利福霉素分離提取生產(chǎn)工藝課件

利福霉素分離提取生產(chǎn)工藝高虹婧董是言生物物質(zhì)的分離（Bioseparation）是生物工程的一個(gè)重要部分。國(guó)外文獻(xiàn)中，常稱(chēng)之為下游過(guò)程（DownstreamProcess），國(guó)內(nèi)則稱(chēng)之為產(chǎn)品的分離或回收。目的：把生物反應(yīng)液，如發(fā)酵液或酶反應(yīng)液內(nèi)的有用物質(zhì)分離出來(lái)，獲得所需的目標(biāo)產(chǎn)品。下游加工過(guò)程的工藝過(guò)程決定于產(chǎn)品性質(zhì)和要求達(dá)到的純度。微生物藥物由于沒(méi)有適當(dāng)?shù)奶崛》椒ɑ蛞蛱崛∈章侍?，成本過(guò)高而不能投產(chǎn)的情況是很多的。下游加工特點(diǎn)：難度大微生物的發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)，含有菌絲、未用完的培養(yǎng)基、生產(chǎn)菌的其它代謝產(chǎn)物，還有的是在發(fā)酵液預(yù)處理過(guò)程中加入的物質(zhì)（如草酸、硫酸鋅、黃血鹽等）。其中生物活性物質(zhì)的濃度通常很低，而雜質(zhì)含量卻很高，而且某些雜質(zhì)與生物活性物質(zhì)具有非常相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。此外，生物活性物質(zhì)通常很不穩(wěn)定，遇熱或某些化學(xué)試劑會(huì)引起失活或分解，某些產(chǎn)品還要求無(wú)菌操作。收率低發(fā)酵液體積大，生物活性物質(zhì)濃度低，最后成品要求達(dá)到的純度又高，因此常常需要好幾步操作（假如包含6步操作，每步收率可達(dá)90%，總收率也只有53%），在操作中減少精制步驟是非常重要的。具有一定靈活性（不確定性）因發(fā)酵是分批操作，與化學(xué)合成相比，具有生物變異性大，各批發(fā)酵液不盡相同的特點(diǎn)。特別是對(duì)染菌的批號(hào)也要能處理。下游加工過(guò)程可分為3個(gè)階段：發(fā)酵液預(yù)處理和固—液分離；初步純化（提?。?；高度純化（精制）。發(fā)酵液→預(yù)處理→初步純化→高度純化→成品利福霉素（Rifamycins）：是1957年從地中海鏈霉菌(Streptomyces

mediterranoi)的代謝產(chǎn)物中分離提取的復(fù)合物利福霉素B，繼而又分離出A，B，C，D，E等。1962年，利福霉素B經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化為利福霉素SV，并被最先用于臨床。由于其口服吸收不佳，故從3-甲酰利福霉素SV的多個(gè)衍生物中又篩選得到甲哌利福霉素，即利福平。該品可口服給藥，而且療效好，但易使菌株產(chǎn)生耐藥性，有效時(shí)間短，對(duì)艾滋病并發(fā)癥中的鳥(niǎo)復(fù)合分枝桿菌(MAC)感染活性較低，毒性較大。利福霉素類(lèi)藥物有：利福霉素B二乙酰胺、利福平等。目前在臨床應(yīng)用的有利福平、利福噴汀及利福布汀。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染而引起的慢性傳染病，對(duì)人類(lèi)的危害有數(shù)千年歷史，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。目前，化學(xué)藥物治療是人類(lèi)控制結(jié)核病的主要手段。1944年，鏈霉素、對(duì)氨基水楊酸等成為第一代首選抗結(jié)核藥。自20世紀(jì)60年代利福平和乙胺丁醇成為首選抗結(jié)核藥物以來(lái)，利福霉素類(lèi)衍生物便在抗結(jié)核藥物中占據(jù)了重要地位，為結(jié)核病的治療做出了巨大貢獻(xiàn)。利福霉素的作用機(jī)制主要有2方面：一方面通過(guò)與細(xì)菌的DNA依賴(lài)性RNA聚合酶(DDRP)的β-亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌RNA合成的起始階段，阻礙mRNA的合成。從DNA合成RNA是細(xì)菌遺傳轉(zhuǎn)錄的第一階段，RNA聚合酶通過(guò)鍵合在一段DNA束的特定序列上催化轉(zhuǎn)錄過(guò)程。另一方面，因?yàn)樗欣Ｃ顾匮苌锒季哂邢嗤哪负耍源蠖鄶?shù)該類(lèi)化合物都能抑制DNA轉(zhuǎn)錄RNA，其表現(xiàn)出的抗菌活性差異主要是因?yàn)楦餮苌锿高^(guò)細(xì)胞壁的能力不同所致。例如：利福霉素B對(duì)分離的DNA聚合酶有良好的抑制作用，但因?yàn)槠洳荒芡高^(guò)細(xì)胞壁，所以實(shí)際上抗菌活性較弱。利福霉素B的分離提取利福霉素S鈉鹽的分離提取利福霉素O的分離提取利福霉素B是利福霉素發(fā)酵產(chǎn)品中的主要產(chǎn)物，也是多種利福霉素類(lèi)衍生物的重要合成原料。目前國(guó)內(nèi)利福霉素SV的發(fā)酵水平約為7000μg/ml，發(fā)酵生產(chǎn)利福霉素B的效價(jià)可達(dá)到20000μg/ml。分離提取具體方法和流程利福霉素B的分離提取——萃取法提取流程：放罐后的發(fā)酵液先加入ZnSO4溶液進(jìn)行絮凝處理，過(guò)濾。濾液中加入萃取劑乙酸丁酯，攪拌下逐漸加入稀硫酸調(diào)節(jié)濾液pH值至終點(diǎn)為2.0~2.5，停止加酸，充分?jǐn)嚢?，靜置分層，萃取。用pH7.5~8.0緩沖液進(jìn)行三級(jí)錯(cuò)流反萃，加入萃取劑乙酸乙酯，攪拌下逐漸加入稀硫酸調(diào)節(jié)濾液pH值至終點(diǎn)為2.0~2.5，停止加酸，充分?jǐn)嚢瑁o置分層，第二次萃取，濃縮，結(jié)晶，得到產(chǎn)物。不同pH萃取相對(duì)利福霉素B提取的影響由于利福霉素B為弱酸性，當(dāng)利福霉素B以酸形式（RCOOH）存在時(shí)，極性較低，易進(jìn)入有機(jī)相中；以鹽形式(RCOO-)存在時(shí)，極性較強(qiáng)，易進(jìn)入水相。pH值2.0~3.0范圍內(nèi)，利福霉素B的分配比較高；但當(dāng)pH大于3.0時(shí)，分配比迅速下降。萃取時(shí)水相的酸性不宜過(guò)強(qiáng)，因?yàn)槔Ｃ顾卦趶?qiáng)酸的水溶液中易降解，所以萃取時(shí)適宜的pH范圍為2.0~3.0。相同pH值萃取，乙酸丁酯比乙酸乙酯對(duì)利福霉素B有更大的分配比。不同溫度對(duì)利福霉素B提取的影響兩種溶劑作為萃取劑進(jìn)行利福霉素B的萃取過(guò)程均為吸熱過(guò)程，隨著萃取溫度的上升，分配比也增加，有利于萃取的進(jìn)行；在相同溫度下，乙酸丁酯的分配比高于乙酸乙酯?？股卦跍囟容^高時(shí)一般都不穩(wěn)定，因?yàn)闇囟雀呤箍股胤纸獾乃俣燃涌欤世Ｃ顾谺的萃取應(yīng)維持在室溫或較低溫度下進(jìn)行，可以通過(guò)調(diào)整pH值，來(lái)保證較高的分配比和萃取收率。溫度分配比利福霉素B濃度對(duì)萃取分配比的影響隨著濃度降低，分配比D逐漸變大，提示低濃度有利于萃取收率的提高。另外，利福霉素B在萃取相中的飽和溶解度不是很大，屬于微溶的范圍，這也決定了利福霉素B萃取時(shí)有機(jī)相用量不能太少，否則將有較多利福霉素B留在水相中，萃取不完全。利福霉素B萃取選擇性利福霉素B在乙酸乙酯中的選擇性略高于乙酸丁酯，但乙酸丁酯的分配比大于乙酸乙酯，揮發(fā)性小于乙酸乙酯，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，選擇乙酸丁酯作為從發(fā)酵液中萃取利福霉素的萃取劑，可以得到較高萃取收率；同時(shí)，利福霉素B在乙酸丁酯中飽和溶解度大于乙酸乙酯中的飽和溶解度，以乙酸丁酯為萃取劑時(shí)，用量較少，有利于減少溶劑損失。在從反萃緩沖液中二次萃取過(guò)程時(shí)，應(yīng)選擇乙酸乙酯作為萃取劑，以獲得更高的選擇性，提高分離效率。利福霉素S鈉鹽的分離提取——大孔吸附樹(shù)脂法利福霉素S鈉鹽的提取，多數(shù)廠家采用溶媒法,基本工藝流程是:上述工藝溶媒耗量大,操作繁瑣,周期較長(zhǎng),勞動(dòng)強(qiáng)度也大,如發(fā)酵液染菌,還會(huì)因過(guò)濾困難造成報(bào)廢。據(jù)知,四川抗菌素工業(yè)研究所曾采用離子交換樹(shù)脂法進(jìn)行分離，而現(xiàn)在開(kāi)始采用的是大孔吸附樹(shù)脂法提取利福霉素S鈉鹽的新工藝,工藝流程如下:大孔吸附樹(shù)脂吸附時(shí)間對(duì)吸附量的影響結(jié)論：可見(jiàn)吸附量隨時(shí)間延長(zhǎng)而提高,但考慮到吸附速度和經(jīng)濟(jì)效益,時(shí)間以4~6h為宜。SIP一140大孔吸附樹(shù)脂吸附時(shí)間對(duì)吸附量的影響樹(shù)脂用量對(duì)吸附量及吸附率的影響SIP一140大孔吸附樹(shù)脂樹(shù)脂用量對(duì)吸附量及吸附率的影響結(jié)論：可見(jiàn)樹(shù)脂用量比宜在1:10左右,此時(shí)吸附率可達(dá)85%以上。試驗(yàn)證明,若濾液以1:10的樹(shù)脂用量比靜態(tài)吸附,其吸附率可高達(dá)96%。如樹(shù)脂用量小,樹(shù)脂飽和度雖較高,但吸附收率則下降,此時(shí)可采用動(dòng)態(tài)串聯(lián)吸附法,提高吸附收率。樹(shù)脂反復(fù)使用次數(shù)對(duì)吸附量的影響樹(shù)脂使用次數(shù)與吸附量的關(guān)系結(jié)論：由表可見(jiàn),樹(shù)脂反復(fù)使用4次,其吸附量不僅不受影響,還有上升趨勢(shì)、表明樹(shù)脂在再生處理時(shí)可清除樹(shù)脂孔隙內(nèi)殘存的低聚物而使樹(shù)脂吸附量略有提高,但處理不當(dāng),可影響下次吸附,如表中的第3次吸附的情況。小結(jié)大孔吸附樹(shù)脂法工藝簡(jiǎn)便可行,可節(jié)約溶媒,改善勞動(dòng)條件,降低成本。特殊情況下，本法可不經(jīng)過(guò)濾回收部分產(chǎn)品。如省去過(guò)濾工序,則發(fā)酵液的吸附損失將會(huì)大些,樹(shù)脂用量也較大。一般情況下,對(duì)濾液采用動(dòng)態(tài)方式吸附較好。利福霉素O的分離提取利福霉素B發(fā)酵液過(guò)濾,上清液維持在10一25℃,在PH7.0加入氧化劑(亞硝酸鈉、過(guò)硫酸鈉或過(guò)氧化氫),并在PH4.0一7.5慢慢攪拌4一5小時(shí)，使利福霉素B轉(zhuǎn)化為利福霉素O，沉淀析出,得到利福霉素O的粗品,收率90%左右。參考書(shū)籍參考文獻(xiàn)[1]王欣瑜，張靜霞，曹勝華，利福霉素類(lèi)衍生物的研究進(jìn)展[A]，1001-8751(2008)06-0255-07.[2]