭排氣，沸水浴中30min，使PEG融化并除菌；待其冷卻至50～60℃時(shí)，加入37℃預(yù)溫的1640（1.7ml）和DMSO（0.3ml）混合液，充分混勻，封口膠封緊瓶塞，4°C保存，用前可置37°C加溫助溶。第29頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五

Norwood提出，含15%（V/V）DMSO的50%PEG4000，DMSO可增加膜的通透性，使細(xì)胞膜的滲透壓更易于與環(huán)境趨于平衡，從而提高融合頻率。第30頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（2）制備飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，能分泌生長(zhǎng)因子促使單個(gè)細(xì)胞容易生長(zhǎng)，還能清除死亡破碎細(xì)胞及微生物。于細(xì)胞融合前一天，取SPF級(jí)健康Balb/c小鼠，處死，用75%酒精浸泡10min，消毒小鼠體表。將其移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，以仰臥位固定在解剖板上，用無(wú)菌注射器吸取10ml1640液注射入腹腔，用酒精棉球輕揉腹部2～3min；用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹膜，吸出腹腔液，放入10ml離心管，1000rpm，離心10min，棄上清；第31頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五用5mlHAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×105/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般一只小鼠可獲得5×106～8×106個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞，用于3塊96孔板融合細(xì)胞培養(yǎng)。第32頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（3）骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：細(xì)胞融合前兩周復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，以終濃度為20μg/mL8-AZ完全培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周，篩選HGPRT缺陷型細(xì)胞。融合前48h將SP2/0細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，于融合前用新鮮培養(yǎng)液換液一次，融合當(dāng)天收集細(xì)胞懸液，離心棄上清，用1640液洗滌一次，重懸于培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。

第33頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（4）免疫鼠脾細(xì)胞懸液的制備：處死一只免疫好的Balb/C小鼠，小鼠用75%酒精浸泡10min；無(wú)菌操作取出脾臟，放入盛有10ml不完全培養(yǎng)基的玻璃皿中，洗滌，小心剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織和脂肪組織。然后換一新玻璃皿，加入1640液30ml，將脾臟置于200目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨，期間用不完全培養(yǎng)基沖洗數(shù)次，使脾細(xì)胞穿過(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入溶液中；第34頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五將脾細(xì)胞移至10ml玻璃離心管中，1000rpm，去上清，用不完全培養(yǎng)基10ml洗滌細(xì)胞3次，離心收集脾細(xì)胞；將脾細(xì)胞用10ml不完全培養(yǎng)基重懸混勻，計(jì)數(shù)，置室溫待用。第35頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五細(xì)胞融合融合前將50%PEG置于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫；吸取SP2/0細(xì)胞懸液和脾細(xì)胞懸液至一個(gè)50ml離心管中，使脾細(xì)胞∶骨髓瘤細(xì)胞=10∶1，充分混勻，1000rpm離心10min，棄上清；吸取0.7ml50%PEG，離管底約2cm處沿管壁加入PEG，1min左右加完，靜置90s；逐滴加入37℃預(yù)溫的不完全培養(yǎng)基1ml，再吸取不完全培養(yǎng)基10ml，緩慢加入，最后加入20ml不完全培養(yǎng)基；第36頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五800rpm，離心8min，棄去上清，加入HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打，混勻；將融合細(xì)胞接種至已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl；每塊培養(yǎng)板留3~5孔接種SP2/0細(xì)胞，作為HAT選擇的陰性對(duì)照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第37頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)制第38頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五提高融合率的技術(shù)措施飼養(yǎng)細(xì)胞的加入有助于促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。PEG濃度要準(zhǔn)確：PEG在50～60℃時(shí)仍為液體狀態(tài)，含DMSO的1640液要保溫50℃，兩種液體混合時(shí)一定要充分混勻；當(dāng)脾細(xì)胞和瘤融合時(shí)，末次離心后應(yīng)盡量吸出上清，可避免對(duì)PEG的稀釋作用；由于PEG能引起蛋白質(zhì)的沉淀，故脾細(xì)胞、瘤細(xì)胞需經(jīng)不含小牛血清的1640液的洗滌。第39頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五PEG作用瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合后，加入無(wú)血清1640液時(shí)要控制好速度，否則當(dāng)滲入的液體太快，細(xì)胞可能脹破；融合后離心速度不要太高，一般為800rpm，5min。細(xì)胞融合時(shí)，脾細(xì)胞∶骨髓瘤細(xì)胞的比例一般為5～10∶1，每孔接種的細(xì)胞大約為1×105～2×105，接種過(guò)多，容易在單孔內(nèi)形成多個(gè)克隆集落，不利于克隆化操作。第40頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五雜交瘤細(xì)胞的篩選：HAT培養(yǎng)基融合后每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并于第5天每孔半量換液HAT培養(yǎng)基100μl。第41頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五雜交瘤細(xì)胞融合情況觀察4d10d9d7d5d第42頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五抗體特異性篩選：融合后10天～14天，細(xì)胞克隆長(zhǎng)至孔底的1/3～1/2時(shí)，即可采用間接ELISA法檢測(cè)各細(xì)胞培養(yǎng)孔上清液，篩選分泌目的抗體的陽(yáng)性克隆。第43頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五挑出融合板陽(yáng)性孔細(xì)胞，加入8-10mlHT培養(yǎng)基，混勻鋪板4-6縱行，待亞克隆生長(zhǎng)5-7天，克隆長(zhǎng)大約1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上/孔，再用ELISA方法檢測(cè)。再次篩選出陽(yáng)性克隆后，立即采用有限稀釋法將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)。

第44頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五篩選分泌特異Ab的雜交瘤細(xì)胞新方法：electro-FACS-fusion單獨(dú)篩選分泌某種抗體（如IgM型）的雜交瘤細(xì)胞磁性顆粒篩選免疫滲濾法第45頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五克隆化：有限稀釋法：逐步稀釋使平均每孔只有一個(gè)細(xì)胞。收集陽(yáng)性克隆細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取用4.6ml培養(yǎng)液懸浮230個(gè)雜交瘤細(xì)胞（此時(shí)平均0.1ml溶液中含5個(gè)細(xì)胞），接種于預(yù)先已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，共接種3排，每孔0.1ml；余下1.0ml，再加入4ml培養(yǎng)液，共5ml（此時(shí)平均0.1ml溶液中含1個(gè)細(xì)胞），再接種3排；第46頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五最后剩余1.4ml，再補(bǔ)加培養(yǎng)液1.4ml（此時(shí)平均0.1ml溶液中含0.5個(gè)細(xì)胞），接種最后的24孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天左右，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行ELISA檢測(cè)。將分泌作用最強(qiáng)的陽(yáng)性克隆再次克隆化，直至細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)100%，轉(zhuǎn)移到24孔板、6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞凍存。第47頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五克隆化的注意事項(xiàng)：克隆化應(yīng)及早進(jìn)行，以免無(wú)關(guān)克隆生長(zhǎng)抑制陽(yáng)性克隆的抗體分泌。雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，抗體分泌特性易丟失，多次克隆得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。定期進(jìn)行凍存后復(fù)蘇和克隆，監(jiān)測(cè)細(xì)胞株的抗體分泌特性。第48頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五雜交瘤細(xì)胞及其單抗鑒定

染色體分析：

小鼠B細(xì)胞40條，SP2/068條，雜交瘤細(xì)胞為90-100條。第49頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五單克隆抗體亞類的鑒定

——IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA包被酶標(biāo)板：用包被液將抗原稀釋為10μg/ml，每孔加100μl抗原液，共加12孔，于4℃過(guò)夜，洗滌3遍，拍干。封閉：每孔加1%牛血清白蛋白液200μl，37℃孵育45min，洗滌3遍，拍干。每孔加入100μl新鮮的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫靜置2h，洗滌3次。用抗體稀釋液以1∶1000稀釋IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，每孔加入100μl稀釋的抗體，每種抗體作復(fù)孔，室溫靜置30min，洗滌3次。每孔加入100μl1∶1000稀釋的酶標(biāo)兔抗羊IgG抗體，室溫靜置15min，洗滌3次。每孔加入100μl底物顯色液，室溫避光反應(yīng)10～15min。每孔加入100μl終止液，觀察結(jié)果，確定Ig亞類。第50頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五Westernblotting鑒定單克隆抗體與相應(yīng)抗原的特異性反應(yīng)

取重組的CysC蛋白行12%SDS電泳。電泳結(jié)束后，取下凝膠，置于轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡20～60min，22V恒壓電轉(zhuǎn)移1h。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜在麗春紅S中染色5min，再用蒸餾水脫去紅色。將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫封閉過(guò)夜。棄去封閉液，用1×TBST漂洗膜3次，每次10～15min。加入以1∶10稀釋的雜交瘤培養(yǎng)上清，37℃孵育4h。1×TBST漂洗膜3次，每次10～15min。加入已稀釋1∶5000的HRP-羊抗小鼠IgG，37℃孵育2h。1×TBST洗滌3次，每次10～15min.加入DAB顯色液，輕搖至顯色，蒸餾水漂洗終止反應(yīng)，觀察分析結(jié)果。第51頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五單克隆抗體純度鑒定SDS電泳第52頁(yè)，共59頁(yè)，2022年，5月20日，23點(diǎn)38分，星期五單克隆抗體的大量制備——體內(nèi)誘生腹水法

采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法大量制備單克隆抗體：在接種雜交瘤細(xì)胞前1～2周，選取9～10周齡的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射0.5ml石蠟油。將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞1