高春 生化藥物常用分析方法課件

生化藥物常用分析方法

北京市藥品檢驗(yàn)所生化生檢室高春生化藥物常用分析方法北京市藥品檢驗(yàn)所生化生檢室11.生化藥物概念2.生化藥物的分類(lèi)3.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定4.電泳法5.酶的測(cè)定1.生化藥物概念21．生化藥物的概念生化藥物是運(yùn)用生物化學(xué)的研究成果，把生物體產(chǎn)生的各種基本物質(zhì)用于預(yù)防、診斷和治療疾病的一大類(lèi)藥物。包括從動(dòng)物、植物、微生物等生物體中提取分離的天然物質(zhì)及部分化學(xué)合成產(chǎn)物。通常所說(shuō)的生化藥物是專(zhuān)指在生物體內(nèi)起重要生理作用的生命基本物質(zhì)。如：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其降解物、酶與輔酶、維生素、激素、糖與脂類(lèi)等一大類(lèi)藥物。1．生化藥物的概念生化藥物是運(yùn)用生物化學(xué)的研究成果，把生物體32.生化藥物的分類(lèi)(1)按其來(lái)源分：生化藥物按其來(lái)源不同可分為植物生化藥物、動(dòng)物生化藥物、微生物生化藥物及合成生化藥物。(2)按其化學(xué)性質(zhì)及作用分：可分為氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其降解物、酶與輔酶、激素、維生素、糖、脂、有機(jī)酸等。2.生化藥物的分類(lèi)(1)按其來(lái)源分：生化藥物按其來(lái)源不43.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定3.1氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

3.2凱氏定氮法3.3福林-酚試劑法3.4雙縮脲法3.5紫外吸收法3.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定3.1氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)53.1．氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

3.1.1茚三酮反應(yīng)3.1.2雙縮脲反應(yīng)3.1.3與酚試劑的反應(yīng)3.1．氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)63.1.1茚三酮反應(yīng)：蛋白質(zhì)在pH5~7之間，與茚三酮丙酮溶液加熱煮沸時(shí)即出現(xiàn)藍(lán)紫色。此反應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定性與定量。此反應(yīng)的靈敏度為1μg。凡具有氨基、能放出氨的化和物幾乎都有此反應(yīng)，故可用于多肽與蛋白質(zhì)及氨基酸的定性與定量分析。高春生化藥物常用分析方法課件73.1.2雙縮脲反應(yīng)：蛋白質(zhì)溶液加入氫氧化鈉溶液后，逐滴加入0.5%硫酸銅溶液，則出現(xiàn)紫色或紫紅色。原理當(dāng)脲（尿素）加熱（約180℃），兩分子脲縮合，放出一分子氨而形成雙縮脲，然后在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色化合物。蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽分子中，含有多個(gè)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也有雙縮脲反應(yīng)。肽鍵越多反應(yīng)顏色越深。氨基酸無(wú)此反應(yīng)。高春生化藥物常用分析方法課件83.1.3與酚試劑的反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸能與含有磷鎢酸－磷鉬酸化合物的酚試劑起反應(yīng)。在堿性條件下后者被還原成藍(lán)色物質(zhì)。顏色的深淺與蛋白質(zhì)的量成正比，所以可作為蛋白質(zhì)的比色測(cè)定方法。高春生化藥物常用分析方法課件93.2．凱氏定氮法3.2.1原理3.2.2

試劑和儀器3.2.3操作步驟3.2.4注意事項(xiàng)

3.2．凱氏定氮法103.2．凱氏定氮法3.2.1原理每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量一般為15～17.6%，平均為16％，因此只要測(cè)得樣品中的含氮量，就可以通過(guò)計(jì)算求得樣品的蛋白質(zhì)含量。定氮法的基本原理是將蛋白質(zhì)用濃硫酸分解，并使其中的氮變成銨鹽狀態(tài)，再與濃堿作用，放出的氨被酸吸收，滴定剩余的酸，計(jì)算出含氮量。微量凱氏定氮法最低可測(cè)出0.05毫克氮，相當(dāng)于0.3毫克左右蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含氮量×100/16＝蛋白質(zhì)含氮量×6.253.2．凱氏定氮法113.2.2.

試劑和儀器1．微量定氮儀器裝置全套：包括蒸汽發(fā)生器、冷凝蒸汽收集器、微量定氮蒸餾瓶、小型冷凝管。2．消化爐（電爐）3．濃硫酸4.氫氧化鈉溶液（40%）5．消化劑：硫酸銅及硫酸鉀按1:4（w/w）至1：5比例，研細(xì)充分混勻。6．標(biāo)準(zhǔn)0.010N鹽酸和0.010N氫氧化鈉溶液。7．指示劑0.1%甲基紅乙醇溶液。8．2％硼酸吸收液3.2.2.試劑和儀器123.2.3凱氏定氮法一般步驟

消化

蒸餾

滴定返回3.2.3凱氏定氮法一般步驟133.2.4.注意事項(xiàng)1．必須仔細(xì)檢查凱氏定氮儀的各個(gè)連接處，保證不漏氣。2．消化初期瓶?jī)?nèi)物質(zhì)碳化變黑，并產(chǎn)生泡沫，要特別注意控制火力，微火加熱，不能讓黑色物質(zhì)上升到頸部，否則將嚴(yán)重影響樣品的測(cè)定結(jié)果。當(dāng)混合液停止冒泡，氣體逸出也較均勻時(shí)，可適當(dāng)加大火焰，使瓶?jī)?nèi)液體微沸而不致跳蕩。硫酸溶液逐步從棕黑色變成澄清。由于消化液澄清并不說(shuō)明消化一定完成，為保證反應(yīng)充分完成，繼續(xù)沸騰1小時(shí)。反應(yīng)終了，溶液應(yīng)呈淡藍(lán)色或無(wú)色透明，若帶有黃色表示消化末完全。如果蛋白質(zhì)樣品中含賴(lài)氨酸或組氨酸較多，則消化時(shí)間要延長(zhǎng)1-2倍。3.2.4.注意事項(xiàng)143．消化完畢，靜置使冷，仔細(xì)加入少量蒸餾水，洗滌管壁。因?qū)嶒?yàn)室中空氣往往含有極微量的氨，每次分析時(shí)都要另做空白對(duì)照，即一切處理與樣品管相同，但不加蛋白質(zhì)樣品。4．蒸餾前要先蒸洗15分鐘以上。5．小心加樣，避免樣品污染凱氏瓶口部和頸部。3．消化完畢，靜置使冷，仔細(xì)加入少量蒸餾水，洗滌管壁。因?qū)嶒?yàn)156．使用凱氏定氮儀時(shí)，開(kāi)關(guān)甲、乙的掌握與實(shí)驗(yàn)成敗很有關(guān)系，在加樣時(shí)，開(kāi)關(guān)甲一定要開(kāi)啟著，而且一定要使蒸汽發(fā)生后才能關(guān)閉，否則會(huì)發(fā)生樣品倒吸現(xiàn)象。開(kāi)關(guān)乙也要關(guān)閉及時(shí)，防止氨逸出。7．蒸餾時(shí)，保持火力穩(wěn)定，否則易發(fā)生倒吸現(xiàn)象。6．使用凱氏定氮儀時(shí)，開(kāi)關(guān)甲、乙的掌握與實(shí)驗(yàn)成敗很有關(guān)系，在168．氨氣蒸餾時(shí)，為了使所有硫酸銨分解為氨，必須加入足量40%氫氧化鈉，加入時(shí)要水平緩慢，以免產(chǎn)生劇烈反應(yīng)而導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)酸液倒吸和氨的損失，堿加入后，有銅氨離子、氫氧化銅或氧化銅等化合物生成，溶液呈藍(lán)色或褐色。并有膠狀沉淀產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，反之，如果不變，說(shuō)明堿液可能不夠。8．氨氣蒸餾時(shí)，為了使所有硫酸銨分解為氨，必須加入足量40%179．如果測(cè)定的不是純蛋白質(zhì)，可能含有非蛋白氮，必須分別測(cè)定蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮的測(cè)定可以將樣品制成均漿或抽提液，用三氯醋酸或鎢酸等沉淀劑將蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)，按總氮法測(cè)定上清液的含氮量，便得到非蛋白質(zhì)氮。9．如果測(cè)定的不是純蛋白質(zhì)，可能含有非蛋白氮，必須分別測(cè)定蛋183.3福林-酚試劑法3.3.1原理3.3.2試劑3.3.3操作步驟3.3.4注意事項(xiàng)3.3福林-酚試劑法193.3福林-酚試劑法3.3.1.原理：福林-酚試劑法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法。福林-酚試劑（Folin-phenolreagent）的顯色原理包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物；第二步是蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。3.3福林-酚試劑法20

本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)特異性的影響，即不同蛋白質(zhì)的顯色強(qiáng)度稍有不同；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)也不是嚴(yán)格的直線(xiàn)形式。本法的可測(cè)定范圍是每毫升25-250微克蛋白質(zhì)。

本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)特異性的213.3.2.試劑試劑A：（1）4％碳酸鈉溶液；（2）0.2mol/L氫氧化鈉溶液；（3）1％硫酸銅溶液（4）2％酒石酸鉀鈉溶液（或其鉀鹽或鈉鹽）。臨用前將（1）與（2）等體積混合，（3）與（4）等體積混合，然后這兩種試劑按50：1的比例混合，即成福林－酚試劑A。3.3.2.試劑22試劑B：在1.5升容積的磨口流瓶中加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸充分混和，接上回流冷凝管小火流10小時(shí)。回流結(jié)束后，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色，（如仍呈綠色，左須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）稀至1升，過(guò)濾，過(guò)濾置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，以酚酞為指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s加水1倍）使最終的酸濃度為1mol/L。試劑B：在1.5升容積的磨口流瓶中加入100克鎢酸鈉，25克233.3.3操作步驟（1）

1ml待測(cè)樣品溶液（適當(dāng)稀至約含25-250微克蛋白質(zhì)），加5ml試劑A混合，室溫下放置10分鐘后加0.5ml試劑B，立即混和均勻，30分鐘后，以不含蛋白質(zhì)試劑空白對(duì)照比色?？蛇x用波長(zhǎng)650nm或660nm。3.3.3操作步驟24（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：在各試管中分別加牛血清白蛋白溶液（250微克/毫升）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0毫升，并分別加蒸餾水補(bǔ)充到1毫升（即各管中分別含蛋白質(zhì)量0、50、100、150、200和250微克）。以后加試劑及比色等操作步驟與樣品操作相同。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：253.3.4.注意事項(xiàng)(1)牛血清白蛋白的含量明確。(2)福林－酚試劑B在酸性條件下比較穩(wěn)定，而福林－酚試劑A在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅－蛋白質(zhì)溶液。所以加入福林－酚試劑B這一步混和速度要快，使還原反應(yīng)產(chǎn)生在磷鉬酸－磷鎢酸試劑被破壞之前，否則會(huì)使顯色程度減弱。(3)反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度嚴(yán)格控制。(4)按照化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求精密操作。3.3.4.注意事項(xiàng)263.4雙縮脲法3.4.1原理3.4.2試劑3.4.3操作步驟3.4.4注意事項(xiàng)3.4雙縮脲法273.4.雙縮脲法3.4.1．原理雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一分子氨后所得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。3.4.雙縮脲法28雙縮脲法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用方法之一，它除了操作簡(jiǎn)便、迅速外，最大的優(yōu)點(diǎn)是受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，但靈敏度差，所需樣品量大。利用銅復(fù)合物有紫外吸收的特性，使雙縮脲方法能在數(shù)十微克水平進(jìn)行測(cè)定。雙縮脲法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用方法之一，它除了操作簡(jiǎn)便、迅速外293.4.2．試劑堿性銅試劑0.175克硫酸銅溶解于約15毫升水中，置于一100毫升容量瓶中，加入30毫升濃氨水，30毫升冷的蒸餾水及20毫升飽和氫氧化鈉溶液，混勻后，放置至使溶液溫度與室溫相同，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。此試劑在室溫下可以放置3-4個(gè)月不影響顯色。3.4.2．試劑303.4.3．操作步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備每組取7支試管，依次加入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分別補(bǔ)足蒸餾水至3毫升，混勻后各管加2毫升堿性銅試劑，充分混和后，呈現(xiàn)紫色，立即于540nm下測(cè)定光吸收（以第一管作空白對(duì)照）。(2)供試品測(cè)定取3毫升樣品溶液，加入堿性銅試劑2毫升，充分混勻后，于540nm下測(cè)定吸收值，操作條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3.4.3．操作步驟313.4.4.注意事項(xiàng)樣品溶液與試劑混合后，有時(shí)約30分鐘后有霧狀沉淀

產(chǎn)生。這種現(xiàn)象對(duì)含脂肪類(lèi)物質(zhì)的蛋白質(zhì)抽提液較易發(fā)生，而對(duì)于純蛋白質(zhì)溶液不明顯?？朔姆椒ㄓ腥N：（1）加入試劑后立即比色，至少應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成；（2）如沉淀已經(jīng)產(chǎn)生，則可以放置二小時(shí)或更多時(shí)間，離心去沉淀后取上清液比色；（3）加1.5毫升乙醇或石油醚，離心后比色。

3.4.4.注意事項(xiàng)323.5紫外吸收法原理蛋白質(zhì)分子中所含有的酪氨酸和色氨酸殘基使蛋白質(zhì)在280nm下具有最大吸收值；蛋白質(zhì)溶液在238nm下的光吸收值，其吸收強(qiáng)度與肽鍵量成正比。利用在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。3.5紫外吸收法33

4.電泳分析法

4.1電泳的基本概念4.2電泳的分類(lèi)4.3醋酸纖維膜電泳法4.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

344.1電泳的基本概念電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱(chēng)為電泳。4.1電泳的基本概念354.2.電泳的分類(lèi)按分離原理分類(lèi)可分為區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳和聚焦電泳4種。（1）區(qū)帶電泳電泳過(guò)程中，不同的離子成分在均一的緩沖液體系中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。（2）移界電泳是在U形管中進(jìn)行的，由于分離效果較差，已為其他電泳技術(shù)所取代。高春生化藥物常用分析方法課件36（3）等速電泳需專(zhuān)用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相隨分成清晰的界面，并以等速移動(dòng)。（4）等電聚焦電泳由于具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)中，自動(dòng)形成pH梯度，使被分離物移動(dòng)至各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶，且分辨率較高。從表面上看與區(qū)帶電泳相似，但原理不同。（3）等速電泳需專(zhuān)用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相374.3.醋酸纖維膜電泳法4.3.1基本概念什么是醋酸纖維膜電泳以醋酸纖維膜為支持介質(zhì)的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。4.3.2原理蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，具有兩性游離特性。人血白蛋白為一種蛋白質(zhì)，因而其具有兩性化合物的性質(zhì)，在堿性緩沖液中，即pH質(zhì)大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極遷移，如果人血白蛋白中含有其他雜蛋白，其帶電荷的量會(huì)不同于人血白蛋白，在電場(chǎng)中遷移的速度就不同，帶負(fù)電荷越多的蛋白質(zhì)其遷移速度越快。這樣就會(huì)在醋酸纖維薄膜留下不同的區(qū)帶，經(jīng)染色后，脫色，掃描后，即可測(cè)得人血白蛋白的純度。4.3.醋酸纖維膜電泳法384.3.3特點(diǎn)：微量，快速，簡(jiǎn)便，分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾及吸附現(xiàn)象等。目前，國(guó)內(nèi)有醋酸纖維薄膜商品出售，不同廠家生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜主要在乙?；?、厚度、孔徑、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等方面有所不同，但分離效果基本一致，一般多采用浙江黃巖化工廠生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜。4.3.3特點(diǎn)：微量，快速，簡(jiǎn)便，分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾394.3.4酸纖維薄膜與濾紙比較酸纖維薄膜與濾紙比較有以下優(yōu)點(diǎn)（1）

酸纖維薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸收極少，無(wú)“拖尾”現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了定量的精確性。（2）

快速省時(shí),由于醋酸纖維薄膜親水性較濾紙小，薄膜中所容納的緩沖液也較小，電滲作用小，電泳時(shí)大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快，電泳時(shí)間短，一般電泳45-60分鐘即可，加上染色，脫色，整個(gè)電泳完成僅需90分鐘左右。4.3.4酸纖維薄膜與濾紙比較40（3）

靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μl血清，甚至加樣體積少至0.1μl，臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)利用這一特點(diǎn)，檢測(cè)在病理情況下微量異常蛋白的改變。（4）應(yīng)用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如，胎兒甲種球蛋白，溶菌酶，胰島素，組蛋白等用醋酸纖維薄膜電泳能較好地分離。（5）

醋酸纖維薄膜電泳染色后，經(jīng)冰醋酸，乙醇混合或其他溶液浸泡后制成干板，有利于掃描定量及長(zhǎng)期保存。（3）靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μl血清，甚41由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡(jiǎn)單，快速，價(jià)廉。目前已廣泛用于分析檢測(cè)血漿蛋白，脂蛋白，糖蛋白，胎兒甲種球蛋白，體液，脊髓液，脫氫酶，多肽，核酸及其他生物大分子，為心血管疾病，肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡(jiǎn)單，快速，價(jià)廉。目前已廣泛用424.3.5酸纖維薄膜電泳操作步驟

儀器與薄膜的準(zhǔn)備

點(diǎn)樣

電泳

染色與漂洗

透明返回4.3.5酸纖維薄膜電泳操作步驟434.3.6注意事項(xiàng)1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理2、緩沖液的選擇3、加樣量4、電量的選擇5、染色液的選擇6、透明及保存4.3.6注意事項(xiàng)444.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳4.4.1

原理以紙，醋酸纖維素薄膜，瓊脂（糖）及均一聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷，分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可采用聚丙烯酰胺濃度剃度電泳，利用它所形成孔徑不同引起的分子篩效應(yīng)，可將蛋白質(zhì)分子分開(kāi)。也可在整個(gè)電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（SDS），則電泳遷移率主要依賴(lài)于分子量，而與所帶凈電荷和形狀無(wú)關(guān)。這種電泳方法為SDS。4.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳454.4.2

用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理SDS是陰離子去污劑，它在水溶液中，以單體和分子團(tuán)混合物的形式存在，蛋白質(zhì)在巰基乙醇作用下，還原成單鏈，再進(jìn)一步與SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所4.4.2

用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理46帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。測(cè)定未知蛋白質(zhì)分子量時(shí)，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行SDS，則可根據(jù)已知蛋白質(zhì)的電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得分子量。帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和47優(yōu)點(diǎn)用此法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，樣品用量少，耗時(shí)少（僅需一天），分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來(lái)，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序，酶解圖譜及抗還原性質(zhì)等方面的研究。`優(yōu)點(diǎn)用此法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，樣48缺點(diǎn)在蛋白質(zhì)所帶電荷異?；驑?gòu)象異常時(shí)，帶有較大輔基的蛋白（如糖蛋白）及一些結(jié)構(gòu)蛋白等測(cè)出的分子量不太可靠。如組蛋白F1，本身帶有大量的正電荷，雖然結(jié)合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原由正電荷，故用SDS測(cè)得的分子量為35000，而用其他方法測(cè)定的分子量為21000。因此要確定某種蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，最好用2種測(cè)定方法相互驗(yàn)證，則更可靠。尤其是對(duì)一些由亞基或2條以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)，由于缺點(diǎn)在蛋白質(zhì)所帶電荷異?；驑?gòu)象異常時(shí)，帶有較大輔基的蛋白49SDS巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開(kāi)，解理成亞基或單個(gè)肽鏈，因此測(cè)定結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量，還需用其他方法測(cè)定其分子量中肽鏈的數(shù)目。SDS巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開(kāi)，解理成亞504.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟安裝夾心式垂直板電泳槽配膠及凝膠板的制備分離膠和濃縮膠的制備樣品的處理與加樣

電泳返回4.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟安裝514.4.4注意事項(xiàng)1.SDS的純度2.SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合量3.凝膠濃度4.對(duì)樣品的要求5.凝膠成像4.4.4注意事項(xiàng)525.酶的測(cè)定5.1酶的概念：5.2酶的特點(diǎn)：5.3酶的專(zhuān)一性：5.4酶的分類(lèi)與命名5.5酶的化學(xué)組成5.6酶促反應(yīng)的影響因素5.7酶活力的測(cè)定方法5.酶的測(cè)定5.1酶的概念：535.1酶的概念

酶是生物體內(nèi)一類(lèi)具有催化活性和特定空間構(gòu)象的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。5.1酶的概念545.2酶的特點(diǎn)5.2.1酶作用一般都要求比較溫和的條件，如常溫，常壓，接近中性的酸堿度等。5.2.2酶的催化效應(yīng)非常高酶促反應(yīng)比相應(yīng)的非酶促反應(yīng)要快103～1017倍。5.2.3酶具有高度的專(zhuān)一性酶對(duì)所作用的物質(zhì)（稱(chēng)為底物）有嚴(yán)格的選擇性，5.2酶的特點(diǎn)55通常一種酶只能作用于某一類(lèi)或某一種特定的物質(zhì)，這也說(shuō)明酶對(duì)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有高度嚴(yán)格要求。5.2.4酶的催化活性是受到調(diào)節(jié)和控制的。他的調(diào)控方式很多，包括反饋調(diào)節(jié)、抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。5.2.5酶可催化某些特異的化學(xué)反應(yīng)，體內(nèi)某些物質(zhì)的合成只能由酶促反應(yīng)完成。如某些蛋白質(zhì)、多肽、核酸以及其他一些生物活性物質(zhì)的合成都要通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行。通常一種酶只能作用于某一類(lèi)或某一種特定的物質(zhì)，這也說(shuō)明酶對(duì)底565.3酶作用的專(zhuān)一性一種酶只作用于一類(lèi)化合物或一定的化學(xué)鍵，以促進(jìn)一定的化學(xué)變化，生成一定的產(chǎn)物。受酶催化的化合物稱(chēng)為該酶的底物或作用物。酶對(duì)底物的專(zhuān)一性通常分為以下幾種。5.3.1

立體化學(xué)專(zhuān)一性是從底物的立體化學(xué)性質(zhì)來(lái)考慮的一種專(zhuān)一性?？煞譃閮深?lèi)（1）立體異構(gòu)專(zhuān)一性（2）幾何異構(gòu)專(zhuān)一性。5.3酶作用的專(zhuān)一性575.3.2

非立體異構(gòu)專(zhuān)一性如果一種酶不具有立體化學(xué)專(zhuān)一性，則可從底物的化學(xué)鍵及組成該鍵的基團(tuán)來(lái)考慮其專(zhuān)一性。如以A-B為底物，可認(rèn)為它是由三部分組成，即A、B與連接它們的鍵。非立體化學(xué)專(zhuān)一性可依據(jù)酶對(duì)這三種組成部分選擇程度的不同分為三類(lèi)（1）鍵專(zhuān)一性（2）基團(tuán)專(zhuān)一性（3）絕對(duì)專(zhuān)一性。5.3.2

非立體異構(gòu)專(zhuān)一性如果一種酶不具有立體化學(xué)專(zhuān)585.4酶的分類(lèi)與命名5.4.1酶的分類(lèi)依據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定，按催化反應(yīng)的類(lèi)型可分為六大類(lèi)。（1）氧化還原酶類(lèi)催化氧化還原反應(yīng)。（2）轉(zhuǎn)移酶類(lèi)催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。（3）水解酶類(lèi)催化水解的反應(yīng)（4）裂合酶類(lèi)催化水、氨或二氧化碳的去除或加入。（5）異構(gòu)酶類(lèi)催化各種類(lèi)型的異構(gòu)作用。（6）合成酶類(lèi)催化消耗ATP的成鍵反應(yīng)

5.4酶的分類(lèi)與命名595.5酶的化學(xué)組成酶和其他蛋白質(zhì)一樣，根據(jù)其組成成分可分為簡(jiǎn)單蛋白酶和結(jié)合蛋白酶兩種。單純酶酶的活性?xún)H僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如水解酶類(lèi)（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶及尿酶等），這些酶的結(jié)構(gòu)由簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)構(gòu)成，故稱(chēng)為單純酶。5.5酶的化學(xué)組成60結(jié)合酶其結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子外，還含有非蛋白質(zhì)部分，如大多數(shù)氧化還原酶類(lèi)，這些酶由結(jié)合蛋白質(zhì)構(gòu)成，因而稱(chēng)為結(jié)合酶。在結(jié)合酶中，蛋白質(zhì)部分稱(chēng)為酶蛋白，非蛋白質(zhì)部分統(tǒng)稱(chēng)為輔因子。輔因子又可分成輔酶和輔基兩類(lèi)。酶蛋白與輔因子結(jié)合成的完整分子成為全酶，即全酶=酶蛋白+輔因子（輔酶或輔基）。只有全酶才有催化活性，將酶蛋白與輔因子分開(kāi)后均無(wú)催化作用。結(jié)合酶其結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子外，還含有非蛋白質(zhì)部分，如大多數(shù)61根據(jù)蛋白的特點(diǎn)和分子大小又把酶分成三類(lèi)（1）單體酶只有一條多肽鏈（2）

寡聚酶由幾條至幾十條多肽鏈亞基組成。（3）

多酶體系是由幾種酶彼此嵌合形成的復(fù)合體。他有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。根據(jù)蛋白的特點(diǎn)和分子大小又把酶分成三類(lèi)625.6酶促反應(yīng)的影響因素5.6.1底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響

5.6.2pH的影響與最適pH5.6.3溫度的影響與最適溫度5.6.4酶濃度的影響5.6.5激活劑的影響5.6.6抑制劑的影響5.6.7酶活力的測(cè)定方法5.6酶促反應(yīng)的影響因素635.6.1底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響

酶促反應(yīng)中，酶先與底物形成中間復(fù)合物，再轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，并重新釋放出游離的酶。在酶濃度恒定的條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛群苄r(shí)，酶未被底物飽和，這時(shí)反應(yīng)速度取決于底物的濃度，底物濃度越大，單位時(shí)間內(nèi)ES生成的越多，而反應(yīng)速度取決于ES的濃度，故反應(yīng)速度也隨之增高。當(dāng)?shù)孜餄舛燃哟蠛?，酶逐漸被底物所飽和，反應(yīng)速度的增加和底物的濃度就不成正比，續(xù)而底物增加至極大值，所有酶分子均被底物飽和，所有的E均轉(zhuǎn)變成ES，此時(shí)的反應(yīng)速度不會(huì)進(jìn)一步增高。5.6.1底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響645.6.2

pH的影響與最適pH大多數(shù)酶的活性受pH影響較大。在一定pH下酶表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，活力均降低。酶表現(xiàn)最大活力時(shí)的pH稱(chēng)為酶的最適pH。PH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響，主要有下列原因（1）

影響酶和底物的解離酶的活性基團(tuán)的解離受pH的影響，有的酶必須處于解離狀態(tài)方能很好的與底物結(jié)合，在這種情況下，酶和底物解離最大的pH有利于酶促反應(yīng)的加速。(2）

影響酶分子的構(gòu)象過(guò)高過(guò)低的pH會(huì)改變酶的活性中心的構(gòu)象，甚至?xí)淖冋麄€(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)使其變性。5.6.2pH的影響與最適pH655.6.3溫度的影響與最適溫度化學(xué)反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但酶是蛋白質(zhì)，可隨溫度的升高而變性。5.6.4酶濃度的影響在一定條件下，酶的濃度與反應(yīng)初速度成正比。因?yàn)槊复呋磻?yīng)時(shí)，酶先要與底物形成中間物，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^(guò)酶濃度時(shí)，反應(yīng)達(dá)到最大速度，這時(shí)增加酶濃度可增加反應(yīng)速度，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系。這也是酶活力測(cè)定常用的方法。5.6.3溫度的影響與最適溫度665.7酶活力的測(cè)定方法

酶的定量一般指測(cè)定酶的活力，由于酶不易提純，一些酶制劑中常含有很多雜質(zhì)，所以酶含量不能象化學(xué)藥品用重量表示，而是用單位時(shí)間內(nèi)催化某一特定反應(yīng)的能力，即酶促反應(yīng)速度大小，間接測(cè)得酶活力。一般用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中底物均過(guò)量，少量底物的減少難以準(zhǔn)確測(cè)定，而產(chǎn)物從無(wú)到有，測(cè)定起來(lái)比較容易，所以中國(guó)藥典上收載的品種大部分采用測(cè)定產(chǎn)物的方法。酶活力的測(cè)定的三要素:溫度;pH;時(shí)間5.7酶活力的測(cè)定方法675.8酶活力測(cè)定舉例胰蛋白酶的效價(jià)測(cè)定5.8.1原理：胰蛋白酶可以催化酪蛋白水解產(chǎn)生不被三氯醋酸所沉淀的肽及氨基酸、色氨酸和苯丙氨酸，在275nm處有較強(qiáng)的吸收，以酪氨酸為對(duì)照品進(jìn)行定量測(cè)定，即：每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生成三氯醋酸不沉淀物（肽及氨基酸）275nm波長(zhǎng)處與1umol酪氨酸相當(dāng)?shù)拿噶?，?個(gè)活力單位。試液：5.8酶活力測(cè)定舉例685.8.2操作步驟1．

對(duì)照品溶液的制備：2．

供試品原液的制備：3．

供試品溶液的制備：4．

空白溶液的制備：5．

在275nm處測(cè)定吸收值。5.8.2操作步驟695.8.3注意事項(xiàng)：1.

供試品原液的制備中氯化鈣溶液的溫度一定要控制在5℃以下，防止胰蛋白酶的降解。2．研磨一定要快速、均勻。3.溫度恒定，采用恒溫水浴，要求溫度恒定在正負(fù)0.1℃以?xún)?nèi)（對(duì)恒溫水浴箱的要求較高）。4．時(shí)間準(zhǔn)確，要求用秒表計(jì)時(shí)。5．反應(yīng)過(guò)程中及反應(yīng)完成，在全程中要嚴(yán)格控制溶液的pH，不得任意增加底物溶液、終止劑的量，避免改變?nèi)芤旱膒H，因?yàn)榈孜锶芤汉徒K止劑，已經(jīng)是過(guò)量的。三氯醋酸易吸濕，但不要因此而多稱(chēng)三氯醋酸的固體，提高其濃度，否則會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏低。5.8.3注意事項(xiàng)：70小結(jié)1.生化藥物概念2.生化藥物的分類(lèi)3.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定4.電泳法5.酶的測(cè)定小結(jié)1.生化藥物概念71前3節(jié)簡(jiǎn)單介紹了有關(guān)生化藥物的常識(shí)，什么是生化藥物，生化藥物的分類(lèi)等。重點(diǎn)介紹了蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法。主要有：（1）凱氏定氮法：應(yīng)用每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量一般為15～17.6%，平均為16％，只要測(cè)得樣品中的含氮量，就可以通過(guò)計(jì)算求得樣品的蛋白質(zhì)含量。前3節(jié)簡(jiǎn)單介紹了有關(guān)生化藥物的常識(shí)，什么是生化藥物，生化藥物72（2）福林-酚試劑法：也是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法。福林-酚試劑（Folin-phenolreagent）的顯色原理包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物；第二步是蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。缺點(diǎn)本方法只與蛋白質(zhì)中個(gè)別的氨基酸反應(yīng)而受蛋白質(zhì)中氨基酸組成的特異影響，即不同蛋白質(zhì)所含酪氨酸和色氨酸量的不同而顯色強(qiáng)度有所差異，這就要求作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)其顯色氨基酸的量應(yīng)與樣品接近，減少誤差。

（2）福林-酚試劑法：也是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法73（3）雙縮脲法：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一分子氨后所得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色，凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用方法之一，它除了操作簡(jiǎn)便、迅速外，最大的優(yōu)點(diǎn)是受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，但靈敏度差，所需樣品量大。利用銅復(fù)合物有紫外吸收的特性，使雙縮脲方法能在數(shù)十微克水平進(jìn)行測(cè)定。

（3）雙縮脲法：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩分子脲74（4）紫外吸收法：蛋白質(zhì)溶液在238nm下的光吸收值，其吸收強(qiáng)度與肽鍵量成正比。利用該關(guān)系可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法操作簡(jiǎn)便，快速，所需樣品量少。此法的缺點(diǎn)是對(duì)于測(cè)定物與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)，也會(huì)干擾測(cè)定。（4）紫外吸收法：蛋白質(zhì)溶液在238nm下的光吸收值，其吸收75第4節(jié)主要介紹了電泳分析方法的有關(guān)知識(shí)，電泳的基本原理，是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)。用蛋白質(zhì)的純度測(cè)定及分子量測(cè)定具體介紹了醋酸纖維素薄膜電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。醋酸纖維素薄膜電泳是通過(guò)電泳緩沖液的酸堿度使蛋白質(zhì)分子解離成帶不同電荷的分子，在電場(chǎng)的作用下形成了不同的區(qū)帶，從而將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。分開(kāi)。

第4節(jié)主要介紹了電泳分析方法的有關(guān)知識(shí)，電泳的基本原理，是帶76SDS電泳是蛋白質(zhì)在巰基乙醇的作用下，還原成單鏈，再進(jìn)一步與SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。

SDS電泳是蛋白質(zhì)在巰基乙醇的作用下，還原成單鏈，77SDS電泳是蛋白質(zhì)在巰基乙醇的作用下，還原成單鏈，再進(jìn)一步與SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。

SDS電泳是蛋白質(zhì)在巰基乙醇的作用下，還原成單鏈，78SDS電泳是蛋白質(zhì)在巰基乙醇的作用下，還原成單鏈，再進(jìn)一步與SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。

SDS電泳是蛋白質(zhì)在巰基乙醇的作用下，還原成單鏈，79第5節(jié)主要介紹了酶的有關(guān)知識(shí)5.1酶的概念5.2酶的特點(diǎn)5.3酶的專(zhuān)一性5.4酶的分類(lèi)與命名5.5酶的化學(xué)組成5.6酶促反應(yīng)的影響因素5.7酶活力的測(cè)定方法第5節(jié)主要介紹了酶的有關(guān)知識(shí)80謝謝謝謝81

生化藥物常用分析方法

北京市藥品檢驗(yàn)所生化生檢室高春生化藥物常用分析方法北京市藥品檢驗(yàn)所生化生檢室821.生化藥物概念2.生化藥物的分類(lèi)3.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定4.電泳法5.酶的測(cè)定1.生化藥物概念831．生化藥物的概念生化藥物是運(yùn)用生物化學(xué)的研究成果，把生物體產(chǎn)生的各種基本物質(zhì)用于預(yù)防、診斷和治療疾病的一大類(lèi)藥物。包括從動(dòng)物、植物、微生物等生物體中提取分離的天然物質(zhì)及部分化學(xué)合成產(chǎn)物。通常所說(shuō)的生化藥物是專(zhuān)指在生物體內(nèi)起重要生理作用的生命基本物質(zhì)。如：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其降解物、酶與輔酶、維生素、激素、糖與脂類(lèi)等一大類(lèi)藥物。1．生化藥物的概念生化藥物是運(yùn)用生物化學(xué)的研究成果，把生物體842.生化藥物的分類(lèi)(1)按其來(lái)源分：生化藥物按其來(lái)源不同可分為植物生化藥物、動(dòng)物生化藥物、微生物生化藥物及合成生化藥物。(2)按其化學(xué)性質(zhì)及作用分：可分為氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其降解物、酶與輔酶、激素、維生素、糖、脂、有機(jī)酸等。2.生化藥物的分類(lèi)(1)按其來(lái)源分：生化藥物按其來(lái)源不853.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定3.1氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

3.2凱氏定氮法3.3福林-酚試劑法3.4雙縮脲法3.5紫外吸收法3.蛋白質(zhì)的含量測(cè)定3.1氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)863.1．氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

3.1.1茚三酮反應(yīng)3.1.2雙縮脲反應(yīng)3.1.3與酚試劑的反應(yīng)3.1．氨基酸及蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)873.1.1茚三酮反應(yīng)：蛋白質(zhì)在pH5~7之間，與茚三酮丙酮溶液加熱煮沸時(shí)即出現(xiàn)藍(lán)紫色。此反應(yīng)用于蛋白質(zhì)的定性與定量。此反應(yīng)的靈敏度為1μg。凡具有氨基、能放出氨的化和物幾乎都有此反應(yīng)，故可用于多肽與蛋白質(zhì)及氨基酸的定性與定量分析。高春生化藥物常用分析方法課件883.1.2雙縮脲反應(yīng)：蛋白質(zhì)溶液加入氫氧化鈉溶液后，逐滴加入0.5%硫酸銅溶液，則出現(xiàn)紫色或紫紅色。原理當(dāng)脲（尿素）加熱（約180℃），兩分子脲縮合，放出一分子氨而形成雙縮脲，然后在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色化合物。蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽分子中，含有多個(gè)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也有雙縮脲反應(yīng)。肽鍵越多反應(yīng)顏色越深。氨基酸無(wú)此反應(yīng)。高春生化藥物常用分析方法課件893.1.3與酚試劑的反應(yīng)：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸能與含有磷鎢酸－磷鉬酸化合物的酚試劑起反應(yīng)。在堿性條件下后者被還原成藍(lán)色物質(zhì)。顏色的深淺與蛋白質(zhì)的量成正比，所以可作為蛋白質(zhì)的比色測(cè)定方法。高春生化藥物常用分析方法課件903.2．凱氏定氮法3.2.1原理3.2.2

試劑和儀器3.2.3操作步驟3.2.4注意事項(xiàng)

3.2．凱氏定氮法913.2．凱氏定氮法3.2.1原理每一種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量一般為15～17.6%，平均為16％，因此只要測(cè)得樣品中的含氮量，就可以通過(guò)計(jì)算求得樣品的蛋白質(zhì)含量。定氮法的基本原理是將蛋白質(zhì)用濃硫酸分解，并使其中的氮變成銨鹽狀態(tài)，再與濃堿作用，放出的氨被酸吸收，滴定剩余的酸，計(jì)算出含氮量。微量凱氏定氮法最低可測(cè)出0.05毫克氮，相當(dāng)于0.3毫克左右蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含氮量×100/16＝蛋白質(zhì)含氮量×6.253.2．凱氏定氮法923.2.2.

試劑和儀器1．微量定氮儀器裝置全套：包括蒸汽發(fā)生器、冷凝蒸汽收集器、微量定氮蒸餾瓶、小型冷凝管。2．消化爐（電爐）3．濃硫酸4.氫氧化鈉溶液（40%）5．消化劑：硫酸銅及硫酸鉀按1:4（w/w）至1：5比例，研細(xì)充分混勻。6．標(biāo)準(zhǔn)0.010N鹽酸和0.010N氫氧化鈉溶液。7．指示劑0.1%甲基紅乙醇溶液。8．2％硼酸吸收液3.2.2.試劑和儀器933.2.3凱氏定氮法一般步驟

消化

蒸餾

滴定返回3.2.3凱氏定氮法一般步驟943.2.4.注意事項(xiàng)1．必須仔細(xì)檢查凱氏定氮儀的各個(gè)連接處，保證不漏氣。2．消化初期瓶?jī)?nèi)物質(zhì)碳化變黑，并產(chǎn)生泡沫，要特別注意控制火力，微火加熱，不能讓黑色物質(zhì)上升到頸部，否則將嚴(yán)重影響樣品的測(cè)定結(jié)果。當(dāng)混合液停止冒泡，氣體逸出也較均勻時(shí)，可適當(dāng)加大火焰，使瓶?jī)?nèi)液體微沸而不致跳蕩。硫酸溶液逐步從棕黑色變成澄清。由于消化液澄清并不說(shuō)明消化一定完成，為保證反應(yīng)充分完成，繼續(xù)沸騰1小時(shí)。反應(yīng)終了，溶液應(yīng)呈淡藍(lán)色或無(wú)色透明，若帶有黃色表示消化末完全。如果蛋白質(zhì)樣品中含賴(lài)氨酸或組氨酸較多，則消化時(shí)間要延長(zhǎng)1-2倍。3.2.4.注意事項(xiàng)953．消化完畢，靜置使冷，仔細(xì)加入少量蒸餾水，洗滌管壁。因?qū)嶒?yàn)室中空氣往往含有極微量的氨，每次分析時(shí)都要另做空白對(duì)照，即一切處理與樣品管相同，但不加蛋白質(zhì)樣品。4．蒸餾前要先蒸洗15分鐘以上。5．小心加樣，避免樣品污染凱氏瓶口部和頸部。3．消化完畢，靜置使冷，仔細(xì)加入少量蒸餾水，洗滌管壁。因?qū)嶒?yàn)966．使用凱氏定氮儀時(shí)，開(kāi)關(guān)甲、乙的掌握與實(shí)驗(yàn)成敗很有關(guān)系，在加樣時(shí)，開(kāi)關(guān)甲一定要開(kāi)啟著，而且一定要使蒸汽發(fā)生后才能關(guān)閉，否則會(huì)發(fā)生樣品倒吸現(xiàn)象。開(kāi)關(guān)乙也要關(guān)閉及時(shí)，防止氨逸出。7．蒸餾時(shí)，保持火力穩(wěn)定，否則易發(fā)生倒吸現(xiàn)象。6．使用凱氏定氮儀時(shí)，開(kāi)關(guān)甲、乙的掌握與實(shí)驗(yàn)成敗很有關(guān)系，在978．氨氣蒸餾時(shí)，為了使所有硫酸銨分解為氨，必須加入足量40%氫氧化鈉，加入時(shí)要水平緩慢，以免產(chǎn)生劇烈反應(yīng)而導(dǎo)致瓶?jī)?nèi)酸液倒吸和氨的損失，堿加入后，有銅氨離子、氫氧化銅或氧化銅等化合物生成，溶液呈藍(lán)色或褐色。并有膠狀沉淀產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，反之，如果不變，說(shuō)明堿液可能不夠。8．氨氣蒸餾時(shí)，為了使所有硫酸銨分解為氨，必須加入足量40%989．如果測(cè)定的不是純蛋白質(zhì)，可能含有非蛋白氮，必須分別測(cè)定蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮的測(cè)定可以將樣品制成均漿或抽提液，用三氯醋酸或鎢酸等沉淀劑將蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)，按總氮法測(cè)定上清液的含氮量，便得到非蛋白質(zhì)氮。9．如果測(cè)定的不是純蛋白質(zhì)，可能含有非蛋白氮，必須分別測(cè)定蛋993.3福林-酚試劑法3.3.1原理3.3.2試劑3.3.3操作步驟3.3.4注意事項(xiàng)3.3福林-酚試劑法1003.3福林-酚試劑法3.3.1.原理：福林-酚試劑法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法。福林-酚試劑（Folin-phenolreagent）的顯色原理包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物；第二步是蛋白質(zhì)－銅復(fù)合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。3.3福林-酚試劑法101

本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)特異性的影響，即不同蛋白質(zhì)的顯色強(qiáng)度稍有不同；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)也不是嚴(yán)格的直線(xiàn)形式。本法的可測(cè)定范圍是每毫升25-250微克蛋白質(zhì)。

本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。缺點(diǎn)是有蛋白質(zhì)特異性的1023.3.2.試劑試劑A：（1）4％碳酸鈉溶液；（2）0.2mol/L氫氧化鈉溶液；（3）1％硫酸銅溶液（4）2％酒石酸鉀鈉溶液（或其鉀鹽或鈉鹽）。臨用前將（1）與（2）等體積混合，（3）與（4）等體積混合，然后這兩種試劑按50：1的比例混合，即成福林－酚試劑A。3.3.2.試劑103試劑B：在1.5升容積的磨口流瓶中加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸充分混和，接上回流冷凝管小火流10小時(shí)?；亓鹘Y(jié)束后，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘以便驅(qū)除過(guò)量的溴，冷卻后溶液呈黃色，（如仍呈綠色，左須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）稀至1升，過(guò)濾，過(guò)濾置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定，以酚酞為指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s加水1倍）使最終的酸濃度為1mol/L。試劑B：在1.5升容積的磨口流瓶中加入100克鎢酸鈉，25克1043.3.3操作步驟（1）

1ml待測(cè)樣品溶液（適當(dāng)稀至約含25-250微克蛋白質(zhì)），加5ml試劑A混合，室溫下放置10分鐘后加0.5ml試劑B，立即混和均勻，30分鐘后，以不含蛋白質(zhì)試劑空白對(duì)照比色。可選用波長(zhǎng)650nm或660nm。3.3.3操作步驟105（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：在各試管中分別加牛血清白蛋白溶液（250微克/毫升）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0毫升，并分別加蒸餾水補(bǔ)充到1毫升（即各管中分別含蛋白質(zhì)量0、50、100、150、200和250微克）。以后加試劑及比色等操作步驟與樣品操作相同。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：1063.3.4.注意事項(xiàng)(1)牛血清白蛋白的含量明確。(2)福林－酚試劑B在酸性條件下比較穩(wěn)定，而福林－酚試劑A在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅－蛋白質(zhì)溶液。所以加入福林－酚試劑B這一步混和速度要快，使還原反應(yīng)產(chǎn)生在磷鉬酸－磷鎢酸試劑被破壞之前，否則會(huì)使顯色程度減弱。(3)反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度嚴(yán)格控制。(4)按照化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求精密操作。3.3.4.注意事項(xiàng)1073.4雙縮脲法3.4.1原理3.4.2試劑3.4.3操作步驟3.4.4注意事項(xiàng)3.4雙縮脲法1083.4.雙縮脲法3.4.1．原理雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一分子氨后所得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或通過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。3.4.雙縮脲法109雙縮脲法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用方法之一，它除了操作簡(jiǎn)便、迅速外，最大的優(yōu)點(diǎn)是受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，但靈敏度差，所需樣品量大。利用銅復(fù)合物有紫外吸收的特性，使雙縮脲方法能在數(shù)十微克水平進(jìn)行測(cè)定。雙縮脲法是測(cè)定蛋白質(zhì)濃度常用方法之一，它除了操作簡(jiǎn)便、迅速外1103.4.2．試劑堿性銅試劑0.175克硫酸銅溶解于約15毫升水中，置于一100毫升容量瓶中，加入30毫升濃氨水，30毫升冷的蒸餾水及20毫升飽和氫氧化鈉溶液，混勻后，放置至使溶液溫度與室溫相同，以蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。此試劑在室溫下可以放置3-4個(gè)月不影響顯色。3.4.2．試劑1113.4.3．操作步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備每組取7支試管，依次加入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分別補(bǔ)足蒸餾水至3毫升，混勻后各管加2毫升堿性銅試劑，充分混和后，呈現(xiàn)紫色，立即于540nm下測(cè)定光吸收（以第一管作空白對(duì)照）。(2)供試品測(cè)定取3毫升樣品溶液，加入堿性銅試劑2毫升，充分混勻后，于540nm下測(cè)定吸收值，操作條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3.4.3．操作步驟1123.4.4.注意事項(xiàng)樣品溶液與試劑混合后，有時(shí)約30分鐘后有霧狀沉淀

產(chǎn)生。這種現(xiàn)象對(duì)含脂肪類(lèi)物質(zhì)的蛋白質(zhì)抽提液較易發(fā)生，而對(duì)于純蛋白質(zhì)溶液不明顯。克服的方法有三種：（1）加入試劑后立即比色，至少應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成；（2）如沉淀已經(jīng)產(chǎn)生，則可以放置二小時(shí)或更多時(shí)間，離心去沉淀后取上清液比色；（3）加1.5毫升乙醇或石油醚，離心后比色。

3.4.4.注意事項(xiàng)1133.5紫外吸收法原理蛋白質(zhì)分子中所含有的酪氨酸和色氨酸殘基使蛋白質(zhì)在280nm下具有最大吸收值；蛋白質(zhì)溶液在238nm下的光吸收值，其吸收強(qiáng)度與肽鍵量成正比。利用在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。3.5紫外吸收法114

4.電泳分析法

4.1電泳的基本概念4.2電泳的分類(lèi)4.3醋酸纖維膜電泳法4.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

1154.1電泳的基本概念電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱(chēng)為電泳。4.1電泳的基本概念1164.2.電泳的分類(lèi)按分離原理分類(lèi)可分為區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳和聚焦電泳4種。（1）區(qū)帶電泳電泳過(guò)程中，不同的離子成分在均一的緩沖液體系中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。（2）移界電泳是在U形管中進(jìn)行的，由于分離效果較差，已為其他電泳技術(shù)所取代。高春生化藥物常用分析方法課件117（3）等速電泳需專(zhuān)用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相隨分成清晰的界面，并以等速移動(dòng)。（4）等電聚焦電泳由于具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)中，自動(dòng)形成pH梯度，使被分離物移動(dòng)至各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶，且分辨率較高。從表面上看與區(qū)帶電泳相似，但原理不同。（3）等速電泳需專(zhuān)用電泳儀，當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各區(qū)帶相1184.3.醋酸纖維膜電泳法4.3.1基本概念什么是醋酸纖維膜電泳以醋酸纖維膜為支持介質(zhì)的一種區(qū)帶電泳技術(shù)。4.3.2原理蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，具有兩性游離特性。人血白蛋白為一種蛋白質(zhì)，因而其具有兩性化合物的性質(zhì)，在堿性緩沖液中，即pH質(zhì)大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極遷移，如果人血白蛋白中含有其他雜蛋白，其帶電荷的量會(huì)不同于人血白蛋白，在電場(chǎng)中遷移的速度就不同，帶負(fù)電荷越多的蛋白質(zhì)其遷移速度越快。這樣就會(huì)在醋酸纖維薄膜留下不同的區(qū)帶，經(jīng)染色后，脫色，掃描后，即可測(cè)得人血白蛋白的純度。4.3.醋酸纖維膜電泳法1194.3.3特點(diǎn)：微量，快速，簡(jiǎn)便，分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾及吸附現(xiàn)象等。目前，國(guó)內(nèi)有醋酸纖維薄膜商品出售，不同廠家生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜主要在乙酰化、厚度、孔徑、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等方面有所不同，但分離效果基本一致，一般多采用浙江黃巖化工廠生產(chǎn)的醋酸纖維薄膜。4.3.3特點(diǎn)：微量，快速，簡(jiǎn)便，分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾1204.3.4酸纖維薄膜與濾紙比較酸纖維薄膜與濾紙比較有以下優(yōu)點(diǎn)（1）

酸纖維薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸收極少，無(wú)“拖尾”現(xiàn)象，染色后背景能完全脫色，各種蛋白質(zhì)染色帶分離清晰，因而提高了定量的精確性。（2）

快速省時(shí),由于醋酸纖維薄膜親水性較濾紙小，薄膜中所容納的緩沖液也較小，電滲作用小，電泳時(shí)大部分電流是由樣品傳導(dǎo)的，所以分離速度快，電泳時(shí)間短，一般電泳45-60分鐘即可，加上染色，脫色，整個(gè)電泳完成僅需90分鐘左右。4.3.4酸纖維薄膜與濾紙比較121（3）

靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μl血清，甚至加樣體積少至0.1μl，臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)利用這一特點(diǎn)，檢測(cè)在病理情況下微量異常蛋白的改變。（4）應(yīng)用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離，如，胎兒甲種球蛋白，溶菌酶，胰島素，組蛋白等用醋酸纖維薄膜電泳能較好地分離。（5）

醋酸纖維薄膜電泳染色后，經(jīng)冰醋酸，乙醇混合或其他溶液浸泡后制成干板，有利于掃描定量及長(zhǎng)期保存。（3）靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需2μl血清，甚122由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡(jiǎn)單，快速，價(jià)廉。目前已廣泛用于分析檢測(cè)血漿蛋白，脂蛋白，糖蛋白，胎兒甲種球蛋白，體液，脊髓液，脫氫酶，多肽，核酸及其他生物大分子，為心血管疾病，肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據(jù)，因而已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗(yàn)的常規(guī)技術(shù)。由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡(jiǎn)單，快速，價(jià)廉。目前已廣泛用1234.3.5酸纖維薄膜電泳操作步驟

儀器與薄膜的準(zhǔn)備

點(diǎn)樣

電泳

染色與漂洗

透明返回4.3.5酸纖維薄膜電泳操作步驟1244.3.6注意事項(xiàng)1、醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理2、緩沖液的選擇3、加樣量4、電量的選擇5、染色液的選擇6、透明及保存4.3.6注意事項(xiàng)1254.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳4.4.1

原理以紙，醋酸纖維素薄膜，瓊脂（糖）及均一聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷，分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可采用聚丙烯酰胺濃度剃度電泳，利用它所形成孔徑不同引起的分子篩效應(yīng)，可將蛋白質(zhì)分子分開(kāi)。也可在整個(gè)電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（SDS），則電泳遷移率主要依賴(lài)于分子量，而與所帶凈電荷和形狀無(wú)關(guān)。這種電泳方法為SDS。4.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1264.4.2

用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理SDS是陰離子去污劑，它在水溶液中，以單體和分子團(tuán)混合物的形式存在，蛋白質(zhì)在巰基乙醇作用下，還原成單鏈，再進(jìn)一步與SDS結(jié)合形成帶大量負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所4.4.2

用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理127帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開(kāi)。測(cè)定未知蛋白質(zhì)分子量時(shí)，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，同時(shí)進(jìn)行SDS，則可根據(jù)已知蛋白質(zhì)的電泳遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得分子量。帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了天然蛋白質(zhì)原由的負(fù)電荷，因而消除和128優(yōu)點(diǎn)用此法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，樣品用量少，耗時(shí)少（僅需一天），分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點(diǎn)，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來(lái)，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序，酶解圖譜及抗還原性質(zhì)等方面的研究。`優(yōu)點(diǎn)用此法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，樣129缺點(diǎn)在蛋白質(zhì)所帶電荷異?；驑?gòu)象異常時(shí)，帶有較大輔基的蛋白（如糖蛋白）及一些結(jié)構(gòu)蛋白等測(cè)出的分子量不太可靠。如組蛋白F1，本身帶有大量的正電荷，雖然結(jié)合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原由正電荷，故用SDS測(cè)得的分子量為35000，而用其他方法測(cè)定的分子量為21000。因此要確定某種蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，最好用2種測(cè)定方法相互驗(yàn)證，則更可靠。尤其是對(duì)一些由亞基或2條以上肽鏈組成的蛋白質(zhì)，由于缺點(diǎn)在蛋白質(zhì)所帶電荷異?；驑?gòu)象異常時(shí)，帶有較大輔基的蛋白130SDS巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開(kāi)，解理成亞基或單個(gè)肽鏈，因此測(cè)定結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量，還需用其他方法測(cè)定其分子量中肽鏈的數(shù)目。SDS巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開(kāi)，解理成亞1314.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟安裝夾心式垂直板電泳槽配膠及凝膠板的制備分離膠和濃縮膠的制備樣品的處理與加樣

電泳返回4.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳操作步驟安裝1324.4.4注意事項(xiàng)1.SDS的純度2.SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合量3.凝膠濃度4.對(duì)樣品的要求5.凝膠成像4.4.4注意事項(xiàng)1335.酶的測(cè)定5.1酶的概念：5.2酶的特點(diǎn)：5.3酶的專(zhuān)一性：5.4酶的分類(lèi)與命名5.5酶的化學(xué)組成5.6酶促反應(yīng)的影響因素5.7酶活力的測(cè)定方法5.酶的測(cè)定5.1酶的概念：1345.1酶的概念

酶是生物體內(nèi)一類(lèi)具有催化活性和特定空間構(gòu)象的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。5.1酶的概念1355.2酶的特點(diǎn)5.2.1酶作用一般都要求比較溫和的條件，如常溫，常壓，接近中性的酸堿度等。5.2.2酶的催化效應(yīng)非常高酶促反應(yīng)比相應(yīng)的非酶促反應(yīng)要快103～1017倍。5.2.3酶具有高度的專(zhuān)一性酶對(duì)所作用的物質(zhì)（稱(chēng)為底物）有嚴(yán)格的選擇性，5.2酶的特點(diǎn)136通常一種酶只能作用于某一類(lèi)或某一種特定的物質(zhì)，這也說(shuō)明酶對(duì)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有高度嚴(yán)格要求。5.2.4酶的催化活性是受到調(diào)節(jié)和控制的。他的調(diào)控方式很多，包括反饋調(diào)節(jié)、抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、酶原激活及激素控制等。5.2.5酶可催化某些特異的化學(xué)反應(yīng)，體內(nèi)某些物質(zhì)的合成只能由酶促反應(yīng)完成。如某些蛋白質(zhì)、多肽、核酸以及其他一些生物活性物質(zhì)的合成都要通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行。通常一種酶只能作用于某一類(lèi)或某一種特定的物質(zhì)，這也說(shuō)明酶對(duì)底1375.3酶作用的專(zhuān)一性一種酶只作用于一類(lèi)化合物或一定的化學(xué)鍵，以促進(jìn)一定的化學(xué)變化，生成一定的產(chǎn)物。受酶催化的化合物稱(chēng)為該酶的底物或作用物。酶對(duì)底物的專(zhuān)一性通常分為以下幾種。5.3.1

立體化學(xué)專(zhuān)一性是從底物的立體化學(xué)性質(zhì)來(lái)考慮的一種專(zhuān)一性?？煞譃閮深?lèi)（1）立體異構(gòu)專(zhuān)一性（2）幾何異構(gòu)專(zhuān)一性。5.3酶作用的專(zhuān)一性1385.3.2

非立體異構(gòu)專(zhuān)一性如果一種酶不具有立體化學(xué)專(zhuān)一性，則可從底物的化學(xué)鍵及組成該鍵的基團(tuán)來(lái)考慮其專(zhuān)一性。如以A-B為底物，可認(rèn)為它是由三部分組成，即A、B與連接它們的鍵。非立體化學(xué)專(zhuān)一性可依據(jù)酶對(duì)這三種組成部分選擇程度的不同分為三類(lèi)（1）鍵專(zhuān)一性（2）基團(tuán)專(zhuān)一性（3）絕對(duì)專(zhuān)一性。5.3.2

非立體異構(gòu)專(zhuān)一性如果一種酶不具有立體化學(xué)專(zhuān)1395.4酶的分類(lèi)與命名5.4.1酶的分類(lèi)依據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定，按催化反應(yīng)的類(lèi)型可分為六大類(lèi)。（1）氧化還原酶類(lèi)催化氧化還原反應(yīng)。（2）轉(zhuǎn)移酶類(lèi)催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。（3）水解酶類(lèi)催化水解的反應(yīng)（4）裂合酶類(lèi)催化水、氨或二氧化碳的去除或加入。（5）異構(gòu)酶類(lèi)催化各種類(lèi)型的異構(gòu)作用。（6）合成酶類(lèi)催化消耗ATP的成鍵反應(yīng)

5.4酶的分類(lèi)與命名1405.5酶的化學(xué)組成酶和其他蛋白質(zhì)一樣，根據(jù)其組成成分可分為簡(jiǎn)單蛋白酶和結(jié)合蛋白酶兩種。單純酶酶的活性?xún)H僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如水解酶類(lèi)（淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶及尿酶等），這些酶的結(jié)構(gòu)由簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)構(gòu)成，故稱(chēng)為單純酶。5.5酶的化學(xué)組成141結(jié)合酶其結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子外，還含有非蛋白質(zhì)部分，如大多數(shù)氧化還原酶類(lèi)，這些酶由結(jié)合蛋白質(zhì)構(gòu)成，因而稱(chēng)為結(jié)合酶。在結(jié)合酶中，蛋白質(zhì)部分稱(chēng)為酶蛋白，非蛋白質(zhì)部分統(tǒng)稱(chēng)為輔因子。輔因子又可分成輔酶和輔基兩類(lèi)。酶蛋白與輔因子結(jié)合成的完整分子成為全酶，即全酶=酶蛋白+輔因子（輔酶或輔基）。只有全酶才有催化活性，將酶蛋白與輔因子分開(kāi)后均無(wú)催化作用。結(jié)合酶其結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子外，還含有非蛋白質(zhì)部分，如大多數(shù)142根據(jù)蛋白的特點(diǎn)和分子大小又把酶分成三類(lèi)（1）單體酶只有一條多肽鏈（2）

寡聚酶由幾條至幾十條多肽鏈亞基組成。（3）

多酶體系是由幾種酶彼此嵌合形成的復(fù)合體。他有利于一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。根據(jù)蛋白的特點(diǎn)和分子大小又把酶分成三類(lèi)1435.6酶促反應(yīng)的影響因素5.6.1底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響

5.6.2pH的影響與最適pH5.6.3溫度的影響與最適溫度5.6.4酶濃度的影響5.6.5激活劑的影響5.6.6抑制劑的影響5.6.7酶活力的測(cè)定方法5.6酶促反應(yīng)的影響因素1445.6.1底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響

酶促反應(yīng)中，酶先與底物形成中間復(fù)合物，再轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，并重新釋放出游離的酶。在酶濃度恒定的條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛群苄r(shí)，酶未被底物飽和，這時(shí)反應(yīng)速度取決于底物的濃度，底物濃度越大，單位時(shí)間內(nèi)ES生成的越多，而反應(yīng)速度取決于ES的濃度，故反應(yīng)速度也隨之增高。當(dāng)?shù)孜餄舛燃哟蠛?，酶逐漸被底物所飽和，反應(yīng)速度的增加和底物的濃度就不成正比，續(xù)而底物增加至極大值，所有酶分子均被底物飽和，所有的E均轉(zhuǎn)變成ES，此時(shí)的反應(yīng)速度不會(huì)進(jìn)一步增高。5.6.1底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速度的影響1455.6.2

pH的影響與最適pH大多數(shù)酶的活性受pH影響較大。在一定pH下酶表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pH，活力均降低。酶表現(xiàn)最大活力時(shí)的pH稱(chēng)為酶的最適pH。PH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響，主要有下列原因（1）

影響酶和底物的解離酶的活性基團(tuán)的解離受pH的影響，有的酶必須處于解離狀態(tài)方能很好的與底物結(jié)合，在這種情況下，酶和底物解離最大的pH有利于酶促反應(yīng)的加速。(2）

影響酶分子的構(gòu)象過(guò)高過(guò)低的pH會(huì)改變酶的活性中心的構(gòu)象，甚至?xí)淖冋麄€(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)使其變性。5.6.2pH的影響與最適pH1465.6.3溫度的影響與最適溫度化學(xué)反應(yīng)速度隨溫度的增高而加快，但酶是蛋白質(zhì)，可隨溫度的升高而變性。5.6.4酶濃度的影響在一定條件下，酶的濃度與反應(yīng)初速度成正比。因?yàn)槊复呋磻?yīng)時(shí)，酶先要與底物形成中間物，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^(guò)酶濃度時(shí)，反應(yīng)達(dá)到最大速度，這時(shí)增加酶濃度可增加反應(yīng)速度，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系。這也是酶活力測(cè)定常用的方法。5.6.3溫度的影響與最適溫度1475.7酶活力的測(cè)定方法