人參總皂苷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元樣細(xì)胞分化

PAGEPAGE7人參總皂苷對(duì)PC12細(xì)胞分化的影響李晗宇1,2王順和1,2鄭娟1,2姜蓉2（1.重慶醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室；2.重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程研究室;重慶400016）【摘要】目的研究人參總皂苷(TotalsaponinofPanaxginseng,TSPG)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元性分化的作用。方法：體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，觀察PC12細(xì)胞在人參總皂苷的影響下細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變。誘導(dǎo)48h后透射電鏡觀察突觸連接形成情況，72h后利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，觀察人參總皂苷作用后PC12細(xì)胞向MAP-2陽性細(xì)胞分化的情況。結(jié)果：eq\o\ac(○,1)與對(duì)照組比較，人參總皂苷誘導(dǎo)后的PC12細(xì)胞其突起和細(xì)胞直徑明顯增長和增大（P＜0.01）。eq\o\ac(○,2)人參總皂苷能促進(jìn)PC12細(xì)胞形成突觸連接。eq\o\ac(○,3)人參總皂苷組MAP2陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）結(jié)論：人參總皂苷具有誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元性分化的作用?！娟P(guān)鍵詞】人參總皂苷；PC12細(xì)胞；分化【中圖分類號(hào)】R736.6DifferentiationofPC12cellsinducedbyTotalsaponinofPanaxginsengLiHanyu1,2,WangShunhe1,2,ZhengJuan1,2,JiangRong2(1.Departmentofpathology;2.Stellcellandorganizationprojectlaboratory,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400016,China)Abstract:ObjectivTostudythepotentialabilityofTSPG(TotalsaponinofPanaxginseng)toinducetheneuronaldiffenentiationofPC12cells.MethodsculturedPC12cellinvitro,observedthemorphologicalchangesofPC12cellsundertheTSPG..ThesynapticlinkagewereobservedbytransmittingelectronicmicroscopeafterthePC12cellswereexposedtoTSPGfor48handtheexpressionofMAP-2wasdetectedbyimmunocytochemistryafter72h.Results:eq\o\ac(○,1)ThelengthofneuriteandmaxdiameterofPC12cellsinTSPGgroupwereobviouslylongerandbiggerthanthoseincontrolgroup（P＜0.01）.eq\o\ac(○,2)TSPGcaninducePC12cellsformsthesynapticlinkage.eq\o\ac(○,3)ThenumberofMAP-2positivecellswassignificantlyincreasedinTSPGgroupcompparedwithcontrolgroup(P＜0.01).ConclusionTSPGcouldinducetheneuronaldifferentiationofPC12cells.Keywords:TotalsaponinofPanaxginseng;PC12cells;differentiationCorrespondingauthor:WangShunhe,Tel:(023)68485789,E-mail:wangshunhe120@人參（Panaxginseng）是我國傳統(tǒng)醫(yī)食兩用之珍品，而人參總皂苷（TotalsaponinofPanaxginseng，TSPG）是人參的主要藥理活性成分【1】，有著廣泛的藥理作用，能穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞膜、保護(hù)突觸結(jié)構(gòu)、增加突觸數(shù)目，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的影響及抑制神經(jīng)毒性作用等[2]。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系（pheochromocytomacells,PC12）起源于神經(jīng)嵴，是目前廣泛用來研究神經(jīng)細(xì)胞功能、分化和凋亡的一種組織細(xì)胞培養(yǎng)模型。它可在神經(jīng)生長因子（NGF）誘導(dǎo)下，通過激活酪氨酸激酶相關(guān)的受體TrkA完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)【3，4】，抑制PC12細(xì)胞增殖，促進(jìn)其分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)用人參總皂苷誘導(dǎo)處理PC12細(xì)胞,觀察其對(duì)PC12細(xì)胞分化能力的影響，從而為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。1材料與方法藥物與試劑人參總皂苷（購自吉林宏久生物有限公司）由重慶醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞研究室王亞平教授惠贈(zèng)，純度98％。實(shí)驗(yàn)前用DMEM培養(yǎng)液配置成2.5mg/ml濃度，正壓過濾除菌，4℃?zhèn)溆?。PC12細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；DMEM購自GIBCO公司，胎牛血清購自四季青,MAP-2單克隆抗體購自北京中衫生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。PC12細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液（含10％胎牛血清，100U·ml-1青霉素，100g·L-1鏈霉素，200mg·L-1谷氨酰胺），37℃，5％CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層細(xì)胞生長至80％匯合后傳代培養(yǎng)。1.3人參總皂苷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察將PC12細(xì)胞按3×104/ml接種于24孔板中，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和10mg/LTSPG處理組，每組5個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。光鏡下各組隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)突起細(xì)胞（突起長度超過胞體直徑的一倍）的百分比。利用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)量兩組分化細(xì)胞的細(xì)胞直徑和突起長度。1.4分化的PC12細(xì)胞電鏡觀察將TSPG作用48h的細(xì)胞離心收集后，2.5％戊二醛4℃固定4h,，PBS緩沖液漂洗，1％鋨酸固定2h，PBS緩沖液漂洗，梯度酒精、梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋液浸透，包埋，36-60℃聚合，修塊，超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重電子染色后，透射電鏡觀察。1.5免疫細(xì)胞化學(xué)染色培養(yǎng)至第3天，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定20min后，PBS浸洗5min×3次，加入封閉用山羊血清，37℃孵育10min,甩去血清，加入一抗工作液（抗MAP-2單克隆抗體，1：100），4℃孵育過夜，PBS浸洗5min×3次，加入生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30min,PBS浸洗5min×3次，加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS浸洗5min×3次。DAB顯色，蘇木素核復(fù)染。封片。實(shí)驗(yàn)中設(shè)不加一抗的空白對(duì)照組。免疫組織化學(xué)染色結(jié)束后，計(jì)數(shù)每張切片5個(gè)高倍視野的陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率1.6統(tǒng)計(jì)分析：采用SPASS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果2.1人參總皂苷對(duì)PC12細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用光鏡下，未經(jīng)處理的PC12細(xì)胞胞體較小，呈圓形或三角形，相差顯微鏡下折光性較強(qiáng)，有的細(xì)胞兩極有短小突起。經(jīng)人參總皂苷作用數(shù)十小時(shí),少數(shù)PC12細(xì)胞胞體開始變形，呈梭形、三角形或多角形。24h后，鏡下觀察可見部分細(xì)胞長出類似神經(jīng)元的突起，胞體折光性較高，48h后，鏡下折光性降低，胞體變大，不少細(xì)胞胞體呈梭形、三角形或多角形。有突起的細(xì)胞數(shù)增多且突起較前增長。培養(yǎng)至72h,細(xì)胞胞體更大，突起更長，胞體折光性明顯降低，大多數(shù)細(xì)胞已長出長突起，突起之間相互連接交織成網(wǎng)。(圖.a，b;表1)各組隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)PC12細(xì)胞分化率，采用方差分析比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞分化率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。（表2）。電鏡下，經(jīng)TSPG作用后的PC12細(xì)胞可見細(xì)胞間有突觸連接形成，而對(duì)照組卻未見突觸連接。（圖c,d）表1各組培養(yǎng)72h的PC12細(xì)胞突起長度和最大直徑的比較(n=30x±s)組別濃度（mg/L）突起長度（um）細(xì)胞最大直經(jīng)(um)對(duì)照組TSPG組010mg/L13.95±2.5930.33±3.82*8.25±1.8214.33±2.84*注：與對(duì)照組比較*P＜0.01人參總皂苷對(duì)PC12細(xì)胞MAP-2表達(dá)的影響誘導(dǎo)至72h，進(jìn)行抗MAP-2單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)人參總皂苷處理后的PC12細(xì)胞出現(xiàn)MAP-2標(biāo)記陽性的分化細(xì)胞比單純用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的PC12細(xì)胞表達(dá)增多.(表2,圖e,f)表2TSPG對(duì)PC12細(xì)胞分化及MAP2表達(dá)的影響組別濃度（mg/L）視野數(shù)細(xì)胞分化率（％）MAP2陽性率對(duì)照組059.5687±1.99134.8056±1.2418TSPG組10mg/L522.9447±1.5058*11.9798±2.0713*ccCccCbafed圖a,b分別為培養(yǎng)72h的對(duì)照組細(xì)胞和10mg/L的TSPG組細(xì)胞（光鏡×100）；圖c,d分別為10mg/LTSPG組細(xì)胞（箭頭所示為形成的突觸連接，電鏡×50000)及對(duì)照組細(xì)胞（電鏡fed3討論人參總皂苷（totalsaponinofpanaxginseng，TSPG）是傳統(tǒng)中藥人參的主要有效成分。人參作為中醫(yī)傳統(tǒng)“補(bǔ)氣生血”的藥物，在機(jī)體有著廣泛的藥理作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TSPG能促進(jìn)腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞膜，保護(hù)突觸結(jié)構(gòu)，增加突觸數(shù)目，抑制神經(jīng)毒及抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用。因此，我們推測(cè)，TSPG對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)元性分化可能也存在促進(jìn)作用。目前已有很多研究方法在體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，這種分化使其在形態(tài)、生理、生化及功能方面更接近于神經(jīng)元，是在分子水平上研究神經(jīng)元分化的很好模型【5】。然而，在分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化等環(huán)節(jié)中，方法不統(tǒng)一。體外誘導(dǎo)PC12細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的最終目的在于應(yīng)用。有些誘導(dǎo)劑有一定毒性，不能用于人體內(nèi)。因此尋找有效而無害的誘導(dǎo)劑十分必要。中藥有著來源廣，價(jià)廉，副作用小等優(yōu)勢(shì)，對(duì)PC12細(xì)胞長期生長分化無毒且利于分化后細(xì)胞活體移植，已越來越受到重視。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道一些中藥如陳香木【6】（Lignaloes）、菟絲子（Cuscutachinensis）【7】等提取物具有與NGF相似的功能，對(duì)PC12細(xì)胞具有一定的營養(yǎng)作用，可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化。本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，觀察人參總皂苷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元性分化的作用。微管相關(guān)蛋白（MAP-2）是特異性分布于神經(jīng)元胞漿和突起中的細(xì)胞骨架蛋白，且在樹突中的含量多過胞體，可作為神經(jīng)元的標(biāo)志性蛋白，在神經(jīng)元的發(fā)育、分化、塑型方面以及神經(jīng)元極性獲得上發(fā)揮著重要的作用【8】。故實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抗MAP-2單克隆抗體，通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)分化的PC12細(xì)胞中MAP-2的表達(dá)，找到人參總皂苷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)元性分化的證據(jù)。實(shí)驗(yàn)用10mg/L的TSPG處理PC12細(xì)胞，在加入TSPG24h后，PC12細(xì)胞就長出類似神經(jīng)元的突起，48h后電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間形成的突觸連接，72h后細(xì)胞體積和突起長度都比對(duì)照組增大和增多。72h時(shí)對(duì)分化的細(xì)胞行抗MAP-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)MAP2陽性細(xì)胞數(shù)多于對(duì)照組（P＜0.01）.結(jié)果證明人參總皂苷可表現(xiàn)出類似NGF樣作用，促進(jìn)PC12細(xì)胞分化，且分化的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白(MAP-2)。以往的研究提示NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)過程，其中有諸多因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與【9】。而人參總皂苷促使PC12細(xì)胞神經(jīng)元性分化的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又如何呢？我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】【1】李泰平人參皂苷藥理活性的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2003，28（4）：1-3.【2】沈思鈺，于振華，傅曉東，等.人參皂苷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究現(xiàn)狀及分析[J].安微中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23（1）：62-64.【3】ChristianG.Ziegler,FlavieSicard,PeterLattke,StefanR,Bornstein,MonikaEhrhart-Bornstein,andAlexanderW.Krugetal.Dehydroepiandrosteroneinducesaneuroendocrinephenotypeinnervegrowthfactor-stimulatedchromaffinpheochromocytomaPC12cells[J].Endocrinology,Jan2008;149:320-328.【4】MarioR,EmanuelaB,JimCetal.Nervegrowthfactor(NGF)influencesdifferentiationandproliferationofmyogeniccellsinvitroviaTrkA[J].JDevelNeurosci,2000,18(8):869-85.【5】HuangCM,ShuiHA,WuYT,etal.ProteomicanalysisofproteinsinPC12cellsbeforandaftertreatmentwithnervegrowthfactor:increasedlevelsofa43-kDachromograninB-derivedfragmentduringneuronaldifferentiation[J].BrainResMolBrainRes,2005,92(122):181-192.【6】MohriT.ChibaK,YamazakiMetal.ActivationofPC12cellsbylipophiliccomponentsofPanaxginseng[J].Pla